第五章 高效液相色谱法(6h)
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
高效液相色谱法中国药品检验标准操作规范2010年版
高效液相色谱法高效液相色谱法(《中国药典》2010年版二部附录V D)系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品,由流动相带入柱内,各组分在柱内被分离,并依次进入检测器,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪,由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成,仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期鉴定并符合有关规定。
1.1 色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂,以十八烷基键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂,常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂;分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂;对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充,直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm(1nm=10?)以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物,分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
除另有规定外,分析柱的填充剂一般在3~10μm之间。
粒径更小(约2μm)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm)。
使用微径柱时,输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配;如有必要,色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时,应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
以硅胶为载体的键合固定相的使用温度不超过40℃,为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度,但不宜超过60℃。
流动相的pH指应控制在2~8之间。
当pH指大于8时,可使载体硅胶溶解;当pH指小于2时,与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时,应选用耐碱的填充剂,如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等;当需使用pH值小于2的流动相时,应选用耐酸的填充剂,如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂,或有机-无机杂化填充剂等。
高效液相色谱法培训PPT课件
chromatography）。
8
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
5
离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
45
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
水不注
、 醋 酸 。
能 含 缓 冲 盐 ， 若 调 节
意
： 流 动 相 必 须 是 挥
pH
发
可性
用的
氨，
46
质 谱 检 测 器
47
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
1
第一节 概述
8
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
5
离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
45
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
水不注
、 醋 酸 。
能 含 缓 冲 盐 ， 若 调 节
意
： 流 动 相 必 须 是 挥
pH
发
可性
用的
氨，
46
质 谱 检 测 器
47
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
1
第一节 概述
第五章高效液相色谱法
2019/7/25
数据处理系统
打开工作站，选择工作通道 编辑方法文件，设置方法名称、运行时间及定量方法 输入路径名、样品名、操作者等 样品分离完成后，记录谱图文件名和色谱峰峰高、峰面积和保留值等
2019/7/25
四. 液相色谱固定相
1.液-固色谱固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响
小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。
2019/7/25
气相色谱中的固定相原则上都可以用于液相色谱，其选 用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但 在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的 工作，一般很少自行制备。
2019/7/25
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
2019/7/25
二极管阵列检测器
样品池 D2 / W 灯
光栅
每一组分可在每一波 长处得到一吸光度值
二极管阵列
二极管阵列检测器的优点
1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰
2019/7/25
2. 液-液色谱固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
数据处理系统
打开工作站，选择工作通道 编辑方法文件，设置方法名称、运行时间及定量方法 输入路径名、样品名、操作者等 样品分离完成后，记录谱图文件名和色谱峰峰高、峰面积和保留值等
2019/7/25
四. 液相色谱固定相
1.液-固色谱固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响
小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。
2019/7/25
气相色谱中的固定相原则上都可以用于液相色谱，其选 用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但 在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的 工作，一般很少自行制备。
2019/7/25
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
2019/7/25
二极管阵列检测器
样品池 D2 / W 灯
光栅
每一组分可在每一波 长处得到一吸光度值
二极管阵列
二极管阵列检测器的优点
1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰
2019/7/25
2. 液-液色谱固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
高效液相色谱法的标准操作规程
高效液相色谱法的标准操作规程1 定义及概述：1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。
常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。
检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。
色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
