肺岩宁方对肺癌干细胞Wnt信号通路的影响
徐振晔教授治疗肺癌经验方-肺岩宁方发微
-47- CJCM 中医临床研究 2015年第7卷第14期徐振晔教授治疗肺癌经验方——肺岩宁方发微The experience of Pro.XU Zhen-hua for treating lung cancer with the FeiyanNing decoction刘新军1尹君1徐振晔2（1.上海浦东新区惠南社区卫生服务中心，上海，201301；2.上海龙华医院，上海，201301）中图分类号：R28 文献标识码：A 文章编号：1674-7860（2015）14-0047-02【摘要】徐振晔教授有较深的学术造诣，治疗肺癌有丰富的临床经验，笔者就徐教授治疗肺癌的常用方——肺岩宁方加以阐述分析，并附相关病例。
【关键词】徐振晔；肺癌；肺岩宁【Abstract】Pro. XU Zhen-hua has a wealth of clinical experience and academic attainments on treating lung cancer. The Feiyan Ning decoction was analyzed with related medicine cases.【Keywords】XU Zhen-hua; Lung cancer; The Feiyan Ning decoctiondoi:10.3969/j.issn.1674-7860.2015.14.024肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。
近20年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。
肺癌中医又名“肺岩”“肺积”“息贲”等。
《难经》记载：“肺之积，名曰息贲，在右胁下，复大如杯，久不已，令人洒淅寒热，喘咳，发肺壅。
”《圣济总录》说：“肺积息贲气胀满咳嗽，涕唾脓血。
”肺癌是以咳嗽、胸痛、咯血、体倦乏力为主要临床表现的疾病，中医认为肺癌的发生与六淫邪毒，情志所伤，饮食失调，素有旧疾，久病伤正，年老体衰有关。
肺癌干细胞Wnt信号通路的研究进展duhou
·695·中国肺癌杂志2011年8月第14卷第8期Chin J Lung Cancer, August 2011, Vol.14, No.8·综 述·DOI: 10.3779/j.issn.1009-3419.2011.08.11肺癌干细胞Wnt 信号通路的研究进展李小江 贾英杰 张文治 张莹 李宝乐 黄敏娜 包芳芳 吴建国 娄怡【摘要】 Wnt 信号通路在维持肺癌干细胞的增殖和克隆形成方面发挥着重要作用，可通过影响其关键蛋白质抑制肺癌干细胞增殖，为肺癌的治疗提供新的路径。
本文旨在通过总结2005年-2010年肺癌干细胞及Wnt 通路的研究现状，探讨Wnt 通路与肺癌干细胞的关系。
【关键词】 Wnt 信号通路；肺肿瘤；干细胞 【中图分类号】 R734.2The Research Progress about Wnt Pathway of Lung Cancer Stem CellsXiaojiang LI 1, Yingjie JIA 1, Wenzhi ZHANG 2, Ying ZHANG 1, Baole LI 3, Minna HUANG 1, Fangfang BAO 3,Jianguo WU 2, Yi LOU 31Department of Oncology, the First Teaching Hospital, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China;2Nerve Cells Laboratory, Tianjin Neurosurgery Institute, Tianjin 300060, China;3Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, ChinaCorresponding author: Yingjie JIA, E-mail: jiayingjie1616@【Abstract 】 Being the most critical signaling