巨噬细胞原代培养、传代、冻存、复苏
细胞的传代冻存复苏
贴壁生长细胞传代方法：
1. 吸光培养瓶中的培养液 2.加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准） 静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5. 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 7. 将后者放入培养箱中培养。
初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。 如细胞系的生存期有限 ，则称之为有限细胞系 （ Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞 系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选 的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。
2.台盼蓝法
活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占 细胞中的百分比表示细胞恬力
已淘汰
3. 四唑盐（MTT）比色法
四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝， 四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干 水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这 种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物， 溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值
向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于 某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使 同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。
无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。
目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清
细胞培养基础知识详解-细胞的复苏、传代和冻存
细胞培养基础知识详解细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导整理：江耀伦李美娣1 细胞复苏细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
1.1实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。
（3）在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
1.2 细胞复苏培养（1）根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。
（2）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
（3）约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。
（4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入生物安全柜内。
吸弃上清液，向离心管内加入1 mL培养液，吹打制成细胞悬液。
（5）将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。
1.3 初学者易犯错误（1）水浴锅未预热或者未预热到37℃。
（2）水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
（3）离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
（4）一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
1.4 细胞传代1.4.1 传代前准备（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
（2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。
（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
1.4.2 细胞传代（1）取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。
（2）从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
细胞培养的四个步骤
细胞培养的四个步骤细胞是组成生物体的基本单位，生物体由各种类型的细胞组成。
在显微镜下不同的细胞有不同的形态。
利用免疫荧光、流式荧光标记、免疫组化都能进行细胞观察。
培养细胞的最终目的：拿到细胞进行后续的下游实验WB、ELISA等蛋白检测DNA、RNA等分子检测凋亡、增殖、周期等功能检测原代细胞培养、冻存等细胞实验细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础，细胞养得好，实验没烦恼！原代细胞培养，细胞的传代，冻存、复苏，细胞污染的防与治，我们的经验都在这篇文章里！一、细胞培养相关设备和试剂1、细胞培养的相关设备生物安全柜的安全保护等级>超净工作台，当涉及到病毒，需要使用生物安全柜。
生物安全柜：对柜内外的安全保护超净工作台：对工作台内部的安全保护超净工作台/生物安全柜的工作流程：2、细胞培养用相关试剂①培养基作用：人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质，提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。
不完全培养基：直接购买或者配置的培养基。
完全培养基：不完全培养基+血清（提供营养物质）+双抗（保证无菌环境）+其他。
由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6～7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640、199等。
②血清血清的功能：生长、分化必须的物质：生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质、小分子营养物转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等；促进细胞贴壁、铺展；毒素灭活，蛋白质与有毒金属和热源物质结合；提供蛋白酶抑制剂；起酸碱度缓冲液作用。
血清的分类最常用的是胎牛血清。
胎牛还未接触外界，免疫系统激活最少，血清中所含的抗体、补体等对外来物质排斥最小，对细胞有害的成分最少。
③胰酶常用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA胰酶：胰脏中分离，选择性的水解蛋白质中有赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，最佳作用温度37℃，PH=8.0，常用浓度0.1%—0.25%，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），可用含有血清培养基终止胰酶对细胞的作用（观察细胞的剥离状态确定终止时间）。
细胞复苏、传代、冻存过程
一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正）进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。
紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。
1.细胞培养液的配制：配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加）2.细胞复苏：将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。
将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。
然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。
