液相色谱工作原理及简单操作ppt课件
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液相色谱法ppt课件
二、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
21
第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
5
第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
1
第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
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第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
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第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
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第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
经典液相色谱法 ppt课件
和薄层色谱。
ppt课件
3
1.2 吸附色谱法的依据
吸附过程的两个规律： 1）吸附过程是可逆的，存在着吸附 平衡,存在一个吸附平衡常数 解附的动态
K=Cs/Cm
2）吸附剂对不同物质的吸附行为有差异
ppt课件 4
吸附机理
流动相通过固定相时，吸附剂表面的活性中心吸附流
动相分子，当组分分子进入柱子时，会赶走流动相分 子而占据吸附剂的活性中心位，即组分被吸附；反之， 溶剂分子也可把溶质分子赶走，即解吸。
SO3H CH CH2 CH
SO 3H CH2 CH
SO3H CH2 CH
SO3H CH2 CH
SO3H
SO3H
SO3H
ppt课件
SO3H
SO3H
50
交换反应： R-SO3-H+ + Na+ + ClR-SO3- Na+ + H+ + Cl-
ppt课件
51
1.2 阴离子交换树脂
根据可交换的离子的不同
低交联度树脂－网状结构疏松，网眼大，具有较好的渗 透性，但存在着易变形和耐压差等缺点。
ppt课件 53
根据分离对象选择树脂交联度：
分离小分子物质（氨基酸） ——选择8%树脂为宜
分离分子量较大的物质（多肽）
——选择2－4%树脂为宜
保留：极性越小的组分保留越强
ppt课件
40
3. 载体
作用：负载固定液 要求：化学惰性，粒度小而均匀，纯净，与固定液间
有较大的分子间作用力。
常用载体：硅胶 、硅藻土 、纤维素
ppt课件
41
4. 固定液相与流动液相
液相色谱PPT课件
11
溶剂等级
水的等级
纯化水 蒸馏水 去离子水
吸 光
去离子水
率 纯化水
波长 (nm) 因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高
纯化水中去除了无机和有机的污染物
12
HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：
• 1 专门的纯水机或超纯水机； • 2 去离子水重蒸； • 3 二次或三次重蒸水； • 4 采用类似家用的纯水机； • 5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； • 6 其它途径；
Modified Si
9
反相HPLC 色谱柱
C18 (ODS) type
C8 (octyl) type Non-polar property
C4 (butyl) type Phenyl type
-Si-C18H37
TMS type
Si
Cyano type
10
流动相
流动相选择注意事项： ▪纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 ▪避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 ▪对试样有适宜的溶解度 ▪溶剂粘度要小 ▪与检测器相匹配 ▪流动相配制时的顺序
26
进样体积与响应值关系
检
测
器
响 应
部分注入
值
定量管体积的一半
18
进样器
▪ 自动进样器 ▪ 手动进样器
原理：（六通阀） 注入方式：
1）全量注入 2）部分注入
返回
19
HPLC六通阀进样器的使用及保养
• 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是 由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne 公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以 此产品作为仪器的进样器。
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溶剂等级
水的等级
纯化水 蒸馏水 去离子水
吸 光
去离子水
率 纯化水
波长 (nm) 因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高
纯化水中去除了无机和有机的污染物
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HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：
• 1 专门的纯水机或超纯水机； • 2 去离子水重蒸； • 3 二次或三次重蒸水； • 4 采用类似家用的纯水机； • 5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； • 6 其它途径；
Modified Si
9
反相HPLC 色谱柱
C18 (ODS) type
C8 (octyl) type Non-polar property
C4 (butyl) type Phenyl type
-Si-C18H37
TMS type
Si
Cyano type
10
流动相