2 高效液相色谱仪的使用要求：2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。
2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
3 操作前的准备：3.1 流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。
对规定pH值的流动相，应使用精密pH 计进行调节。
配制好的流动相应通过0.45µm适宜的滤膜滤过，用前脱气。
第五章高效液相色谱法
9
基本理论
热力学理论：塔板理论——平衡理论 热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论—— 范第姆特 动力学理论：速率理论 ——范第姆特 方程 色谱图的基本参数：与气相色谱法类 似
10
各类高效液相色谱法的分离原理及选 择
液-固吸附色谱 液-液分配色谱 离子交换色谱 体积排阻色谱 亲和色谱
3
高效液相色谱法的类型
根据固定相的不同 液-固色谱 液-液色谱 根据分离机理的不同 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 体积排阻色谱 亲和色谱
4
分配色谱：分离组分在两相中的分配系数不 同 吸附色谱：固定相对分离组分的吸附能力不 同 离子交换色谱：不同离子与固定相上的相反 电荷离子间作用力大小不同 体积排阻色谱：根据样品分子尺寸的不同按 分子大小分开 亲和色谱：不同基体上键合多种不同特性的 配位体作固定相，用具有不同pH的缓冲溶液 做流动相，依据生物分子与基体上键联的配 位体之间存在的特异性亲和作用力不同
30
流动相
1. 流动相特性
(1)液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂 液相色谱的流动相又称为：淋洗液， 液相色谱的流动相又称为 。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分 流动相组成改变，极性改变， 分离状况； 分离状况； (2)亲水性固定液常采用疏水性流动相 ， 即流 亲水性固定液常采用疏水性流动相， 亲水性固定液常采用疏水性流动相 动相的极性小于固定相的极性， 动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色 谱法，极性柱也称正相柱。 谱法，极性柱也称正相柱。 (3)若流动相的极性大于固定液的极性 ， 则称 若流动相的极性大于固定液的极性， 若流动相的极性大于固定液的极性 为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。 为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分 31 在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
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第五章 高效液相色谱法
高效液相色谱（High Performance Liquide Chromatography）还可称为高压液相色谱 （High Pressure Liquide Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquide Chromatography）、高分 离度液相色谱（High Resolution Liquide Chromatography）或现代液相色谱 （Modern Liquide Chromatography）。
第二节 高效液相色谱法的分类 高效液相色谱法可依据溶质(样品) 高效液相色谱法可依据溶质(样品)在固定相和流动相 分离过程的物理化学原理分类。 分离过程的物理化学原理分类。 吸附色谱( (1)吸附色谱(Adsorption Chromatography) 用固体 ) 吸附剂作固定样 品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。 品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
（3）检测灵敏度高 在高效液相色谱法中使用的检测 ） 器大多数都具有较高的灵敏度。 器大多数都具有较高的灵敏度。如被广泛使用的紫外 吸收检测器，最小检出量可达10-9g；用于痕量分析 吸收检测器，最小检出量可达 ； 的荧光检测器，最小检出量可达10-12g。 的荧光检测器，最小检出量可达 。 由于高压输液泵的使用， （4）分析速度快 由于高压输液泵的使用，相对于经 ） 典液相（ 色谱，其分析时间大大缩短， 典液相（柱）色谱，其分析时间大大缩短，当输液压 力增加时，流动相流速会加快， 力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析 时间仅需几分钟到几十分钟。 时间仅需几分钟到几十分钟。 高效液相色谱法除具有以上特点外， 高效液相色谱法除具有以上特点外，它的应用范围也 日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器， 日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器，样品被分 析后，在大多数情况下，可除去流动相， 析后，在大多数情况下，可除去流动相，实现对少量 珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。 珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。
(3)离子色谱 离子色谱(Ion Chromatography) 用高效微粒离子 离子色谱 交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动 交换剂作固定相，以具有一定 值的缓冲溶液作流动 相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上 表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实 现分离。 现分离。
第四节 高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型， 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能 各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的， 各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品 仪器可有如下两种组合方式： 仪器可有如下两种组合方式： 完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高， ①完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高 效液相色谱仪总体实用的特点。 效液相色谱仪总体实用的特点。 ②独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析 独立部件的组合系统。 其灵活性高， 目的，组装成不同的联接方式。 目的，组装成不同的联接方式。 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪， 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很 即能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、 高 ， 即能控制仪器的操作参数 ( 如溶剂梯度洗脱 、 流动相流量 、 柱温、 自动进样、洗脱液收集、 检测器功能等) 柱温 、 自动进样 、 洗脱液收集 、 检测器功能等 ) ， 又能对获得 的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、 的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰 面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、 面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全 的分析工具。 的分析工具。
