蛋白表达纯化试验步骤
[应用]GST蛋白表达、纯化步骤
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Protein Expression Protocol:1.Transform control construct and tag-fusion-constructs into E.coli BL21(DE3) competent cell, growovernight;2.Inoculate single colony to 2~3 ml LB medium, and grow at 37 degree for 7~10 hours or overnight;3.1:100 inoculate to 3 ml LB, bacteria grow for 2-3 hours at 37 degree, then follow 1:2000 add 1 MIPTG to induce protein expression overnight at 22 degree;4.Spin down bacteria at 12000 rpm for 1 min, wash with 1 ml ddH2O, add 100 ul 1x PBS toresuspend the deposition, then sonicate 3~5 min on ice;5. Spin down at 12000 rpm for 10min, separate the supernatants and deposition;6. Boiling with loading buffer at 100 degree for 5min, Spin down at 12000 rpm for 5min, 12%SDS-PAGE;7. After confirmed protein expressed in supernatants, increase the volume of bacteria medium. 1:100inoculate to 100 ml LB, grow bacteria for 2-3 hours at 37 degree;then follow 1:2000 add 1 M IPTG to induce protein expression overnight at 22 degree;8. Spin down bacteria at 8000 rpm 4 degree for 5 min, wash with 10 ml ddH2O, add 5 ml 1x PBS toresuspend the deposition, then sonicate 60 min on ice;9. Spin down at 12000 rpm 4 degree for 10min, separate the supernatants and deposition;10.Prepare the supernatants for purification.蛋白表达注意事项：1. E.coli BL21比DH5α生长要快，固体培养基上10～12小时即可长斑，液体培养基中8小时后即可生长成较大密度；切勿培养时间过长，防止菌体老化；2.为了后续实验的便利，应尽量减少包涵体的形成。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。
这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。
下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。
一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。
常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。
不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。
例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。
2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。
常用的表达载体有质粒、病毒载体等。
质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。
3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。
转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。
转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。
4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。
常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。
二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。
细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。
分离方法包括离心、电泳、柱层析等。
2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。
常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。
3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。
例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。
这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。
三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。
例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。
蛋白质的表达纯化
完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容
器。
蛋白质的表达纯化
5.将底座的开关打开， 并向外拨动透明的架子， 使中间空隙增大，放入 电极架。
6.如图所示将电极架往下 压（约1~2mm），使底面 完全接触。
蛋白质的表达纯化
7.关上底座开关。
8.放入电泳槽内，加上加样 架加样。注意加样架与刚才 制胶所用的梳子齿数必须一 致。
• 3. 细胞裂解液3mL以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流 出液。
• 4.洗脱杂蛋白：用50mL洗涤缓冲液UWB以10-15mL/h流速洗柱， 分别取10ul洗涤开始与结束时的样品用于SDS-PAGE 分析。
• 5.洗脱目标蛋白：用10mL洗脱缓冲液洗柱，每管0.5－1 mL， 共收集6－10管，分别取1蛋0白u质l样的表品达纯用化于SDS-PAGE 分析。
蛋白质的表达纯化
实验步骤
• 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 • 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌
BL21菌株于5mL LB液体培养基中 （含100ug/mL 氨苄 青霉素），37℃震荡培养过夜。 • 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉 素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 • 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h. • 4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于20℃或-70℃冰箱中。
蛋白质的表达纯化
• 3．制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配
方如下：
30%Arc- Tris-HCl H2O
Bis
大肠杆菌表达蛋白的纯化方法
大肠杆菌表达蛋白的纯化方法
1.培养大肠杆菌，使其表达目标蛋白。
2. 收集菌液，离心去除细胞。
3. 用磷酸盐缓冲液洗涤菌体，破坏细胞壁并释放目标蛋白。
4. 通过离心去除细胞壁碎片和杂质。
5. 用柱层析技术（如亲和层析、离子交换层析或凝胶过滤层析）将目标蛋白分离纯化。
6. 最终通过紫外线检测纯度和质量，得到高纯度的目标蛋白。
该方法简单、高效，适用于大规模生产和工业化生产。
同时，该方法还可根据不同蛋白的特性进行优化和改进，以满足不同需求。
- 1 -。
目的蛋白表达与纯化protocol
目的蛋白表达与纯化protocol小量表达测试：1、挑一单克隆到3ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。
2、保种：700μl菌液+400μl 80%灭菌甘油，充分混匀后置于-800C保存。
3、扩大培养：以1:100接菌，即取50μl菌液到5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养2h~3h至OD值达到0.6。
4、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。
对照5、另取1ml菌液于一新的试管中，加1/1000 IPTG（终浓度为1mM），370C，220rpm振荡培养3h后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。
370C样品6、其余约3ml菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：12000rpm 离心1min，弃尽上清，-200C保存。
160C样品7、Bugbuster分别处理上述三个样品，取20μl总蛋白，其余离心后分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳鉴定，上样顺序为：对照370C样品160C样品总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀若目的蛋白在上清中有表达，则可以进行大量表达与纯化，具体操作如下。
大量表达：1、挑一单克隆到7.5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。
注意：此步用50ml离心管摇菌！2、扩大培养：以1:100接菌，即取将上述7.5ml菌液全部接到750ml TB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养4h~5h至OD值达到1.0。
3、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。
（对照）4、其余约菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：6000rpm、40C离心10min，弃尽上清，取一点沉淀做表达鉴定（160C样品），其余-200C 保存。