流动相选择注意事项： ▪纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 ▪避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 ▪对试样有适宜的溶解度 ▪溶剂粘度要小 ▪与检测器相匹配 ▪流动相配制时的顺序
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进样体积与响应值关系
检
测
器
响 应
部分注入
值
定量管体积的一半
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进样器
▪ 自动进样器 ▪ 手动进样器
原理：（六通阀） 注入方式：
1）全量注入 2）部分注入
返回
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HPLC六通阀进样器的使用及保养
• 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是 由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne 公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以 此产品作为仪器的进样器。
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《液相色谱分析法》课件
液相色谱分析法
,
汇报人：
目录
01 添 加 目 录 项 标 题 03 液 相 色 谱 分 析 法 的
技术原理
05 液 相 色 谱 分 析 法 的 优缺点
02 液 相 色 谱 分 析 法 的 概述
04 液 相 色 谱 分 析 法 的 应用实例
06
液相色谱分析法的 发展趋势和未来展
望
Part One
单击添加章节标题
数据处理：对检测到的信号 进行处理，得到样品的色谱 图和定量结果
结果分析：根据色谱图和定 量结果，对样品进行分析和 鉴定
Part Four
液相色谱分析法的 应用实例
在药物分析中的应用
药物稳定性研究：研究药物 在储存过程中的稳定性
药物成分分析：分析药物中 的有效成分、杂质等
药物质量控制：控制药物的 质量，确保药物的安全性和
液相色谱分析法的研究热点和前沿技术
超高效液相色谱技术：提高分离效率，降 低检测限
生物样品分析：应用于生物医药、食品安 全等领域
质谱联用技术：提高检测灵敏度和准确性
环境样品分析：应用于环境监测、污染治 理等领域
微流控芯片技术：实现样品的微型化和快 速分析
智能化、自动化技术：提高分析效率，降 低人工操作误差
添加标题
核磁共振检测器：利用核磁共振原理，检测样品中的核磁共振信号，用于结构分析和定量分析
液相色谱分析法的操作流程
样品制备：将样品进行适当 的处理，如稀释、过滤等
样品注入：将样品注入到色 谱柱中
色谱分离：样品在色谱柱 中分离，根据不同组分的 性质和亲和力进行分离
检测器检测：样品经过检 测器时，检测器对样品进 行检测，得到相应的信号பைடு நூலகம்
,
汇报人：
目录
01 添 加 目 录 项 标 题 03 液 相 色 谱 分 析 法 的
技术原理
05 液 相 色 谱 分 析 法 的 优缺点
02 液 相 色 谱 分 析 法 的 概述
04 液 相 色 谱 分 析 法 的 应用实例
06
液相色谱分析法的 发展趋势和未来展
望
Part One
单击添加章节标题
数据处理：对检测到的信号 进行处理，得到样品的色谱 图和定量结果
结果分析：根据色谱图和定 量结果，对样品进行分析和 鉴定
Part Four
液相色谱分析法的 应用实例
在药物分析中的应用
药物稳定性研究：研究药物 在储存过程中的稳定性
药物成分分析：分析药物中 的有效成分、杂质等
药物质量控制：控制药物的 质量，确保药物的安全性和
液相色谱分析法的研究热点和前沿技术
超高效液相色谱技术：提高分离效率，降 低检测限
生物样品分析：应用于生物医药、食品安 全等领域
质谱联用技术：提高检测灵敏度和准确性
环境样品分析：应用于环境监测、污染治 理等领域
微流控芯片技术：实现样品的微型化和快 速分析
智能化、自动化技术：提高分析效率，降 低人工操作误差
添加标题
核磁共振检测器：利用核磁共振原理，检测样品中的核磁共振信号，用于结构分析和定量分析
液相色谱分析法的操作流程
样品制备：将样品进行适当 的处理，如稀释、过滤等
样品注入：将样品注入到色 谱柱中
色谱分离：样品在色谱柱 中分离，根据不同组分的 性质和亲和力进行分离
检测器检测：样品经过检 测器时，检测器对样品进 行检测，得到相应的信号பைடு நூலகம்
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
高效液相色谱法(HPLC) ppt课件
此法在杂环类药物的鉴别实验中有广泛应用。
ppt课件
32
流动相选择该注意的几点问题
1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微 量杂质长期积聚而损坏色谱柱；
2、避免流动相与固定相发生相互作用而使 柱效下降或损坏柱子；
3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防 止产生沉淀并在柱中沉积；
4、流动相同时还应满足检测器的需求。
高效液相色谱法 （HPLC）
ppt课件
1
色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。
• 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分
在最佳条件下得以分离。
ppt课件
10
四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 •
• 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固 定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
ppt课件
32
流动相选择该注意的几点问题
1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微 量杂质长期积聚而损坏色谱柱；
2、避免流动相与固定相发生相互作用而使 柱效下降或损坏柱子；