molecule in the Wnt pathway, the Wnt/β-catenin signaling pathway plays an important role in the maintenance of the cell proliferation and clone formation of lung cancer stem cells. Since it is closely related to the WNT pathway, the proliferation of lung cancer stem cells can be restrained by blocking the WNT pathway or influencing its key protein. Such method provides a new method for the treatment of lung cancer. By summarizing the state of-the-art research of lung cancer stem cells and the Wnt pathway from 2005 to 2010, their relationship is investigated.【Key words 】 Wnt pathway; Lung neoplasms; Stem cellsThis work was supported by a grant from National Natural Science Foundation (to Xiaojiang LI)(No.81001578).本研究受国家自然科学基金项目（No.81001578）资助作者单位：300193 天津，天津中医药大学第一附属医院肿瘤科（李小江，贾英杰，张莹，黄敏娜）；300060 天津，天津市神经外科研究所神经细胞实验室（张文治，吴建国）；300193 天津，天津中医药大学（ 李宝乐，包芳芳，娄怡 ）（通讯作者：贾英杰，E-mail: jiay-ingjie1616@ ）肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤，己成为人类因癌症死亡的主要原因[1]。
肺岩宁方对人肺癌细胞系增殖及肿瘤坏死因子α诱导的白细胞介素6和白细胞介素8产物的影响(英文)
肺岩宁方对人肺癌细胞系增殖及肿瘤坏死因子α诱导的白细胞介素6和白细胞介素8产物的影响(英文)王菊勇;郑展;徐振晔;郭净;苏婉【期刊名称】《中西医结合学报》【年(卷),期】2009(7)8【摘要】目的:探讨中药肺岩宁方含药血清对人肺癌细胞系A549细胞增殖及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的A549细胞分泌白细胞介素6(interleukin-6 ,IL-6)和IL-8的影响。
方法:肺岩宁方含药血清培养A549细胞24、48和72 h后,采用四唑单钠盐法检测肺岩宁方含药血清对A549细胞增殖的影响;肺岩宁方含药血清培养A549细胞48 h后,酶联免疫吸附测定法检测肺岩宁方含药血清对TNF-α诱导的IL-6和IL-8分泌的影响,逆转录聚合酶链式反应检测IL-6和IL-8 mRNA表达水平的变化。
结果:肺岩宁方含药血清对A549细胞增殖具有明显的抑制作用。
1μg/L TNF-α可明显提高A549细胞上清液中IL-6和IL-8的分泌水平,肺岩宁方含药血清与TNF-α共同作用后,可抑制IL-6和IL-8的分泌(P<0 .01)及IL-6、IL-8 mRNA的表达(P<0 .01)。
结论:肺岩宁方含药血清对TNFα诱导A549细胞分泌IL-6和IL-8具有明显的抑制作用,这为其临床治疗肺癌提供了一定的实验依据。