(完整版)1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验
第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。
调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。
分装成15瓶（每瓶200ml）。
2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200µlAMP（1:1000）、60µl菌液。
37℃过夜。
第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200µlAMP，摇床培养1小时左右。
2、诱导（超净台）加40µlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。
25℃摇床培养4小时。
3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。
注意配平。
4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF）。
将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。
离心收集上清液。
600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。
超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。
探头浸没于菌液中，不可伸入过长。
注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。
5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。
将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。
第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20µl，留电泳。
2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。
3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20µl，留电泳。
用洗脱液调零，测OD280。
（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。
大肠杆菌系统蛋白表达纯化流程
大肠杆菌系统蛋白表达纯化流程英文回答：Introduction:The expression and purification of proteins in Escherichia coli (E. coli) is a commonly used method in molecular biology research. E. coli is a well-studied and easily manipulated organism, making it an ideal host for protein expression. In this article, we will discuss the general workflow for the expression and purification of proteins in E. coli.Expression of the target protein:1. Gene cloning: The first step is to clone the gene encoding the target protein into an expression vector. This vector contains a promoter that drives the expression of the gene in E. coli.2. Transformation: The recombinant expression vector is then introduced into E. coli cells through a process called transformation. This results in the production of many E. coli cells carrying the target gene.3. Expression induction: The transformed E. coli cells are grown in a suitable culture medium until they reach a specific growth phase. At this point, expression of the target gene is induced by adding a chemical inducer or by changing the growth conditions.4. Protein expression: The induced E. coli cells produce the target protein, which can either be present in the soluble fraction or form insoluble aggregates called inclusion bodies.Protein purification:1. Cell lysis: The E. coli cells are harvested by centrifugation and then lysed to release the proteins. Various methods can be used for cell lysis, such as sonication, freeze-thaw cycles, or enzymatic digestion.2. Removal of cell debris: The cell lysate is then clarified by centrifugation to remove cell debris and insoluble material. The resulting supernatant contains the target protein along with other cellular components.3. Protein purification: Different purification techniques can be employed to isolate the target protein from the crude lysate. These techniques include affinity chromatography, ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, and hydrophobic interaction chromatography. The choice of purification method depends on the properties of the target protein.4. Protein concentration: After purification, thetarget protein is often in a dilute solution. Concentration can be achieved by using techniques such as ultrafiltration or precipitation with ammonium sulfate.5. Protein characterization: The purified protein should be characterized to confirm its identity and purity. Techniques such as SDS-PAGE, western blotting, and massspectrometry can be used for protein analysis.Conclusion:The expression and purification of proteins in E. coli is a well-established and widely used technique in molecular biology research. The workflow involves gene cloning, protein expression, cell lysis, protein purification, concentration, and characterization. By following this general procedure, researchers can obtain purified proteins for further analysis and functional studies.中文回答：简介：大肠杆菌（E. coli）中的蛋白表达和纯化是分子生物学研究中常用的方法。
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1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽, 要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、R T-PCR,KO［酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5z感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株, 挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3) 、Rosetta gami(DE3) 、Bl21 codon(DE3) 等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至0。
=左右，加入IPTG,浓度梯度从25卩M到1m 37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。
甘油是用卩m过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽, 不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50卩l 一管，每次用一管，避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件 21)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=约5h左右,视菌种1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。
9、如有上清表达, 则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=约5h左右,视菌种的活性而异, 也可过夜摇菌。