3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防 止产生沉淀并在柱中沉积；
4、流动相同时还应满足检测器的需求。
高效液相色谱法 （HPLC）
ppt课件
1
色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。
• 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分
在最佳条件下得以分离。
ppt课件
10
四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 •
• 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固 定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
《液相色谱》PPT课件
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
34
Shimadzu Corporation
色谱柱
ODS柱的使用注意点：
1）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 3）流动相PH使用范围为2～7.5
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
Shimadzu Corporation
返回
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进样器
▪ 自动进样器 ▪ 手动进样器
原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
Shimadzu Corporation
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手动进样器的原理图
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
( column : ODS type )
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Shimadzu Corporation
梯度洗脱
95%
浓 度
MeOH
30%
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
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Shimadzu Corporation
梯度洗脱：
优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和 提高分离精度
Shimadzu Corporation
装填状态
进样状态 返回
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进样体积与响应值关系
检
测
器
响 应
部分注入
值
定量管体积的一半
全量注入 3倍定量管体积
HPLC Busin2e0s2s1D/e7p/t21
Shimadzu Corporation
色谱概论和经典液相色谱法PPT课件
04
液Байду номын сангаас色谱法的实验技术
实验前的准备
仪器准备
试剂准备
实验设计
安全措施
确保液相色谱仪、检测器、 泵、进样器等设备处于良好 工作状态，并进行必要的校
准和维护。
根据实验需求，准备适量的 流动相、固定相、样品等，
确保试剂的质量和纯度。
根据研究目的和目标化合物 性质，设计合理的色谱条件， 包括流动相组成、流速、柱
结合免疫分析的高特异性和液相色谱的高分离性能，实现对生
物样品中目标分子的快速、准确分析。
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定性分析
根据色谱图和检测器信号， 结合已知化合物的保留值或 光谱数据，对未知化合物进 行定性分析。
定量分析
通过外标法、内标法或标准 加入法等方法，依据色谱图 中的峰面积或峰高，对目标 化合物进行定量分析。
分离效果评估
根据分离后的色谱图，评估 色谱柱的分离效果、柱效等 指标，为实验条件的优化提 供依据。
快速分析
通过改进色谱柱和检测器技术，缩短分析时间和 提高检测速度，提高分析效率。
微型化
发展微型化色谱柱和微型化检测器，降低样品消 耗和试剂消耗，实现绿色环保分析。
超高效液相色谱法的研究进展
高灵敏度检测
利用新型检测器技术，提高检测灵敏度和选择性，实现对低浓度 样品的有效分析。
宽分离范围
发展多模式超高效液相色谱技术，实现宽分离范围和高分离效率的 分离分析。
在食品分析中的应用
食品添加剂分析
液相色谱法用于检测食品 中添加剂的种类和含量， 确保食品添加剂的安全使 用。
营养成分分析
通过液相色谱法对食品中 的营养成分进行分析，了 解食品的营养价值，指导 消费者合理选择食品。
《液相色谱法S》课件
根据分析需求，选择合适的流动相，并进行安装 。
调试仪器参数
根据实验条件，调整仪器参数，如流速、检测波 长等。
液相色谱法的实验操作
泵压设置
根据流动相的特性，设置 合适的泵压，确保流动相 稳定流动。
进样操作
将处理好的样品注入色谱 柱，开始进行分析。
数据采集
实时监测色谱图，记录所 需数据。
数据处理与分析
兽药残留检测
液相色谱法可检测动物性食品中兽药残留，防止兽药过量使用对人 体造成危害。
在环境监测中的应用
水质检测
01
液相色谱法可用于检测水体中的有机污染物、重金属离子等有
害物质。
大气污染监测
02
液相色谱法可分析空气中的挥发性有机物、气态污染物等，评
估大气环境质量。
土壤污染检测
03
液相色谱法可检测土壤中的农药残留、重金属等有害物质，为
固定相的粒径和装填密度也会影响分离效果，粒 径越小，装填密度越高，分离效果越好。
检测器
检测器用于检测色谱柱流出的组 分。
常用的检测器有紫外可见吸收光 谱、荧光光谱、质谱等，根据不 同检测需求选择合适的检测，需要选择 高灵敏度和宽线性范围的检测器
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农药残留和营养 成分等。
CHAPTER 02
液相色谱法的基本构成
色谱柱
色谱柱是液相色谱法的核心部件，用于分离样品中的不同组分。