【总页数】5页(P741-745)【关键词】肺岩宁;细胞因子;肺肿瘤;含药血清;体外研究【作者】王菊勇;郑展;徐振晔;郭净;苏婉【作者单位】上海中医药大学龙华医院中医肿瘤研究所【正文语种】中文【中图分类】R587.1;R730.3【相关文献】1.益气活血方对60例慢性阻塞性肺疾病稳定期患者血清白细胞介素-8、肿瘤坏死因子及肺功能的影响 [J], 唐胜;彭素岚2.慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰白细胞介素8水平及白细胞介素1β诱导人肺上皮细胞白细胞介素8表达的调节机制 [J], 吴庆华;陈平;蔡颖3.肺岩宁方在人肺癌细胞系对肿瘤坏死因子α诱导的iNOS和COX-2表达的影响(英文) [J], 王菊勇;郭净;董昌盛;郑展;王青4.清胰化积方对胰腺癌CFPAC-1移植瘤裸小鼠血清白细胞介素6、白细胞介素8及肿瘤坏死因子α表达的影响(英文) [J], 欧阳华强;刘鲁明;陈震;罗建民;于尔辛5.肺岩宁方对肿瘤坏死因子α诱导的人肺癌细胞系核转录因子κB基因表达的影响(英文) [J], 王菊勇;金叶;徐振晔;郑展因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
肺岩宁冲剂对肺癌细胞移植瘤组织基因差异表达的影响
肺岩宁冲剂对肺癌细胞移植瘤组织基因差异表达的影响王菊勇;金叶;徐振晔;秦胜营;贺林【期刊名称】《肿瘤防治研究》【年(卷),期】2009(36)6【摘要】目的应用基因芯片技术研究肺岩宁冲剂对裸鼠人肺癌细胞移植瘤组织的基因表达谱的影响,初步探讨肺岩宁冲剂抗肺癌的分子机制。
方法将人肺癌细胞H460皮下移植瘤裸鼠24只随机分为三组:空白对照组:0.9%氯化钠溶液0.4ml灌胃×14天;化疗组:第1、3、5天DDP溶液1ml(含DDP0.1mg)腹腔注射,0.9%氯化钠溶液0.4ml灌胃×14天;肺岩宁冲剂组:肺岩宁冲剂药液0.4ml(含生药0.6g)灌胃×14天。
治疗后第15天提取各组移植瘤组织的总RNA并与人全基因组芯片杂交,经激光共聚焦扫描仪扫描及LuxScan3.0软件分析后比较各组中的差异表达基因。
结果与对照组比较,化疗组共筛查出差异表达基因2187条,其中上调基因997条,下调基因1190条,功能未知基因326条。
肺岩宁冲剂组共筛查出差异表达基因2093条,其中上调基因968条,下调基因1025条以及未知功能基因145条。
按照基因功能可分为细胞周期相关基因、代谢相关基因、细胞信号转导分子、转录调控因子等。
结论为明确肺岩宁冲剂抗肺癌的分子机制提供重要参考。
【总页数】5页(P470-474)【关键词】基因芯片;肺癌;肺岩宁;中剂;基因表达【作者】王菊勇;金叶;徐振晔;秦胜营;贺林【作者单位】上海中医药研究院中医肿瘤研究所;上海大学生命科学学院;上海交通大学Bio-X中心【正文语种】中文【中图分类】R734.2【相关文献】1.肺岩宁方及其不同组分对小鼠Lewis肺癌移植瘤VEGF、bFGF表达及血管生成的影响 [J], 张铭;徐振哗;王中奇;邓海滨;周卫东;白冰;蔡霄月;吴秋霞2.肺瘤平Ⅱ号对Lewis肺癌小鼠瘤组织MMP-9 及TIMP-1的mRNA表达的影响[J], 冯利;朴炳奎3.肺岩宁对Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤组织中核小体构象调控因子H3-K56、Rtt109、Asf1及E2F1表达的影响 [J], 郑展;王菊勇;王青;许玲;徐振晔4.健骨冲剂对去势大鼠骨组织基因差异表达影响的研究 [J], 马宇滢;张新民;李世峰;顾一峰;陈伟华5.调衡方对Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤组织与肺组织Foxp3、IL-10、TGF-β表达的影响 [J], 谭芷芬;张宏方;于鹏龙;王志航;徐洋洋;王媛媛;张怡敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
肺岩宁对晚期非小细胞肺癌生长转移和血清VEGF的影响
肺岩宁对晚期非小细胞肺癌生长转移和血清VEGF的影响徐振晔;王中奇;朱晏伟;周卫东;张晖;邓海滨;张铭;高虹;姜维洁【期刊名称】《上海中医药大学学报》【年(卷),期】2003(17)3【摘要】观察中药肺岩宁 (黄芪、白术等 )对血管内皮生成因子 (VEGF)分泌的影响及抗晚期非小细胞肺癌侵袭转移的临床疗效。
将 ( 91例 )病例分为化疗组 ( 3 1例 )、肺岩宁 +化疗组 (综合组 3 2例 )、肺岩宁组 ( 2 8例 )。
