水产动物药敏实验操作流程
药敏试验操作方法
药敏试验操作方法
药敏试验操作方法一般包括以下步骤：
1. 菌株选取：选择适当的病原菌株进行测试，一般使用已知药敏性的参比菌株作为对照。
2. 菌液的制备：将菌株接种到培养基上培养，培养至菌量合适后，采用生理盐水调制成适宜浓度的菌悬液。
3. 菌液的稀释：取一定数量的菌悬液，根据草浆法或直接法进行适当稀释，使菌量达到目标细菌的浓度，一般为0.5-2×10^8个CFU/mL。
4. 抗生素的制备：按照制备好的抗生素试纸或试剂盒的说明，将抗生素溶液或药片溶解成合适浓度的抗生素溶液。
5. 稀释菌液的扩散：将已制备好的菌液均匀涂布在含有良好的抗生素稀释浓度梯度的培养基上。
6. 培养基的培养：将涂布了菌液的培养基在合适的温度（通常为35-37）下培养约16-20小时。
7. 结果的解读：通过观察培养基上微生物的生长情况，判断细菌对抗生素的敏
感性。
一般，对抗生素敏感细菌培养后，会在培养基上形成清晰的抑菌圈，直径会随着对菌体敏感程度的增加而扩大。
8. 数据记录和分析：记录抗生素的名称、浓度、菌株信息、抗菌圈直径等数据，并进行统计和分析。
需要注意的是，药敏试验的具体操作方法可能会因实验目的、试验样本、试剂等因素而有所不同，因此在进行药敏试验前应详细阅读试剂盒或试纸的使用说明，并按照说明书操作。
水产动物疾病学实验指导书
二、玻璃器皿的清洗方法 （详细内容见《微生物学实验》）
一般包括如下内容： 1．新玻璃器皿的洗涤方法 2．使用过的玻璃器皿的洗涤方法包括 (1) 试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等洗涤。 (2) 玻璃吸管的洗涤 (3) 载玻片与盖玻片的洗涤
三、培养皿的包装
1．培养皿的包装 2．吸管的包装 3．试管和三角烧瓶等的包装
保存，备用。
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实验三 人工感染试验
一、目的要求 掌握对水产动物人工感染的操作方法。 二、基本原理 将从水产动物病灶部位分离的纯培养，分别接种于新鲜的琼脂斜面上， 28℃恒温培养 16～20h 后，用无菌生理盐水洗下菌苔，制成菌悬液，以 McF3 管（或在显微镜下用血球计数板直接计数，也可用光比浊计数法计数）对菌悬 液浓度进行估算，使得最后菌悬液的浓度为 1~9×108 cfu /ml。后接种到健康 水产动物中，进行感染试验。在试验期间（一般为 1～2 周）观察被感染的水 产动物发病情况是否与自然发病症状一致，旨在进一步确定所分离的细菌是否 为该种水产动物的致病菌。 人工感染试验的接种方法有浸泡、口服、注射、涂抹等。究竟选用哪一种 方法最合适，需要根据不同疾病类型和可能的侵入途径而定。如体表的病，可 采用浸泡法；是体内的病，可采用口服、注射等。本实验着重介绍注射法。
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为病原菌，会污染环境。 （2）视选择的动物及注射途径之不同而选用不同长短大小的针头，并先
试验是否通气或漏水（由于市售针头大小的编号比较混乱，本实验一般用老编 号或直接用长短表示）。
（3）消毒时将筒心从针筒中拔出，用一块纱布先包针筒，后包筒心，并 使两者在纱布内的方向一致，包好后，置煮沸消毒器中。选好的针头包以纱布， 置煮沸消毒器之另一端。同时放入镊子一把，加入自来水，以淹没注射器为度， 煮沸消毒 10 分钟。
快速学会做药敏试验
快速学会做药敏试验一、药敏实验在临床诊断中应用意义：1、在畜牧产业中，各种细菌性疾病很容易给养殖业造成经济损失，使用抗生素防治细菌性疾病成为经常性工作。
但在养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗生素，造成细菌产生耐药性问题正变得越来越突出，使抗菌药的疗效降低，疗程延长，还使死亡率升高和治疗费用增加，给养殖业带来巨大经济损失。