第一节 高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法具有以下特点。 高效液相色谱法具有以下特点。 （1）分离效能高 由于新型高效微粒固定相填 ） 料的使用，液相色谱填充柱的柱效可达 2×103~5×104块/米理论塔板数，远远高于气相 米理论塔板数， × × 米理论塔板数 色谱填充柱10 米理论塔板数的柱效。 色谱填充柱 3块/米理论塔板数的柱效。 米理论塔板数的柱效 由于液相色谱柱具有高柱效， （2）选择性高 由于液相色谱柱具有高柱效， ） 并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。 并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。 因此， 因此 ，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型 的有机化合物及同分异构体， 的有机化合物及同分异构体， 还可分析在性质 上极为相似的旋光异构体， 上极为相似的旋光异构体 ，并已在高疗效的合 成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重 要的作用。 要的作用。
二、方法的局限性 第—，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相， ，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相， 当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。 当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。 当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。 当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。 第二， 第二，高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用 型检测器(如热导检测器和氢火焰离子化检测器) 型检测器(如热导检测器和氢火焰离子化检测器)。近年来蒸发 激光散射检测器的应用日益增多， 激光散射检测器的应用日益增多，有望发展成为高效液相色谱 法的一种通用型检测器。 法的一种通用型检测器。 第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法， 第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求 柱效高达10万块理论塔板数以上， 10万块理论塔板数以上 柱效高达10万块理论塔板数以上，必需用毛细管气相色谱法分 析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。 析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。 第四，高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法， 第四，高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在 200kPa kPa至 MPa柱压下去分析受压易分解 柱压下去分析受压易分解、 200kPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性 的生化样品。 的生化样品。 综上所述可知， 综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析 方法一样，都不可能十全十美， 方法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相 色谱法的特点，应用范围和局限性的前提下， 色谱法的特点，应用范围和局限性的前提下，充分利用高效液 相色谱法的特点，就可在解决实际任务中发挥重要的作用。 相色谱法的特点，就可在解决实际任务中发挥重要的作用。
(2)分配色谱 分配色谱(Partition Chromatography) 用载带在固相基体上 分配色谱 的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相， 的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各 组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。 组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和液 体流动相相对极性的差别， 体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配 色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配 色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时， 色谱或简称正相色谱(Normal Chromatography)； 色谱或简称正相色谱(Normal Phase Chromatography)；若固定 相的极性小于流动相的极性时， 相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反 相色谱(Reversed Phase Chromatography)。 相色谱 。
高效液相色谱仪的组成 1一贮液罐；2一搅拌、超声脱气器；3一梯度淋洗装置；4一 高压输液泵；5一流动相流量显示；6一柱前压力表；7一输液 泵泵头；8一过滤器；9一阻尼器；10一六通进样阀；11一色 谱柱；12一紫外吸收(或折光指数)检测器；13一记录仪(或数 据处理装置)；14一回收废液罐
一、高压输液泵 对高压输液泵的要求是： 对高压输液泵的要求是： ①泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢 （ Cr1Ni8Ti9）或优质耐酸不锈钢 ） 或优质耐酸不锈钢(Cr18Nil2Mo2)。为防止酸 、 。 为防止酸、 碱缓冲溶液的腐蚀， 碱缓冲溶液的腐蚀， 在离子色谱或亲和色谱分析中现已使用 由聚醚醚酮(PEEK)材料制成的高压输液泵。 材料制成的高压输液泵。 由聚醚醚酮 材料制成的高压输液泵 能在高压下连续工作。通常要求耐压40~50MPa·cm-2，能 ②能在高压下连续工作。通常要求耐压 连续工作。 在8～24h连续工作。 ～ 连续工作 输出流量范围宽。 对填充柱： ～ 分析型)； ③ 输出流量范围宽 。 对填充柱 ： 0.1～l0mL／min(分析型 ； ／ 分析型 1~100mL／min(制备型 。对微孔柱：10～1000uL／min(分析 制备型)。 ／ 制备型 对微孔柱： ～ ／ 分析 制备型)。 型)；1~9900uL／min(制备型 。 ； ／ 制备型 输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器， ④输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器， 大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。 大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这 样可以降低基线噪声并获较好的检测下限。 样可以降低基线噪声并获较好的检测下限。流量控制的精密 度应小于1％，最好为0.5％，重复性最好为0.5％。 ％，最好为 ％，重复性最好为 度应小于 ％，最好为 ％，重复性最好为 ％。