化疗组化疗后对症治疗 ,综合组化疗前后服肺岩宁方 ,肺岩宁组单纯服用肺岩宁 ;治疗前后测定血清VEGF水平 ,观察患者原发瘤灶、转移灶变化和新转移灶出现情况 ,评价生活质量和毒副反应。
疗程 3～ 4个月。
结果 :治疗后原发病灶瘤体综合组与化疗组比较有显著性差异 (P <0 0 5 ) ;转移灶瘤体综合组治疗后转移灶的增大显著低于化疗组 (P <0 0 5 ) ;新转移灶肺岩宁组和综合组淋巴结转移和远处转移的发生情况显著低于化疗组 (P <0 0 5 ) ;治疗前后相比 ,化疗组患者血清VEGF水平表现出上升趋势 ,肺岩宁组和综合组治疗后血清VEGF水平显著下降 (P <0 0 5 )。
实验采用C5 7BL/ 6小鼠 ,接种Lewis肺癌细胞株 ,随机分为对照组、化疗组、肺岩宁组、综合组。
实验结果 :用免疫组化法测定肿瘤切片的VEGF表达 ,小鼠肿瘤VEGF的表达。
结论 :益气养精、解毒抗癌的肺岩宁具有抗肺癌侵袭转移的作用 ,减少VEGF分泌 ,抑制血管生成 ,可能是肺岩宁抗肺癌生长转移的机理之一。
【总页数】5页(P18-22)【关键词】晚期非小细胞肺癌;肺岩宁;血管内皮细胞生长因子;血管生成;肿瘤侵袭转移;中医药治疗【作者】徐振晔;王中奇;朱晏伟;周卫东;张晖;邓海滨;张铭;高虹;姜维洁【作者单位】上海中医药大学附属龙华医院【正文语种】中文【中图分类】R273.42【相关文献】1.肺一丸对非小细胞肺癌患者肿瘤生长转移和血清VEGF、TSGF的影响 [J], 田菲;贾英杰;贾彦焘;陈军;孙一予;方文岩2.重组人血管内皮抑素联合NP方案治疗初诊晚期非小细胞肺癌骨转移疗效及对血清VEGF表达的影响 [J], 张锐;王智煜;王帅;赵晖3.肺岩宁方对中晚期非小细胞肺癌血清VEGF和CYFRA21-1的影响 [J], 周卫东; 徐振晔; 王中奇; 朱晏伟; 王立芳4.肺岩宁方对晚期非小细胞肺癌患者血清调节性T细胞CD_4^+CD_(25)^+的影响 [J], 张铭;徐振晔;姜唯洁5.肺岩宁方对晚期非小细胞肺癌血清TSGF和免疫功能的影响 [J], 张晖;徐振晔;王中奇;朱晏伟;周卫东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Wnt信号通路在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展
628临床肺科杂志2021年4月第26卷第4期Wnt信号通路在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展张香红1王荟荟1黄小燕1赵岩1余勤2慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive puiv-na/disease COPD)是一种以持续的呼吸道症状和进行性气流受限为特征，可以治疗和预防的慢性炎症性疾病[1]。
据统计COPD在全球的患病率约为10.1%[2],我国2018年大规模流行病学调查研究显示COPD在40岁及以上人群中的患病率为13.7%[3]O其高患病率、高死亡率及高致残率的特征给全球各国家造成了巨大的经济损失和慢性病管理负担，目前COPD已位居全球死亡原因的第3位,世界疾病经济负担的第5位⑷$COPD的发病机制目前尚未完全明确，主要认为与肺部炎症、氧化应激、蛋白酶和抗蛋白酶失衡有关。
现大量研究显示Wnt信号通路相关调控因子参与了COPD的发生过程,尽早了解其在COPD中的调控机制可能为临床COPD的防治提供新思路。
本文就Wnt信号通路在COPD中的研究进展做一综述$Wnt信号通路概述Wnt基因最早于1982年Nussa和Varmus在寻找小鼠乳腺肿瘤病毒优先整合位点时发现并命名为Int/,后来发现该基因与果蝇的无翅(Wingless)基因同源，因此重新命名为Wnh5+$由Wnt基因调控的信号传导途径称为Wnt信号通路，广泛参与各种生物的胚胎发育、组织分化及细胞繁殖、迁移、凋亡等,是近年来分子生物学、细胞生物学和肿瘤学研究的热点之一$目前在哺乳动物中发现的Wnt蛋白有19,其中肺发过和成肺中有Wnt/、WnCA、Wnth、WnC、Wnth、Wnt10、Wnt11和Wnt13[6]$根据Wnt信号通路的激活是否依赖0-catenin分为经典Wnt信号通路(即WnCp-catenin 通路)和非经典Wnt信号通路(包括WnCC/2+通路、Wnt/PCP通路及调节纺锤体定向和不对称细胞dy：10.3969/j.ivn.1009-6663.2021.04.033作者单位：1-730000甘肃兰州，兰州大学第一临床医学院2.730000甘肃兰州，兰州大学第一临床医院呼吸与危重症医学科通信作者:余勤,E-mail：yuq701@ 分裂的细胞内通路)⑺。