2、耐药菌株还可能将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康造成潜在威胁。
如何避免滥用抗生素，药敏试验在临床诊断中的应用就显得重要了。
3、药敏实验可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药、灵活选药。
可以在本地区容易买到的药品中选出最敏感的药物，既能缩短病程，又能避免盲目用药，减少费用。
4、因为药敏实验在动物体外进行，操作相对简单，成本相对较低，既经济又快速有效，可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行，在生产中具有非常重要现实意义。
二、药敏试验的步骤：1、琼脂平板制备按照营养琼脂干粉说明来进行稀释，稀释后琼脂放在微波炉里进行加热，加热后琼脂移至超净工作台中，静置待温度降至50℃（手指能接受的最高温度）左右时，开始倒平板，内径225px平皿每个平皿倒入约10ml琼脂液，倒入后迅速混匀铺满平皿底部。
2、药液制备：按药品使用说明书上的配料或饮水浓度配置按1g需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。
如10g药物可配50kg饲料，其换算方法为：1g本品加5000ml蒸馏水。
此溶液液即为用于做药敏试验的药液。
3、药敏纸片制备：要用质量较好的定性滤纸，用普通的打孔器打成直径6mm的圆形小纸片。
取圆纸片50片放入清洁干燥的小瓶或小平皿中，以单层牛皮纸扎口或包扎。
经15磅15-20分钟高压灭菌后，置于37℃温箱或烘箱中一天，使完全干燥。
按每张纸片饱和吸水量为0.01ml计，在上述含有50片纸片的小瓶内加入药液0.5ml，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30分钟即可。
药敏实验流程
药敏实验1.目的提供细菌对抗菌药物的敏感试验的标准采集与操作方法，选择敏感药物用于临床。
2.范围适用于实验室分离菌及常见菌的抗菌药物敏感试验。
3.采样对接人服务专家针对病死猪进行解剖根据临床症状采集相应的病料。
4.设备和材料无菌剪刀、无菌手术刀、无菌试管、无菌生理盐水、无菌平皿、三角烧瓶、酒精灯、接种环、打火机、75%酒精棉球、一次性手套、营养琼脂培养基、M-H琼脂培养基或特殊培养基、0.5标准麦氏比浊管、药敏纸片、待测病料、记号笔、眼科镊子、2ml或5ml一次性注射器、试管架、超净工作台、恒温培养箱、带刻度直尺。
5.采样及送样操作采集：病料新鲜度→无菌操作采样→有目的进行采样→保证组织完整性→独立存放到封口袋中并做好标记。
运输：采集好病料放入保温箱（泡沫纸箱+冰袋）中，冷藏即可，不可冷冻。
常见细菌分离采样部位病名样品链球菌脑、腹腔积液5.1样品的标识要求有样品编号、样品名称、样品来源、样品数量、初步诊结果抽样日期及周龄、检测项目等内容。
5.2采样数量猪一般采集3-5头，6.细菌分离在无菌操作条件下，将待测病料（含有典型临床症状部分）用平板划线分离法接种于普通营养琼脂培养基或特殊培养基上（血琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、BP琼脂等），于37℃±1℃恒温培养箱中培养18-24h后备用。
细菌在培养基上生长特点7.药敏试验操作步骤7.1制作待检菌液在超净工作台内挑取培养18-24h普通营养琼脂平板上的菌落，悬于含3ml无菌生理盐水的试管中。
混匀后与比浊管比浊，调整浊度至0.5麦氏标准（相当于1-2*10 cfu/ml）。
7.2接种细菌在超净工作台内用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余的菌液，均匀涂抹整个平板表面，最后沿平板内缘涂抹一周（用接种环密集划线法也可以）。