在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。
1000rpm, 离心3分钟。
弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。
此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
）3.细胞换液：复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。
贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
单核巨噬细胞（RAW264.7）复苏与培养、消化与冻存
单核巨噬细胞（RAW264.7）复苏与培养、消化与冻存单核巨噬细胞（RAW 264.7）复苏与培养、消化与冻存1 材料与方法1.1实验材料1.1.1 细胞及中药单体成分：小鼠RAW 264.7单核巨噬细胞株购自上海细胞库；LPS购于sigma公司；1.1.2 主要试剂RPMI-1640培养液：Gbico公司产品胎牛血清：Gbico公司产品DMSO(批号DZ0231)：AMRESCO公司产品胰蛋白酶：Merck公司产品青霉素-链霉素：Gbico公司MTT、台盼蓝试剂：Sigma公司产品PBS：上海双螺旋生物科技有限公司TNF-α ELISA试剂盒：美国eBioscience公司1.1.3 仪器CO2培养箱：美国Thermo Froma公司酶标仪：Biorad公司倒置显微镜：日本olympus公司高速低温冷冻离心机：德国Eppendorf公司侧摆摇床：欧瑞实验器材公司培养瓶/培养皿、24孔/48孔/96孔培养板、离心管：美国BD公司1.2实验方法1.2.1单核巨噬细胞（RAW 264.7）复苏与培养：实验操作前，先将水浴锅预先调至37℃，无血清的RPMI- 1640培养液于37 ℃水浴锅内预热，15 ml的离心管4 ℃热平衡；用镊子将单核巨噬细胞（RAW 264.7）的细胞冻存管从液氮罐中取出，浸入含37 ℃水的烧杯内，轻轻晃动冻存管，冻存管内冰核差不多融化时取出冻存管移至超净工作台内，用酒精棉球擦拭管口；在15 ml离心管内加入4 ml含10 % FBS及1 % 青霉素-链霉素的RPMI- 1640培养液，再将冻存管内含细胞的悬液吸至该离心管内，盖上管盖，轻轻摇匀和上下颠倒混匀；继续添加含10 % 胎牛血清、1 % 青霉素-链霉素的RPMI- 1640培养液至离心管刻度14 ml处，盖上管盖，轻轻颠倒混匀；离心机设置4 ℃，1000 rpm，离心5 min后，小心吸出上清液，然后轻弹离心管底部使细胞团分散，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI- 1640培养液14 ml，盖上管盖，轻轻颠倒混匀，4 ℃，1000 rpm离心5 min，弃上清液，加 2 ml无血清的RPMI- 1640培养液混匀，取50 μl细胞悬液使用台盼蓝试剂进行活细胞计数；加细胞培养液稀释至所需的细胞浓度，移至培养瓶内培养内置于含 5 % CO2培养箱（37 ℃）中，1-2 d 更换细胞培养液1次，呈贴壁生长，2-3 d用0.25 % 胰酶消化传代1次。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。
细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。
在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。
原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。
通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。
原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。
传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。
在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。
传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。
在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。
冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。
冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。
冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。
## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。
推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。
如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。
正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。
在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。
MSC细胞复苏、传代及冻存操作步骤
MSC细胞复苏、传代及冻存操作步骤MSCs不仅可以下调免疫应答强度以调节机体的先天性免疫与适应性免疫，⽽且还可以促进⾎管⽣成、抑制细胞凋亡。
近⼏年，MSCs已然成为⽣命科学研究的热点之⼀。
然⽽，MSC细胞的培养却⾮易事，成功建⽴可靠的MSC细胞培养操作体系往往需要处理好各种操作细节。
对脐带分离MSC细胞的实操感兴趣的朋友，可以点击链接：历史⽂章-脐带分离原代MSC细胞操作步骤MSC细胞复苏1、仪器设备、耗材及试剂仪器设备：超净⼯作台⼀台、⼆氧化碳培养箱⼀台、⽔浴锅⼀台、低温离⼼机⼀台、显微镜⼀台、1mL电动移液枪、电动移液器。
耗材：镊⼦、15mL离⼼管、细胞培养瓶、10mL移液管。
试剂：MSC培养基础培养基、MSC培养完全培养基、台盼蓝染⾊液。
2、细胞复苏操作步骤实验前准备细胞培养基置于4℃平衡，⽔浴锅预先调⾄37℃，离⼼机开机预冷⾄4℃。
细胞复苏a. 从液氮罐中取出冻存管，如有液氮渗漏进冻存管内，先稍微拧松管盖，让⽓化的液氮逃逸（否则冻存管有爆炸危险）。
b. ⽤镊⼦夹住冻存管，浸⼊37℃温⽔中（注意管⼝不要浸⼊液⾯以下），并不时摇动，待管中冰核溶解⾄黄⾖粒⼤⼩时拿出，酒精擦拭后转移⾄超净⼯作台内。
注：该步骤对细胞存活率⾄关重要，既要尽快融化，减少融化过程对细胞的损害，⼜要尽可能减少细胞在较⾼温度停留的时间，以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在⽔浴锅中不管。
c. 将冻存管内细胞悬液（约1mL）转移⾄装有（约14ml）4℃预冷MSC培养基础培养基的15mL 离⼼管中，上下颠倒混匀（所有操作轻柔缓慢，以防损伤细胞）。
d. 4℃，210g，离⼼4min，吸去上清液，加⼊1mL MSC培养完全培养基重悬混匀。
e. 取出10uL细胞悬液⽤PBS稀释⼀定的倍数，取10µL稀释后的细胞悬液加⼊台盼蓝染⾊液，显微镜下计数；根据计数结果及所使⽤培养基推荐的接种密度（如使⽤达优GF20培养基，推荐接种密度4000-5000个cells/cm2）计算所需细胞悬液体积。
巨噬细胞的原代培养
巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。
目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。
我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。
2试验材料昆明种小鼠 10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供公鸡 1只PRMI1640培养基新生小牛血清HEPESD-Hanks液青霉素链霉素3试验仪器无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳 5m注射器注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。
二氧化碳培养箱生物显微镜高速冷冻离心机4实验步骤4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法:将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。