2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm 摇至OD=左右（约~3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。
）注：菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
拿起锥形瓶对光摇动, 看到有大量云雾状菌体即可。
另一方法是, 将手指放在瓶底晃动, 看不清手指为宜, 不过此法宜受气泡影响。
3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18。
左右）,转速140rpm左右。
4）将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。
加入20mM PBS洗一遍后用平衡缓冲液重悬。
每250ml 菌液用30 ml 到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。
可用4支50ml 的离心管同时离心, 但是, 离心管要重复使用, 用完后洗净保存。
10、超声波裂解。
1）用6mm变幅杆，35%功率,工作,7s休息,50min即可。
注意：1. 要冰浴。
2.要随时观察裂解情况以防意外。
3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。
一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。
4. 正常声音为：孜孜声, 尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因, 要及时调整。
溶液由浑浊变清透, 由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。
5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。
注意：1. 如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF）,PMSF 工作浓度为1%。
2.如不能判断是否裂解完全,就按上述条件裂解60 分钟,60 分钟足够裂解。
11 、取得上清1）将破碎好的溶液收集到50ml 离心管中。
10000rpm,15min,4 °离心。
沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。
轻轻的将上清倒出,尽量不要倒出沉淀。
（此时可以测量一下pH值,pH值最好在左右。
平衡buffer的pH是左右，裂解后上清就会在左右。
） 12、纯化上清--- 摸洗脱条件。
1）镍柱处理。
将1ml 镍柱吸入空层析管中, 待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。
2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上,并将过柱的样品重复上样3次。
（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。
）取20卩I过柱后的样品，以备跑胶。
3）分别加20mM 40mM 60mM 80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。
每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。
每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。
注意：理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。
实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了。
4）加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。
上样量为（将前面的单独接入EP管,再将后面的4ml接入另外两个EP管）,留跑胶样品。
5）加MES将NI柱重生。
MES加10ml,流完后再加10ml Miliq H2O 。
流完后保存于2倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6 次。
（尿素可能对NI 柱有损伤。
）注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正确,pH对挂柱及洗脱影响较大。
镍柱所用溶液MES勺ph=,其余Equilibration Buffer pH= , 上清pH= ,Wash Buffer pH= ,Elution Buffer pH= 。
13、跑胶验证。
1）跑2块的PAGE交,把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。
2）跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES3）300V快速压胶5min左右,160V分离样品50min左右。
（也可以300V,30min,只是图没有160V好看。
）4）考马斯亮蓝染色。
一般染色2h 即可。
5）脱色。
先用脱色剂1 脱15min, 再用脱色剂2脱过夜。
14、纯化上清--- 收集目的蛋白1）将重生的镍柱再次平衡（即加Equilibration Buffer 3ml）。
2）重复步骤12中的操作，只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。
15、跑胶验证。
同步骤13 这次胶图要跑的漂亮一点（用160V）, 保存好。
16、透析。
1）配制2L透析液（配方见附件1）,并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。
2）透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min,用MILIQ H20充分洗净。
3）用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢）, 将洗脱的蛋白样品加入其中，置入提前预冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCI）中。
冰浴下轻微磁力搅拌20min 后置入4°冰箱后换液。
透析3 次即可。
注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。
冰浴以防活性降低。
17、浓缩。
1）将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中,用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。
2）30min 后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除, 加入新的固体聚乙二醇。
3）每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。
4）透析袋用完后, 洗净, 保存于20%乙醇中4°存放。
注意：浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状，透明度较高不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。
如果看不到，可根据自己估计的蛋白量留1-2ml 体积。
用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶液分装后-20 度保存。
18、超滤法浓缩、透析蛋白。
使用超滤法就可省去16、17 两步。
1）将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。
2）配平。
3）7400g,30min,4 。
离心，结束时4ml变为1ml左右。
浓缩4倍。
可根据需要选择不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。
可以几次的Elution 液一起浓缩。
4）加入需要的蛋白储存液至4ml, 离心。
重复操作可以使Elution 液逐渐换为所需的蛋白储存液。
蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaO或适当浓度和pH的tris-HCI 溶液。
如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。
5）收集。
将溶液从超滤管中收集到EP管中,标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白浓度（测量后）, 制备日期。
注: 超滤管的使用方法见附件 419、蛋白浓度测定。
见附件 320、蛋白活性测试。
转染细胞测量荧光。
21、抗原处理。
蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。
22、注射兔子。
选择合适的注射方式和合适的免疫程序。
23、收集免疫血清。
提取抗体。
24、抗体效价评定。
附件1所需溶液配方:1）20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCI pH试剂名称NaH2PO4-2H2O Na2HPO4-12H2O NaCI用量（g）1L2）EquiIibration Buffer（平衡缓冲液）: PBS with 10 mM 咪唑pH3）Wash Buffer（清洗缓冲液）: PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑pH4）EIution Buffer（洗脱缓冲液）: PBS with 250 mM 咪唑pH5）MES（再生缓冲液）:20 mM 2-（N-morpholine）-ethanesulfonic acid, M sodium chIoride; pH 。
即MES+NaCI.6)透析袋处理液: 2%(w/v) 碳酸氢钠和1 mmol/L EDTA 7)透析液:20mM PBS+50 mM NaCl试剂名称NaH2PO4-2H2O Na2HPO4-12H2O NaCl用量(g)1LTIPS:1 —4的溶液可以一起配制。
先配10ml 8M的咪唑。
再配1L的PBS用500ml水将试剂溶解,取两个50ml 和一个150ml 分别加到两个100ml 瓶子和一个500ml 瓶子中,作为Wash Buffer 、Elution Buffer 和Equilibration Buffer, 再向其分别加入适当体积的8M 咪唑。
最后, 定容。
Wash Buffer 、Elution Buffer 各配了100ml,Equilibration Buffer 配了300ml。
PBS配了500ml。
附件2包涵体检测1.摇10ml菌，加％葡萄糖和相应抗性。
培养至0D600后离心加入新的培养基和相应浓度的IPTG低温(16-25度)诱导过夜(也可不离心，在原来LB中直接加IPTG)。
在离心前取500卩l菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照。
正负对照不用超声波裂解，直接煮沸10min 跑胶。
2.诱导完成后，用2ml EP管6000rpm,2min,4 度，收集10ml菌液。