7.3贴药敏片将涂抹均匀的培养皿底部用记号笔做好标记，眼科镊子在酒精灯上灼烧灭菌待冷却后，镊取各种购买或自制的药敏片，分别贴于相应的位置上，用镊子轻轻按压纸片使药敏纸片与培养基表面密贴；药敏纸片应在培养基表面均匀分布，各纸片中心距离大于24mm，纸片距边缘距离大于15mm，这样一个直径90mm的培养皿可贴7个药敏纸片。
药敏实验的操作规程
药敏实验的操作规程药敏实验是一种常用的实验方法，用于测试不同药物对细菌的敏感性。
其操作规程如下：1. 准备工作a. 选择适当的培养基：根据实验目的和细菌的需求，选择适合的培养基。
常用的培养基有Muller-Hinton (MH) 培养基和血琼脂基质（Blood Agar）。
b. 准备药物：根据研究的需求，选择要测试的药物，先进行浓度调节并制备药物试液。
c. 选择试验细菌：选择需要测试的细菌菌株，可选择多种细菌进行测试。
2. 制备药物试液a. 根据药物的浓度和用途，按照配制方法将药物试液制备好。
b. 对于不同药物，可根据需要设定不同的浓度梯度。
通常使用两倍稀释法制备浓度梯度。
3. 制备细菌悬浮液a. 从培养基中取出所需菌株，并用无菌生理盐水进行洗涤，以去除残余培养基或其他杂质。
b. 将菌株悬浮于无菌生理盐水中，通过眼镜划线计数法或光密度测定法调整细菌悬浮液的浓度至合适的范围。
4. 进行测定a. 在MH培养基或血琼脂基质上均匀涂布细菌悬浮液，使其形成薄膜。
b. 将培养基上涂有菌株的培养皿分成数个区域，每个区域均加入一种药物试液。
c. 用无菌的扩菌针分别在每个区域上刺入药物试液，使药物试液与菌株接触。
d. 将培养皿孵育于适当的环境条件下，一般为37℃，孵育时间根据实验目的而定，通常为24小时。
5. 结果判读a. 在观察期间，观察每个区域的菌落生长情况。
b. 比较不同药物试液对细菌生长的影响，评定其敏感性。
c. 根据实验目的和相应参考标准，判断细菌对药物的敏感性、中等敏感性或耐药性。
6. 数据处理和分析a. 统计每个药物试液对细菌的抑菌效果，记录菌落生长情况。
b. 根据实验结果，绘制抑菌效果图或者计算药物的最小抑菌浓度（MIC）。
7. 实验注意事项a. 所有操作必须在无菌条件下进行，避免细菌的污染。
b. 实验人员必须戴上手套，避免药物对皮肤造成刺激。
c. 严格按照药物的安全操作规程进行操作，避免药物泄漏和误服。
水产动物疾病学 水产动物病理学《病理学》实验方案
罗非鱼链球菌病研究的实验方案一、实验流程采集病鱼→观察记录临床症状→分离纯化病原体→病原体的扩大培养→病原体的药敏试验↓动物回归实验↓观察记录临床症状↓病理组织分析二、具体操作步骤1.病鱼录临床症状的观察和记录记录病鱼的活动特征、外观临床症状，解剖后观察内部器官病变特征，拍照。
2. 病原体的分离纯化对具典型细菌性症状的病鱼进行现场分离，取其脑（B）、肝（L）、脾（S）、肾（K），采用平板划线法接种于BHI固体培养基中，于27-28℃培养箱中培养24-72h，拍照。
将首次分离培养基上数量呈优势的疑似病原菌落进行进一步的分离纯化培养，对其进行革兰氏染色和镜检初步确定其是否为病原菌，拍照。
3. 病原体的扩大培养取上述纯化的菌株单菌落接种于BHI液体培养基中，进行扩大纯培养。
4. 病原体的药敏试验配置固体培养基→取0.2ml菌液均匀涂布于表面→干燥5mins后每板贴5片药敏试纸，试纸之间距离不小于24mm→反转平板，4℃放30min→37℃中反转培养24h→观察抑菌圈→拍照5. 动物回归实验将扩大培养病原体的病原体经腹腔注射入罗非鱼，6天后开始每天观察发病情况，记录病鱼的活动特征、外观临床症状，解剖后观察内部器官病变特征，拍照。
跟最初的病鱼进行比较，看是否症状一致，如果一致，说明分离到的菌株是致病的病原体，如症状不一致，则病原体分离错误。
6. 病鱼病理组织分析（可选做）取病鱼的病变组织（如皮肤、脑、肝、肾脏、脾脏等）进行病理切片分析，与正常组织对比，拍照，分析病变原因。
三、作业将上述实验流程和实验结果整理，写成一篇课程作业，图文并茂。