常用的色谱柱材料有硅胶、氧化铝、活性炭等，根据不同分离需求选择合适的色谱 柱。
色谱柱的粒径和长度也会影响分离效果，粒径越小，长度越长，分离效果越好。
流动相
流动相是携带样品通过色谱柱 的介质，其性质会影响分离效 果。
调试仪器参数
根据实验条件，调整仪器参数，如流速、检测波 长等。
液相色谱法的实验操作
泵压设置
根据流动相的特性，设置 合适的泵压，确保流动相 稳定流动。
进样操作
将处理好的样品注入色谱 柱，开始进行分析。
数据采集
实时监测色谱图，记录所 需数据。
数据处理与分析
兽药残留检测
液相色谱法可检测动物性食品中兽药残留，防止兽药过量使用对人 体造成危害。
在环境监测中的应用
水质检测
01
液相色谱法可用于检测水体中的有机污染物、重金属离子等有
害物质。
大气污染监测
02
液相色谱法可分析空气中的挥发性有机物、气态污染物等，评
估大气环境质量。
土壤污染检测
03
液相色谱法可检测土壤中的农药残留、重金属等有害物质，为
固定相的粒径和装填密度也会影响分离效果，粒 径越小，装填密度越高，分离效果越好。
检测器
检测器用于检测色谱柱流出的组 分。
常用的检测器有紫外可见吸收光 谱、荧光光谱、质谱等，根据不 同检测需求选择合适的检测，需要选择 高灵敏度和宽线性范围的检测器
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农药残留和营养 成分等。
CHAPTER 02
液相色谱法的基本构成
色谱柱
色谱柱是液相色谱法的核心部件，用于分离样品中的不同组分。
常用的色谱柱材料有硅胶、氧化铝、活性炭等，根据不同分离需求选择合适的色谱 柱。
色谱柱的粒径和长度也会影响分离效果，粒径越小，长度越长，分离效果越好。
流动相
流动相是携带样品通过色谱柱 的介质，其性质会影响分离效 果。
高效液相色谱HPLC基本原理ppt课件
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38
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39
3）示差折光检测器
原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样 品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束 （通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两 束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录， 该信号代表样品的浓度。
为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温 度变化敏感，且不适于梯度淋洗。
当采用粘度较大的试剂，如CC4，CH3OH, 丙酮，二氧杂环已烷、THF 等。 填充方法：
填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中， 然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要 求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。
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22
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23
3. 色谱柱
1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。 柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱 柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为： 平衡密度法：
即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的 匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等； 非平衡密度法：
Deuterium lamp
Lens
Lens system Holmium filter Detector cell
Optical slit
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Diode Array
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PHOTODIOD E
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测器、记录仪等几个部分组成。
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HPLC各模块的工作原理及维护
关于溶剂
• 所有溶剂应为HPLC级，水应为二次超纯水； • 所有溶剂应经过过滤。过滤水应使用一次性水相/有机
相滤膜。 • 所有溶剂应经过超声脱气； • 水易滋生藻类，避免直接照射，过滤水最好使用不要
超过两天； • 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂； • 避免使用强酸、强碱或有机氯等腐蚀性溶剂； • 在溶剂瓶中的溶剂过滤头可能会堵塞，必要时小心拿
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Agilent 1260 HPLC 结构及 简单操作
1
Agilent 1260 HPLC 工作原理及简单操作 • 内容：
一、 HPLC各模块的原理； 二、开机/关机操作； 三、软件；
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一 、 HPLC各模块工作原理及维护
HPLC： 高效液相色谱仪（High Performances
Liquid Chromatography）。 由储液器、泵、进样器、色谱柱、检
blinking
仪器LED 状态显示
电源开关显示
11
开/关机操作
整台液相色谱仪的维护
每次用过仪器后必须做!