Wnt信号通路的生物学效应及其与肺部疾病的关系
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｓｉｃ ｏｆ Ｒｅ— ａｎｄ
死亡等，也包括细胞形态与功能的分化与维持、免疫、 应激、细胞癌变与细胞凋亡等。研究该通路有助于认
识许多疾病的分子机制，从而更好地服务于临床。本
文就ｗｎｔ信号的生物学效应及其与肺部疾病关系作 一综述。
ｎａｒ
ｐｌａ．
ｃｅｌｌ
ｐｏｌａｒｉｔｙ，ＰＣＰ）途径，即Ｗｎｔ／ＰＣＰ途径¨ｏ，在脊
ＭＭＰ在肿瘤中有重要作用，在其缺陷的小鼠肿瘤中 引起肿瘤的体积和数量减少。免疫球蛋白转录因子一 ２（ＩＴＦ．２）是Ｂ—ｃａｔｅｎｉｎ的直接靶点，在人类肿瘤中表 达增加诱导细胞转录。Ｂ．ｃａｔｅｎｉｎ在伴有异型增生的
ＡＣＦ中的细胞核内聚集，表明Ｂ．ｃａｔｅｎｉｎ异位表达与
发现了２０多种Ｗｎｔ／１３．ｅａｔｅｎｉｎ靶基因，包括细胞增生
ｐｒｏｔｅｉｎ，
因。在正常情况下，ｃ．Ｍｙｃ不仅与细胞增生有关，与最 终阻止细胞增生的细胞程序化死亡（凋亡）也有很大 关系。Ｂ—ｃａｔｅｎｉｎ／Ｔｃｆ复合物使ｃ—Ｍｙｃ上调，通过Ｃ－ Ｍｙｃ与ｐ２１启动子结合抑制ｐ２１基因转录。ｃｙｃｌｉｎＤｌ
２
Ｗｎｔ信号通路在肺脏疾病发病中的作用
ｗｎｔ信号通路与特发性肺动脉高压 特发性肺动脉高压血管重塑的调节涉及Ｗｎｔ／ＰＣＰ
Ｗｎｔ信号通路的效应
ｗｎｔ靶基因的产物多样，包括细胞周期激酶调节剂、
途径¨Ｊ。在特发性肺动脉高压患者肺中，非经典通路
（ＰＣＰ）中ＲｈｏＡ和ＲＡＣｌ明显较正常高，Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ—ＰＣＲ 显示肺动脉Ｗｎｔ １１，ＤＡＡＭｌ，Ｄｓｈ，ＲＯＣＫ均显著上调。
异的ＤＮＡ结合蛋白，并将Ｂ．ｃａｔｅｎｉｎ定位于Ｗｎｔ靶基 因的启动子部位。Ｔｃｆ／Ｌｅｆ可从３个水平激活Ｗｎｔ靶
肺岩宁颗粒调节肿瘤相关巨噬细胞对Lewis肺癌细胞迁移能力影响的研究
肺岩宁颗粒调节肿瘤相关巨噬细胞对Lewis肺癌细胞迁移能力影响的研究司海龙;王立芳;邓海滨;罗琴琴;徐振晔【期刊名称】《吉林中医药》【年(卷),期】2017(037)011【摘要】目的观察肺岩宁颗粒对肿瘤相关巨噬细胞调节作用及对Lewis肺癌细胞迁移能力影响. 方法采用肺岩宁颗粒给SD大鼠灌胃制备药物血清;利用Lewis肺癌细胞制作条件培养基(Conditioned medium, CM)并诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞;MTT 法检测对肿瘤相关巨噬细胞增殖的影响;迁徙实验检测肺岩宁颗粒对Lewis肺癌细胞迁移能力的影响;刘氏染色的方法观察对肿瘤相关巨噬细胞形态的影响;PCR法检测肺癌细胞中MMP-2、MMP-9、NF-κBp65mRNA的表达. 结果 MTT:培养 24 h、 48 h 和 72 h 后,DDP组、肺岩宁颗粒组 OD 值均显著低于模型组(P<0.05).迁徙实验:DDP组、肺岩宁颗粒组穿过膜细胞个数明显低于模型组(P<0.05),且肺岩宁颗粒组细胞个数明显低于DDP组(P<0.05).肿瘤相关巨噬细胞刘氏染色:模型组、DDP组细胞显得粗糙和较多分支(M2型),肺岩宁颗粒组细胞呈不规则形或类圆形(M1型).PCR检测MMP-2、MMP-9、NF-Bp65 mRNA的表达发现:DDP组、肺岩宁颗粒组在细胞中的表达减低,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05),且与DDP组比较,肺岩宁颗粒组MMP-2、MMP-9、NF-Bp65的表达更低(P<0.05). 结论肺岩宁颗粒能在体外能抑制Lewis肺癌细胞迁移能力,其机制可能是通过NF-κB的信号通路调节肿瘤相关巨噬细胞及其分泌的细胞因子.