(5)亲和色谱( (5)亲和色谱(Affinity Chromatography) 以 亲和色谱 ) 在不同基体上， 在不同基体上，键合多种不同特性的配位体 作固定相，用具有不同pH pH值的缓冲溶液作流 作固定相，用具有不同pH值的缓冲溶液作流 动相，依据生物分子(氨基酸、 蛋白质、 动相，依据生物分子(氨基酸、肽、蛋白质、 核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等) 核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等)与基体上 键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能 力的差别， 力的差别，而实现对具有生物活性的生物分 子的分离。 子的分离。
(4)体积排阻色谱 体积排阻色谱(Size Exclusion Chromatography) 用 体积排阻色谱 化学惰性的多孔性凝胶作固定相， 化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中 各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。 各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。以水溶 液作流动相的体积排阻色谱法， 液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色谱 (Gel Filtration Chromatography)；以有机溶剂作流动 ； 相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法 相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography)。 。
高效液相色谱（High Performance Liquide Chromatography）还可称为高压液相色谱 （High Pressure Liquide Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquide Chromatography）、高分 离度液相色谱（High Resolution Liquide Chromatography）或现代液相色谱 （Modern Liquide Chromatography）。
第二节 高效液相色谱法的分类 高效液相色谱法可依据溶质(样品) 高效液相色谱法可依据溶质(样品)在固定相和流动相 分离过程的物理化学原理分类。 分离过程的物理化学原理分类。 吸附色谱( (1)吸附色谱(Adsorption Chromatography) 用固体 ) 吸附剂作固定样 品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。 品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
（3）检测灵敏度高 在高效液相色谱法中使用的检测 ） 器大多数都具有较高的灵敏度。 器大多数都具有较高的灵敏度。如被广泛使用的紫外 吸收检测器，最小检出量可达10-9g；用于痕量分析 吸收检测器，最小检出量可达 ； 的荧光检测器，最小检出量可达10-12g。 的荧光检测器，最小检出量可达 。 由于高压输液泵的使用， （4）分析速度快 由于高压输液泵的使用，相对于经 ） 典液相（ 色谱，其分析时间大大缩短， 典液相（柱）色谱，其分析时间大大缩短，当输液压 力增加时，流动相流速会加快， 力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析 时间仅需几分钟到几十分钟。 时间仅需几分钟到几十分钟。 高效液相色谱法除具有以上特点外， 高效液相色谱法除具有以上特点外，它的应用范围也 日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器， 日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器，样品被分 析后，在大多数情况下，可除去流动相， 析后，在大多数情况下，可除去流动相，实现对少量 珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。 珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。
(3)离子色谱 离子色谱(Ion Chromatography) 用高效微粒离子 离子色谱 交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动 交换剂作固定相，以具有一定 值的缓冲溶液作流动 相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上 表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实 现分离。 现分离。
第四节 高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型， 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能 各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的， 各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品 仪器可有如下两种组合方式： 仪器可有如下两种组合方式： 完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高， ①完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高 效液相色谱仪总体实用的特点。 效液相色谱仪总体实用的特点。 ②独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析 独立部件的组合系统。 其灵活性高， 目的，组装成不同的联接方式。 目的，组装成不同的联接方式。 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪， 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很 即能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、 高 ， 即能控制仪器的操作参数 ( 如溶剂梯度洗脱 、 流动相流量 、 柱温、 自动进样、洗脱液收集、 检测器功能等) 柱温 、 自动进样 、 洗脱液收集 、 检测器功能等 ) ， 又能对获得 的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、 的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰 面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、 面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全 的分析工具。 的分析工具。
第一节 高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法具有以下特点。 高效液相色谱法具有以下特点。 （1）分离效能高 由于新型高效微粒固定相填 ） 料的使用，液相色谱填充柱的柱效可达 2×103~5×104块/米理论塔板数，远远高于气相 米理论塔板数， × × 米理论塔板数 色谱填充柱10 米理论塔板数的柱效。 色谱填充柱 3块/米理论塔板数的柱效。 米理论塔板数的柱效 由于液相色谱柱具有高柱效， （2）选择性高 由于液相色谱柱具有高柱效， ） 并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。 并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。 因此， 因此 ，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型 的有机化合物及同分异构体， 的有机化合物及同分异构体， 还可分析在性质 上极为相似的旋光异构体， 上极为相似的旋光异构体 ，并已在高疗效的合 成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重 要的作用。 要的作用。