1. 在使用过含盐缓冲液后必须清水冲洗泵15分钟，此时 必须打开排放阀，不能使废液进入色谱柱。
2. 关上排放阀，用90%+10%的水、甲醇溶液冲洗整个系 统，时间为15～20分钟，流量1ml/min。本步骤主要是冲 洗干净系统内其他含盐的部位。
10Leabharlann 开机/关机操作指示灯状态
每个部件接通电源后 LED灯显示绿色
6种LED仪器状态：
关机 power off 准备进样 power on 没准备好Not Ready 运行Run 故障Error 驻留Resident
Blink
黑Black 黑Black 黄Yellow 绿Green 红Red 黄闪烁Yellow
4，打开Seal Wash清洗液开关， 清洗10min。
5，打开清洗阀，排除系统中的 气泡，平衡差不多30min.
6, 拧上清洗阀，将流量设为所 需流速，平衡30min即可以打 样。
• 关机操作： 1，如果使用了缓冲溶液流动相
应先用水冲洗系统30min。 2，用纯有机相冲洗系统30min。 3，在工作站上关闭各个模块。 4，退出工作站，关闭计算机。 5，关闭LC各个模块的电源。
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HPLC各模块的工作原理及维护
检测器—FLD
•FLD是一款具有高度灵敏度和高 度选择性的检测器。其激发光源 是氙灯，此灯不需要预热。
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二、 开机/关机操作
• 开机操作：
1，打开计算机。
2，打开LC各模块的电源，等待 仪器自检完毕，1-2min。
3，双击桌面上“Instrument 1 Online”图标，进入化学工作 站,在工作站打开各工作模块。
气泡） ---流动相（排气泡）。 • 3、编辑数据采集方法 • 4、单针及序列 • 5、样品采集 • 6、图谱优化 • 7、报告
13
样品前处理
• 一、提取 • 1、称样：5.0g • 2、提取：高氯酸，超声波，水浴，离心，调pH。 • 3、萃取：异丙醇-乙酸乙酯 • 4、浓缩：旋转蒸发仪 • 二、净化 • 1、活化：10ml甲醇、3ml水、3ml磷酸二氢钠、3ml水 • 2、上样：提取液加入柱中，弃去流出液。 • 3、淋洗：4ml水、4ml乙醇 • 4、洗脱：6ml乙醇+浓氨水，氮吹干。 • 三、测定前准备 • 流动相溶液试样残渣，过膜，得待测液。
3. 用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为 1ml/min。本步骤主要是保护色谱柱。
4. 如果未使用缓冲液，上面1、2两步骤可免去，直接用 纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/min。
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• 三、实验操作及软件 • 1、开机、开软件 • 2、冲柱子：95%甲醇（排气泡）---5%甲醇（排
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HPLC各模块的工作原理及维护
自动进样器
•样品要干净、经过过滤。 洗针：把样品残留降低到最 小限度
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HPLC各模块的工作原理及维护
关于恒温柱箱
• 控制范围：最高80ºC，低温低于 室温10ºC。
• 左右温度应保持一致。 • 一定要关闭前面板。
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HPLC各模块的工作原理及维护
检测器—DAD
• 在没有样品分析任务时要关闭氘灯， 以延长氘灯的使用寿命,但是也不要频 繁的开关,这样也会影响寿命。同时， 打开灯需要预热10min 左右
下用强酸（35%硝酸）浸泡时，用水冲洗，但不要使 用超声处理。
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HPLC各模块的工作原理及维护
泵的注意事项
1，溶剂的过滤、脱气；
2，避免使用腐蚀性溶剂；
3，在满足分析的前提下，尽可能使用 较低的流速—较低的系统压力。
• 四元泵： 缓冲溶液要放在A、D通道，以 避免盐颗粒析出。
建议A通道：水； B、C通道： 有机溶剂； D通道： 缓冲溶液。
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HPLC各模块的工作原理及维护
关于溶剂
• 所有溶剂应为HPLC级，水应为二次超纯水； • 所有溶剂应经过过滤。过滤水应使用一次性水相/有机
相滤膜。 • 所有溶剂应经过超声脱气； • 水易滋生藻类，避免直接照射，过滤水最好使用不要
超过两天； • 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂； • 避免使用强酸、强碱或有机氯等腐蚀性溶剂； • 在溶剂瓶中的溶剂过滤头可能会堵塞，必要时小心拿
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Agilent 1260 HPLC 结构及 简单操作
1
Agilent 1260 HPLC 工作原理及简单操作 • 内容：
一、 HPLC各模块的原理； 二、开机/关机操作； 三、软件；
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一 、 HPLC各模块工作原理及维护
HPLC： 高效液相色谱仪（High Performances
Liquid Chromatography）。 由储液器、泵、进样器、色谱柱、检
blinking
仪器LED 状态显示
电源开关显示
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开/关机操作
整台液相色谱仪的维护
每次用过仪器后必须做!