【总页数】5页(P1143-1147)【作者】司海龙;王立芳;邓海滨;罗琴琴;徐振晔【作者单位】陕西中医药大学附属医院肿瘤一科,陕西咸阳 712000;上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科,上海 200032;上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科,上海200032;上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科,上海 200032;上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科,上海 200032【正文语种】中文【中图分类】R289【相关文献】1.肿瘤相关巨噬细胞对宫颈癌SiHa细胞迁移和侵袭的影响 [J], 吉紫阳; 任云青2.肺岩宁颗粒干预细胞周期G_1/S检测点调控信号抗Lewis肺癌细胞增殖的研究[J], 郑展;王菊勇;徐振晔3.肺岩宁颗粒对肿瘤相关巨噬细胞及Lewis肺癌细胞侵袭能力的影响 [J], 司海龙;王惠玲;王立芳;邓海滨;罗琴琴;徐振晔4.益肺清化颗粒对Lewis肺癌小鼠VEGF、bFGF、Angiostatin、Endostatin影响的研究 [J], 李斐斐;吴皓;陈璐;周斌5.人参皂苷Rg3对小鼠Lewis肺癌生长和转移的抑制作用及其与肿瘤相关巨噬细胞的关系 [J], 贺兼斌;廖慧中;杨凯;易高众;谢茂峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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实验中医肺岩宁方对肺癌干细胞Wnt 信号通路的影响王爽1王立芳1徐振晔1沙慧芳21．上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科（上海200032）2．上海交通大学附属胸科医院胸部肿瘤研究所（上海200030）【摘要】目的：分离、鉴定肺癌干细胞，并探讨肺岩宁方对肺癌干细胞Wnt 信号通路的干预作用。
方法：分离、鉴定肺癌干细胞；将分离出的SP +肺癌干细胞分为对照组（空白血清+生理盐水）、单纯化疗（空白血清+DDP 组）、肺岩宁方组（肺岩宁方含药血清+生理盐水）、综合治疗组（肺岩宁方含药血清+DDP ），予体外药物干预后检测β-catenin 蛋白表达及SP +肺癌干细胞凋亡情况。
结果：分离的SP +、CD24+IGF-1R +、CD133+细胞具有肺癌干细胞特性，分离的β-catenin 蛋白完整；综合治疗组诱导SP +干细胞凋亡优于其他组，各组凋亡率分别为综合治疗组79．2%、肺岩宁方组21．3%、DDP 组33．7%、对照组0．3%。
结论：本课题组已掌握分离、鉴定肺癌干细胞的技术，中药肺岩宁方联合化疗具有一定的诱导肺癌干细胞凋亡的作用。
【关键词】肺岩宁方；肺癌干细胞；Wnt 信号通路；β-连环蛋白【中图分类号】R285．5；R734．2【文献标志码】A 【文章编号】1008-861X （2012）06-0077-06［基金项目］国家自然科学基金资助项目（30973822）［作者简介］王爽，女，在读博士生，主要从事中医药抗肿瘤临床及基础研究。
［通讯作者］徐振晔，教授，博士生导师。
E-mail ：xuzhenye1947@126．com自从Bonnet 等［1］于1997年第一次发现白血病干细胞，并证实其具有自我更新、增殖、分化功能以来，肿瘤干细胞的作用不断被认识，而且它的存在可能导致肿瘤细胞增殖的加速［2］，是肿瘤形成、生长、转移和复发的根源［3-7］。
随着研究的深入，人们已经意识到肺癌可能是一种干细胞疾病，具有自我更新和无限增殖能力的肺癌干细胞是肺癌发生的“根源”，肺癌的复发、侵袭转移、耐药、抗辐射等恶性表型特征都与肺癌干细胞有关。
因此，针对肺癌干细胞的治疗［8-9］可能效果更持久，同时能阻止肿瘤的复发、转移，这对于肺癌的治疗有深远的意义。
中医理论认为，肿瘤的发生、发展是由于机体正气亏损，导致邪毒凝聚、阴阳失衡的病理变化，肿瘤侵袭转移的根本原因在于肾精亏虚、阴阳失衡，临床上中晚期肺癌患者常具有精气两亏之证候，而扶助肾中精气结合解毒散结法抗癌的确具有良效。