附件：石蜡切片的制作方法一、取材用丁香粉麻醉鱼，取病变组织（如皮肤、脑、肝、肾脏、脾脏等），在Bouin 氏液固定8-24小时。
取材时应注意以下事项：1.所取材料不宜太大以0.5×0.5×0.2厘米或1.0×1.0×0.2厘米较合适。
草鱼细菌性病原体嗜水气单胞菌分离鉴定和药敏试验
2019.102018年笔者对泗阳县运河北片草鱼养殖进行了疫病监测与流行病学调查，并对具有典型症状的发病草鱼进行了病原菌株分离和鉴定，将鉴定出的嗜水气单胞菌进行了常用抗菌药物敏感性试验，旨在为嗜水气单胞菌病原引起的草鱼细菌性疾病有效检验与防控及相对应的有效治疗提供依据。
一、材料与方法1.试验材料(1)2018年4－10月在草鱼养殖场的不同发病塘口，选取具有典型发病症状草鱼进行分离，分离部位为血液，采样时间、地点、症状、API－20E 生化反应编号、菌株种类详细情况见表1。
(2)营养肉汤、营养琼脂、TCBS 琼脂、脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂购于北京陆桥。
肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒(英文名API 20E)购于梅里埃诊断产品(上海嘉合)有限公司。
动物用药敏分析试剂板购于南京菲恩医疗科技有限公司。
2.试验方法细菌分离鉴定和菌株对药物感受性试验在县水产站病害检测无菌操作室内进行。
试验操作遵循《鱼类细菌病检疫技术规程(SC/T 7201.1－2006、SC/T 7201.1－2006)》和梅里埃API－20E 试剂条鉴定及南京菲恩动物用药敏分析试剂板操作流程。
二、试验结果1.嗜水气单胞菌分离及形态特征观察从病鱼血液分离到的嗜水气单胞菌在普通营养琼脂培养基上生长良好，28℃培养18～24小时，形成圆形光滑、边缘整齐、湿润、微凸、微白色菌落，在脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板上，菌落呈乳白色、微凸、湿润，周围出现清晰的溶蛋白透明圈，革兰氏染色阴性，油镜视野下短杆状。
2.嗜水气单胞菌的氧化酶试验和生理生化鉴定对分离的细菌进行生理生化检测，结果判定为嗜水气单胞菌的具体生理生化特征见表2。
依据《伯杰氏鉴定细菌学手册》(1994)“气单胞菌属细表1菌株分离清单汇总442019.10表312株细菌对8种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)对照毫克/升菌种间特征鉴别表”对分离到的嗜水气单胞菌进行Ⅰ和Ⅱ分类，并分别命名为Ⅰ－1、Ⅰ－2、Ⅰ－3和Ⅱ－1、Ⅱ－2、Ⅱ－3、Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅱ－6、Ⅱ－7、Ⅱ－8、Ⅱ－9。
黄颡鱼烂身病病原菌的分离及药敏实验
黄颡鱼烂身病病原菌的分离及药敏实验作者：暂无来源：《渔业致富指南》 2019年第16期黄颡鱼(Pseudobagrus fulvidraco)，属硬骨鱼纲（Osteichthyes）、鲇形目（Siluriformes）、鲿科（Bagridae）、黄颡鱼属（Pelteobagrus），广泛分布于我国分布长江、黄河、珠江和黑龙江等流域。
黄颡鱼肉质细嫩，无肌间刺，味道鲜美，是消费者较青睐的淡水鱼之一。
随着市场需求的不断扩大，黄颡鱼在江浙地区的养殖区域不多扩大，黄颡鱼病害也逐渐再增加，大大制约了黄颡鱼养殖的健康发展。
由拟态弧菌引起的黄颡鱼烂身病，病鱼溜边，表皮有规则性溃烂，严重时全身皮肤溃疡，肌肉也发生严重溃烂，病鱼摄食量减少，是一种高致死性病害，该病不易发觉，发病时间长，难以治疗，是黄颡鱼养殖中常见的病害之一，给江浙地区黄颡鱼养殖造成重大损失。
2019年6月初，江苏大丰某黄颡鱼养殖塘暴发烂身病，通过取样分离病原菌，并对分离的病原菌进行药敏试验，根据药敏结果指导养殖户进行合理用药，取得良好的治疗效果。