1. 在使用过含盐缓冲液后必须清水冲洗泵15分钟，此时 必须打开排放阀，不能使废液进入色谱柱。
2. 关上排放阀，用90%+10%的水、甲醇溶液冲洗整个系 统，时间为15～20分钟，流量1ml/min。本步骤主要是冲 洗干净系统内其他含盐的部位。
10Leabharlann 开机/关机操作指示灯状态
每个部件接通电源后 LED灯显示绿色
6种LED仪器状态：
关机 power off 准备进样 power on 没准备好Not Ready 运行Run 故障Error 驻留Resident
Blink
黑Black 黑Black 黄Yellow 绿Green 红Red 黄闪烁Yellow
4，打开Seal Wash清洗液开关， 清洗10min。
5，打开清洗阀，排除系统中的 气泡，平衡差不多30min.
6, 拧上清洗阀，将流量设为所 需流速，平衡30min即可以打 样。
• 关机操作： 1，如果使用了缓冲溶液流动相
应先用水冲洗系统30min。 2，用纯有机相冲洗系统30min。 3，在工作站上关闭各个模块。 4，退出工作站，关闭计算机。 5，关闭LC各个模块的电源。
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HPLC各模块的工作原理及维护
检测器—FLD
•FLD是一款具有高度灵敏度和高 度选择性的检测器。其激发光源 是氙灯，此灯不需要预热。
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二、 开机/关机操作
• 开机操作：
1，打开计算机。
2，打开LC各模块的电源，等待 仪器自检完毕，1-2min。
3，双击桌面上“Instrument 1 Online”图标，进入化学工作 站,在工作站打开各工作模块。
气泡） ---流动相（排气泡）。 • 3、编辑数据采集方法 • 4、单针及序列 • 5、样品采集 • 6、图谱优化 • 7、报告
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样品前处理
• 一、提取 • 1、称样：5.0g • 2、提取：高氯酸，超声波，水浴，离心，调pH。 • 3、萃取：异丙醇-乙酸乙酯 • 4、浓缩：旋转蒸发仪 • 二、净化 • 1、活化：10ml甲醇、3ml水、3ml磷酸二氢钠、3ml水 • 2、上样：提取液加入柱中，弃去流出液。 • 3、淋洗：4ml水、4ml乙醇 • 4、洗脱：6ml乙醇+浓氨水，氮吹干。 • 三、测定前准备 • 流动相溶液试样残渣，过膜，得待测液。
3. 用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为 1ml/min。本步骤主要是保护色谱柱。
4. 如果未使用缓冲液，上面1、2两步骤可免去，直接用 纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/min。
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• 三、实验操作及软件 • 1、开机、开软件 • 2、冲柱子：95%甲醇（排气泡）---5%甲醇（排
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HPLC各模块的工作原理及维护
自动进样器
•样品要干净、经过过滤。 洗针：把样品残留降低到最 小限度
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HPLC各模块的工作原理及维护
关于恒温柱箱
• 控制范围：最高80ºC，低温低于 室温10ºC。
• 左右温度应保持一致。 • 一定要关闭前面板。
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HPLC各模块的工作原理及维护
检测器—DAD
• 在没有样品分析任务时要关闭氘灯， 以延长氘灯的使用寿命,但是也不要频 繁的开关,这样也会影响寿命。同时， 打开灯需要预热10min 左右
下用强酸（35%硝酸）浸泡时，用水冲洗，但不要使 用超声处理。
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HPLC各模块的工作原理及维护
泵的注意事项
1，溶剂的过滤、脱气；
2，避免使用腐蚀性溶剂；
3，在满足分析的前提下，尽可能使用 较低的流速—较低的系统压力。
• 四元泵： 缓冲溶液要放在A、D通道，以 避免盐颗粒析出。
建议A通道：水； B、C通道： 有机溶剂； D通道： 缓冲溶液。