据此徐振晔教授研制出具有益气养精、解毒散结之功的肺岩宁方。
前期临床研究表明该方联合化疗具有良好的治疗进展期非小细胞肺癌的作用［10］，实验研究表明该方具有干预细胞周期G1/S 检测点调控信号抗Lewis 肺癌细胞增殖的作用［11］。
本研究旨在前期研究基础上，首先对肺癌干细胞进行分离、鉴定，并初步探讨肺岩宁方对肺癌干细胞的干预作用，为肺岩宁方干预肺癌干细胞的进一步研究奠定基础。
1材料与方法1．1实验材料1．1．1实验动物BALB /C 裸鼠，雄性，体质量（20ʃ2）g ，购自中国科学院上海实验动物中心，动物合格证号：SCXK （沪）2007-0005，饲养于上海中医药大学附属龙华医院SPF 级动物房。
雄性Wistar大鼠18只，清洁级，体质量为（200ʃ15）g ，合格证号：SCXK （沪）2007-0001。
1．1．2药品与试剂肺岩宁方，由生黄芪、黄精、仙灵脾、重楼、山慈菇等组成，龙华医院中药房提供。
常规水煎，水浴浓缩至生药含量为2．0g /ml ，4ħ保存备用。
顺铂（DDP ），齐鲁制药厂（批号：95062015），临用时注射用水配制成0．1mg /ml 水溶液。
胎牛血清（FBS ）、F12k 培养基，Gibco 公司产品；荧光染料Hoechst33342，Sigma 公司产品；0．25%胰酶，Gibco 公司产品；纤维细胞生长因子（FGF ）、重组人表皮生长因子（EGF ），购自Sigma 公司。
1．1．3肺癌细胞A549人肺腺癌细胞株，购自中国科学院上海生命细胞库，在含10%FBS 的F12k 培养基中传代培养，取活跃增殖期细胞进行实验。
1．2肺癌干细胞分离及鉴定实验1．2．1流式细胞仪分离SP +肺癌干细胞取对数期生长的A549细胞，0．25%胰酶消化，按照试剂说明书及流式细胞仪操作指南，分选出SP 细胞及Non SP 细胞，其中SP 细胞分别用于接种裸鼠及体外增殖实验。
1．2．2免疫磁珠分离CD24+IGF-1R +、CD133+肺癌干细胞取对数期生长的A549细胞，0．25%胰酶消化，分别按照操作指南用MiniMACS分离柱分选，并收集得到的CD24+IGF-1R+、CD133+细胞，用于接种裸鼠及体外增殖实验。
1．2．3体内致瘤性观察收集分离得到的肺癌细胞，SP+细胞浓度设为1ˑ103、5ˑ103、5ˑ104个，CD24+IGF-1R+与CD133+细胞浓度均分别设为100、500、2000个。
分别将不同浓度的肺癌细胞接种于4周龄裸鼠左腋下，10只/组；同时以1ˑ107个A549细胞接种，作为阴性对照。
接种后每天观察一次肿瘤生长情况。
取第2周、第4周，分别统计肿瘤形成情况；于观察第4周，将小鼠断颈处死，拍照后摘取肿瘤，测量后用于检测。
1．2．4“成球”能力观察收集分离得到的SP+、CD24+IGF-1R+、CD133+细胞，用含20ng/ml重组人酸性成纤维细胞生长因子（FGF）、20ng/ml重组人表皮生长因子（EGF）、20%FBS的F12接种于24孔培养板，于37ħ5%CO2培养箱中培养，每天于显微镜下观察，直到形成“肿瘤球”。
同条件下培养A549细胞作为阴性对照。
1．2．5免疫荧光检测肿瘤组织将裸鼠处死，剖取肿瘤，在10%福尔马林溶液中进行固定。
肿瘤组织经脱水、透明后用石蜡包埋，将包埋好的组织进行切片，切片厚度为5μm。
切片常规脱蜡至水，按照免疫荧光检测步骤及试剂盒说明书操作染色，CD24+ IGF-1R+细胞抗体为Rabbit Anti-human CD24单克隆抗体（FITC标记，1ʒ200稀释，稀释液为含1% BSA PBST）、Rat Anti-human IGF-1R单克隆抗体（TRITC标记，1ʒ500稀释），CD133+细胞抗体为Rabbit Anti-human CD133单克隆抗体（TRITC标记，1ʒ250稀释，稀释液为含1%BSA PBST），染色后在共聚焦显微镜下观察并拍照（400倍）。
1．3肺岩宁方含药血清制备及干预1．3．1含药血清制备将雄性Wistar大鼠按体质量每日灌胃给予中药药液（1．5ml/kg），连续给药3d，于最后1次给药1h后（灌药前12h禁食），乙醚麻醉，腹主动脉采血，室温放置待血凝之后，5000r/min，离心7min。