二、方法的局限性 第—，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相， ，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相， 当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。 当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。 当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。 当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。 第二， 第二，高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用 型检测器(如热导检测器和氢火焰离子化检测器) 型检测器(如热导检测器和氢火焰离子化检测器)。近年来蒸发 激光散射检测器的应用日益增多， 激光散射检测器的应用日益增多，有望发展成为高效液相色谱 法的一种通用型检测器。 法的一种通用型检测器。 第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法， 第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求 柱效高达10万块理论塔板数以上， 10万块理论塔板数以上 柱效高达10万块理论塔板数以上，必需用毛细管气相色谱法分 析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。 析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。 第四，高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法， 第四，高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在 200kPa kPa至 MPa柱压下去分析受压易分解 柱压下去分析受压易分解、 200kPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性 的生化样品。 的生化样品。 综上所述可知， 综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析 方法一样，都不可能十全十美， 方法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相 色谱法的特点，应用范围和局限性的前提下， 色谱法的特点，应用范围和局限性的前提下，充分利用高效液 相色谱法的特点，就可在解决实际任务中发挥重要的作用。 相色谱法的特点，就可在解决实际任务中发挥重要的作用。
(2)分配色谱 分配色谱(Partition Chromatography) 用载带在固相基体上 分配色谱 的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相， 的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各 组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。 组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和液 体流动相相对极性的差别， 体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配 色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配 色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时， 色谱或简称正相色谱(Normal Chromatography)； 色谱或简称正相色谱(Normal Phase Chromatography)；若固定 相的极性小于流动相的极性时， 相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反 相色谱(Reversed Phase Chromatography)。 相色谱 。
高效液相色谱仪的组成 1一贮液罐；2一搅拌、超声脱气器；3一梯度淋洗装置；4一 高压输液泵；5一流动相流量显示；6一柱前压力表；7一输液 泵泵头；8一过滤器；9一阻尼器；10一六通进样阀；11一色 谱柱；12一紫外吸收(或折光指数)检测器；13一记录仪(或数 据处理装置)；14一回收废液罐
一、高压输液泵 对高压输液泵的要求是： 对高压输液泵的要求是： ①泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢 （ Cr1Ni8Ti9）或优质耐酸不锈钢 ） 或优质耐酸不锈钢(Cr18Nil2Mo2)。为防止酸 、 。 为防止酸、 碱缓冲溶液的腐蚀， 碱缓冲溶液的腐蚀， 在离子色谱或亲和色谱分析中现已使用 由聚醚醚酮(PEEK)材料制成的高压输液泵。 材料制成的高压输液泵。 由聚醚醚酮 材料制成的高压输液泵 能在高压下连续工作。通常要求耐压40~50MPa·cm-2，能 ②能在高压下连续工作。通常要求耐压 连续工作。 在8～24h连续工作。 ～ 连续工作 输出流量范围宽。 对填充柱： ～ 分析型)； ③ 输出流量范围宽 。 对填充柱 ： 0.1～l0mL／min(分析型 ； ／ 分析型 1~100mL／min(制备型 。对微孔柱：10～1000uL／min(分析 制备型)。 ／ 制备型 对微孔柱： ～ ／ 分析 制备型)。 型)；1~9900uL／min(制备型 。 ； ／ 制备型 输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器， ④输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器， 大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。 大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这 样可以降低基线噪声并获较好的检测下限。 样可以降低基线噪声并获较好的检测下限。流量控制的精密 度应小于1％，最好为0.5％，重复性最好为0.5％。 ％，最好为 ％，重复性最好为 度应小于 ％，最好为 ％，重复性最好为 ％。
(5)亲和色谱( (5)亲和色谱(Affinity Chromatography) 以 亲和色谱 ) 在不同基体上， 在不同基体上，键合多种不同特性的配位体 作固定相，用具有不同pH pH值的缓冲溶液作流 作固定相，用具有不同pH值的缓冲溶液作流 动相，依据生物分子(氨基酸、 蛋白质、 动相，依据生物分子(氨基酸、肽、蛋白质、 核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等) 核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等)与基体上 键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能 力的差别， 力的差别，而实现对具有生物活性的生物分 子的分离。 子的分离。
(4)体积排阻色谱 体积排阻色谱(Size Exclusion Chromatography) 用 体积排阻色谱 化学惰性的多孔性凝胶作固定相， 化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中 各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。 各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。以水溶 液作流动相的体积排阻色谱法， 液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色谱 (Gel Filtration Chromatography)；以有机溶剂作流动 ； 相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法 相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography)。 。