通过本文，以期为当地黄颡鱼养殖过程中烂身病的防治提供一定的参考。
1 材料与方法1.1 材料发病黄颡鱼于2018年8月取自大丰某黄颡鱼养殖场，发病鱼80g左右。
实验用药敏纸片采购自杭州微生物试剂有限公司；微生物培养基为脑心浸液培养基（BHI），pH7.4±0.2，采购自OXOID。
1.2 致病菌的分离在超净工作台中，从患病鱼肝、肾等组织处取样，用灭菌后的接种环分别在培养基平皿的边缘的四个点涂菌，以每个点开始划线至培养基平皿中的1/2。
然后，再以到第二点划线至培养基平皿中的1/2，依次划线，直至将致病菌均匀密布于培养基平皿中。
30℃培养24小时。
挑选优势菌落接种于斜面培养基，30℃培养24 小时，4℃冰箱保存备用。
从斜面培养基上挑取菌落，接种到BHI液体培养基中，30℃培养24 小时。
1.3 药敏试验采用纸片琼脂扩散法（K-B法），在超净工作台中，将分离到的致病菌用生理盐水制备成浓度约107～108cfu/mL细菌悬浊液，然后取100uL涂布于BHI平板，等待15分钟，将不同的药敏纸片均匀的贴在BHI平板上，30℃培养24 小时后，观察结果，量取抑菌圈直径，确定致病菌对各药物的敏感性。
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药敏实验操作流程
1.器材准备
解剖盘、剪刀、镊子、酒精灯、酒精棉、接种环、乳胶手套、培养皿、烧杯、量筒、锥形瓶、电子天平、超净工作台、高压灭菌锅、恒温箱、显微镜2.实验步骤
2.1 培养基制备
（1）用量筒量取300ml纯净水，倒入锥形瓶中。
（2）用电子天平称取脑心浸液（BHI）肉汤培养基、技术琼脂粉，倒入锥形瓶中摇匀后放入高压灭菌锅灭菌处理。
（3）取出灭菌后的液体培养基，在超净工作台开始倒平板，准备好的20个培养皿，每个倒15ml。
（4）待冷却凝固后放入4℃冰箱保存备用。
2.2 细菌分离
（1）取出制备好的培养基，标注好信息：鱼体来源、实验时间，将平板划分为4个区域，一般肝脏、脾脏、肾脏、腹水。
（2）取出待解剖的新鲜死鱼或濒死鱼，用酒精棉擦拭鱼体表，防治外部细菌影响，解剖之前剪刀、镊子用酒精擦拭消毒后再用酒精灯灼烧，在肛门前端开始解剖，防治剪破肠道细菌感染。
（3）接种前接种环用酒精灯灼烧发红，不可用手接触组织，接种环垂直插入组织取出组织液。
（4）将取出的组织液在平板标记位置开始划S线，划线时需在酒精灯前操作，防治空气中杂菌污染。
（5）将涂好的平板放入28℃恒温箱细菌培养，一般分离出细菌在12h后在划线位置可形成细菌菌落。
2.3 药敏实验
（1）取出备用的培养基，标注好信息。
（2）用接种环将分离出的不同组织的细菌挑取接种到平板上，横、竖、30°多方位划线，划满整个平板。
（液体涂布法：1.5ml EP管装0.5ml生理盐水或液体培养基，勾取细菌放入EP管搅匀，用移液枪吸200ul，将菌液打在空白平板上，用消毒、灼烧、冷却后的涂布棒均匀涂抹。
）
（3）用镊子在酒精灯灼烧后，取出药敏片，将有字一面朝下，均匀放在平板上，用镊子轻轻按压，每取一个药敏片，都要用酒精擦拭、消毒，一般一个平板帖5片药敏片，贴好后背面标注要药敏片信息。
（4）贴好后放入恒温箱培养12h，平板上形成直径不同的抑菌圈，根据抑菌圈大小判断药物敏感程度，选择合适的药物进行治疗。
2.4 细菌纯化
（1）取出分离出细菌的平板，标注好信息，接种环高温灼烧。
（2）挑取单菌落在新的平板上划线，按Z行划线，划4次，后一次接在前一次的尾部划线，每划一次接种换都要灼烧冷却，防治杂菌污染。
（3）将纯化后的平板放入恒温箱过夜培养。
2.5 革兰氏染色鉴定
（1）用注射器或移液枪吸取少量纯净水滴在载玻片上，让菌容易散开。
（2）用接种环挑取菌落在水滴上稀释涂开。
（3）将破片放在酒精灯火焰慢慢烤干。
（4）用染色剂染色：结晶紫→碘→脱色液→复染液
（5）在显微镜下用油镜镜检，显红色表明阴性，显紫色表明阳性。