将血清过滤除菌，56ħ灭活30min，密封，－20ħ保存备用。
1．3．2体外实验将分离出的SP+肺癌干细胞分为对照组（模拟用药）、DDP组（单纯化疗）、肺岩宁方组（单纯中药）、综合治疗组（中药+化疗），第3天给药后2h取材进行检测。
给药方法如下：①对照组：空白血清+生理盐水；②DDP组：空白血清+ DDP；③肺岩宁方组：肺岩宁方含药血清+生理盐水；④综合治疗组：肺岩宁方含药血清+DDP。
均每日1次。
1．4检测指标与方法1．4．1Western blot法检测β-catenin蛋白按照试剂盒说明提取总蛋白，然后加入抽提试剂去除非蛋白成分，离心、干燥，得到总蛋白，BCA方法检测蛋白浓度。
取等量蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，按照湿法电转印方法操作，电转电压100V，恒压，最后用ECL化学发光法显色，以CAPDH作为对照。
1．4．2流式细胞仪法检测肺癌干细胞凋亡取用药干预后的肺癌干细胞，0．25%胰酶消化，按照试剂说明书及流式细胞仪操作指南，采用annexin v/PI 双染法检测肺癌干细胞凋亡率。
1．5统计学方法采用SPSS18．0统计软件，对实验数据进行分析，计数资料使用卡方检验，计量资料采用方差分析。
2结果2．1致瘤性分析2．1．1SP+肺癌干细胞至观察第2周，除A549细胞株外，不同浓度的SP+肺癌干细胞均有肿瘤形成；第4周，除A549细胞株外，各浓度的SP+肺癌干细胞均致裸鼠形成肿瘤。
结果表明，接种时细胞浓度越大则第2周形成肿瘤的比例越高，第4周形成的肿瘤越大，即仅需要103个SP+肺癌干细胞便可在较短时间内导致肿瘤的发生，并且其致瘤性呈浓度正相关。
见表1。
表1SP+肺癌干细胞致瘤性分析细胞浓度（个）肿瘤形成比肿瘤大小（g）1ˑ1033/101．23ʃ0．055ˑ1038/101．64ʃ0．055ˑ10410/102．05ʃ0．05 2．1．2CD24+IGF-1R+及CD133+肺癌干细胞第2周，除A549细胞株外，不同浓度的CD24+IGF-1R+及CD133+肺癌干细胞均有肿瘤形成；第4周，除A549细胞株外，各浓度的CD24+IGF-1R+及CD133+肺癌干细胞均致裸鼠形成肿瘤。
结果表明，其致瘤性呈浓度正相关。
见表2，图1、图2。
表2CD24+IGF-1R+及CD133+肺癌干细胞致瘤性分析细胞浓度（个）CD24+IGF-1R+肿瘤形成比肿瘤大小（g）CD133+肿瘤形成比肿瘤大小（g）1005/101．53ʃ0．044/101．04ʃ0．085006/102．03ʃ0．057/101．78ʃ0．02200010/102．27ʃ0．0710/102．17ʃ0．02图2CD24+IGF-1R +肺癌干细胞形成肿瘤的组织免疫荧光检测（DAPI 染核，FITC 染膜和TRITC 染膜）2．2“成球”能力监测2．2．1SP +肺癌干细胞除A549细胞株外，3种不同浓度SP +肺癌干细胞于培养后5 10d 内均形成“肿瘤球”，但其所需时间并不相同，高浓度“成球”所需时间最短、“肿瘤球”直径最大。
见表3，图3。
表3不同浓度SP +肺癌干细胞“成球”时间及“肿瘤球”直径细胞浓度（个）成球时间（d ）球径（μm ）1ˑ1039605ˑ1038905ˑ1044250图3SP +肺癌干细胞体外增殖形成的肿瘤球（ˑ400）2．2．2CD24+IGF-1R +及CD133+肺癌干细胞除A549细胞株外，不同浓度CD24+IGF-1R +及CD133+肺癌干细胞，于培养后5 10d 内均形成“肿瘤球”，但其所需时间并不相同，高浓度“成球”所需时间最短、“肿瘤球”直径最大。
见表4，图4、图5。
表4不同浓度CD24+IGF-1R +及CD133+肺癌干细胞“成球”时间及“肿瘤球”直径细胞浓度（个）CD24+IGF-1R +形成球时间（d ）球径（μm ）CD133+成球时间（d ）球径（μm ）1001080105050071207100200052305200图4CD24+IGF-1R +肺癌干细胞体外增殖形成的肿瘤球（ˑ400）图5CD133+肺癌干细胞体外增殖形成的肿瘤球（ˑ400）2．3对β-catenin蛋白的影响Western blot法检测结果显示，分离的β-catenin蛋白完整。