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巨噬细胞培养巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：1．实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。
2．引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3～5秒。
3．置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。
4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。
5．用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。
6．小心拔出针头，把液体注入离心管中，1000g 4℃离心10分钟，去上清，加10 ml Eagle培养基。
7．计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90％为巨噬细胞。
8．为获取3×105个帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。
9．为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle 液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃ CO2温箱中培养。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备1.小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠，置于无菌纸上，腹面朝上；2.用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜；3.10ml注射器装上大号针头，注入6 ml Hanks液或PBS，用镊子提起腹膜，向腹腔中注入Hanks液，针尖朝上，避开肠和脂肪，回抽腹腔液，不同方向冲洗数次，吸出腹腔液；4.细胞悬液离心200×g10分钟，用Hanks液洗一次，用RPMI1640－5%小牛血清悬起细胞，2×106细胞/ ml ；5.细胞悬液置入培养瓶，37度培养2小时后，吸弃上清，用预热培养基洗二次，留下贴壁细胞；6.含10 mM EDTA的PBS加入培养瓶，覆盖细胞，37度孵育20分钟，用吸管用力吹打下细胞，或用橡皮擦帚轻轻刮下细胞，即为腹腔巨噬细胞，纯度一般大于90%，每只小鼠平均可得2×106腹腔巨噬细胞。
注:1.雌性小鼠6-8周最适用。
雄性小鼠肠壁脂肪多。
不利于腹腔液收集；2.在冲洗过程中应小心，以免刺破血管或肠壁，血液流入腹腔液；3.吸出的腹腔液应洗后再贴壁，否则有血浆膜形成，影响贴壁；4.贴壁巨噬细胞分离有较多方法，如利多卡因孵育等，但大多不够理想，故细胞分离后应用台盼兰染色检测活力；5.橡皮擦帚可自制，用自行车气门芯上的橡皮管套在预先折弯的滴管尖头上，灭菌后使用，较为实用；6.炎性巨噬细胞的制备可用3%的脱水硫羟乙酸培养基2ml，注入小鼠腹腔，4天后同法由集腹腔细胞，每只小鼠腹腔细胞产量可以增加到3×107细胞左右。
需指出的是炎性巨噬细胞的功能活性与正常腹腔巨噬细胞有很大差异。
巨噬细胞的纯化1）用帖壁法纯化巨噬细胞1．用含20％～40％小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成2×106～4×10 6/ml的浓度。
以每平方厘米2×105～4×105个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）中。
37℃5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养1小时或24小时。
1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞，而24小时可以得到较多的巨噬细胞。
20％～40％的小牛血清可以减少B淋巴细胞的粘附。
2．摇晃培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。
用预温的Hanks液洗涤细胞3～4次。
悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。
用适量含2.5mmol/ L EDTA的无钙镁Hanks液消化细胞37℃15～30分钟。
用吸管吹打分离细胞，离心250×g 10分钟，去上清液。
3．用预冷的Hanks液洗涤细胞3～4次，每次离心250×g 10分钟，去上清液。
最后用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力，将细胞配成所需的浓度。
2）用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞1．取15ml离心管，将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上淡的顺序依次分层加在离心管中，每个浓度2ml。
最后加上上述巨噬细胞悬液3～5ml（约含2×107～5×107细胞）。
2．4℃中，水平离心1000×g 30分钟，垂直取出离心管，小心吸出各交界面的细胞。
分别用预冷的含1％小牛血清RPMI-1640培养液洗涤各交界面细胞2次，每次200×g 10分钟。
用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成所需的浓度。
Blasi等[2]研究鼠克隆巨噬细胞系对酵母相（Y相）及菌丝相（H相）白念珠菌的应答时发现，巨噬细胞能分辨Y相及H相菌并给予不同应答。
对Y相菌仅是吞噬作用而不引起巨噬细胞自身分泌功能的变化，而H相菌可作为刺激信号引起巨噬细胞肿瘤坏死因子（TNF）分泌增加及溶菌酶分泌减少。
尽管TNF 不导致H相菌的死亡，但可通过自分泌及旁分泌的机制调节巨噬细胞及其它效应细胞的抗白念珠菌活性。
在非单一细胞系里，由于不同细胞类型间的配合，鼠脾巨噬细胞体外在Y相白念珠菌的刺激下也应答而分泌TNF。
Blasi P et al.Infect Immun,1992;60(3):832-837细胞培养过程中的注意事项及试剂配制一.常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。
必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。
二.无菌操作无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。
2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。
如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
三.器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：(1)新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
7.高压消毒后烘干(2)旧的玻璃器皿的洗消：1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。
3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。
（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。
金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。
放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。
橡胶和塑料：橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。
注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2. 胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。
最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。
最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。
5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。
塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。