碱性蛋白酶活性测定试剂盒使用说明
碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒使用说明
碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(磷酸苯二钠微板法)货号：G5610有效期：6个月有效。
产品内容：产品规格试剂(A):ALP Assay buffer 2.5ml试剂(B):ALP显色液 2.5ml试剂(C):显色基液7.5ml试剂(D):Phenol标准(1mg/ml)1ml试剂(E):ddH2O1ml产品说明：碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH9.2~9.8。
此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌的细胞膜。
碱性磷酸酶检测试剂盒(磷酸苯二钠微板法)(Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit)采用磷酸苯二钠比色法，其检测原理是磷酸苯二钠在碱性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成游离酚和磷酸。
在碱性条件下酚与氨基安替比林结合，并经氧化生成红色醌式结构物，呈深浅不一的红色，产物红色越深，说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过酶标仪测定510nm处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。
该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的碱性磷酸酯酶活性。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
自备材料：96孔板、水浴锅或恒温箱、酶标仪操作步骤(仅供参考)：1、配制标准品工作液：取出Phenol标准(1mg/ml)恢复至室温后，取0.1ml溶解于1.9ml ddH2O，使浓度达到0.05mg/ml，即为标准品工作液-Phenol(0.05mg/ml)。
按照下表稀释系列标准品溶液。
012345010******** Phenol(0.05mg/ml)(μl)ddH2O(μl)55453525155相当于金氏单位(U/L)010********2、准备样品：（1）细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离心取上清，-80℃冻存，用于碱性磷酸酯酶的检测。
Folin法测定碱性蛋白酶活性
• 2、碱性蛋白酶活力计算 • 酶活力(μg/ml) = K· A· N· 4/10
• K-标准曲线斜率的倒数 A-吸光度值 N - 酶的稀释倍数10000倍
• 4-反应总体积为4mL
10 - 反应时间为10min
• 将两个样品测定结果取平均值后代入公式，计算酶活
五、实验注意事项
精密电子天平分光光度计恒温水浴锅容量瓶刻度吸管或可调式移液器烧杯量筒滤纸folin试剂碳酸钠盐酸氢氧化钠三氯乙酸酪蛋白酪氨酸7对照标准酪氨酸ml0103040506070002mollhclml08070605040310naml50folin试剂ml10混匀水浴4020min冷却后680nm波长处比色1标准曲线测定取试管干净7支分别吸取标准酪氨酸010203040506于试管中并用02mollhcl溶液稀释至10ml分别加入04mollna50ml再加入folin试剂10ml混匀置于40恒温水浴中20min冷却后于680nm波长处比色
实验一
Folin法测定碱性蛋白酶活性
Folin法测定碱性蛋白酶活性
• 一、实验目的 • 了解蛋白酶活测定方法及原理，掌握其基
本操作。
二、实验原理
• （1）碱性蛋白酶：能催化蛋白质水解，它不仅能水解肽键，
也能水解酰胺键和脂键等，因此可以利用酪蛋白为底物进行
水解反应。 • （2）Folin试剂：磷钨酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下 不稳定，可被酚类化合物还原，而呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合 物）由于蛋白质或者水解产物中含有具酚基的氨基酸（如酪 氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等），故也可呈上述反应。 • 本实验就是利用碱性蛋白酶水解产物中含有酚基的氨基酸的 呈色反应强度来表示蛋白酶活性。
二、实验原理
碱性蛋白酶(AKP)活性检测试剂盒说明书__可见分光光度法UPLC-MS-4478
碱性蛋白酶（AKP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：UPLC-MS-4478规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体35mL×1瓶4℃保存试剂一粉剂×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1瓶4℃保存试剂三液体50mL×1瓶4℃保存试剂四液体10mL×1瓶4℃保存标准品液体1mL×1支4℃保存溶液的配制：1、试剂一：临用前加入10mL蒸馏水，充分溶解；2、试剂二：临用前加入10mL提取液，沸水浴中搅拌溶解。
3、标准品：20μmol/mL标准酪氨酸。
产品说明：AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。
此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。
该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。
在碱性条件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，测定680nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：研钵/匀浆器、台式离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mL EP管、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）称约0.1g组织，加入1mL提取液，冰上充分研磨，10000rpm4℃离心10min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。
或直接称取0.1g酶制品，加入1mL提取液，置冰上待测。
二、测定步骤1、分光光度计预热30min以上，调节波长至680nm，蒸馏水调零。
2、试剂一、试剂二和试剂三置于40℃水浴保温30min以上。
3、标准溶液的配制：临用前将20μmol/mL标准液用蒸馏水稀释80倍至0.25μmol/mL标准溶液使用，现用现配。
碱性蛋白酶使用方法
碱性蛋白酶使用方法
碱性蛋白酶是一种常用的酶类试剂，广泛应用于生物学、生物化学和分子生物学等领域。
它能够在碱性条件下高效催化蛋白质水解反应，常用于蛋白质纯化、酶切、免疫学实验等。
本文将介绍碱性蛋白酶的使用方法，希望能够对使用者有所帮助。
1. 确定使用条件。
在使用碱性蛋白酶前，首先需要确定实验所需的碱性条件。
一般来说，碱性蛋白酶的最适作用pH为8.0-9.5，因此在实验中需要选择适合的缓冲液来维持碱性条件。
2. 酶解反应条件。
将待酶解的蛋白样品与适量的碱性蛋白酶按照比例混合，通常在室温下进行反应。
酶解的时间可以根据需要进行调整，一般情况下15-60分钟即可完成反应。
3. 反应终止。
在酶解反应结束后，需要及时终止反应以防止酶的过度作用。
一般常用的方法是加入蛋白质酶抑制剂或直接加热至95℃以上，使
酶失活。
4. 样品处理。
酶解后的样品可以根据实验需要进行进一步处理，如进行电泳
分析、质谱分析、免疫印迹等。
5. 储存条件。
碱性蛋白酶通常以粉末形式供应，应密封保存于-20℃以下，避
免受潮和高温。
在使用过程中，应尽量避免长时间暴露于室温下。
6. 安全注意事项。
在使用碱性蛋白酶时，应注意避免吸入粉尘或接触皮肤和眼睛，避免误食。
使用过程中应佩戴口罩、手套和护目镜，避免产生粉尘。
总之，碱性蛋白酶是一种非常重要的酶类试剂，正确的使用方
法能够有效提高实验效率，获得准确的实验结果。
希望本文介绍的
使用方法能够对使用者有所帮助，祝实验顺利！。
碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒标准操作程序
碱性磷酸酶(ALP)测定标准操作程序1.摘要碱性磷酸酶（ALP）存在于成骨细胞、干细胞、白细胞、肾、脾、胎盘、前列腺和小肠内。
测定血清或肝素化血浆中的碱性磷酸酶活力，做临床辅助诊断用。
2.适用范围程序适用于日立7600自动生化分析仪检测血清、血浆中碱性磷酸酶（ALP）的活力。
3.职责使用日立7600自动生化分析仪进行测定碱性磷酸酶（ALP）活力的工作人员要严格按照本SOP程序进行,室负责人监督管理；本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。
4.检测方法上海科华生物工程股份有限公司生产的碱性磷酸酶（ALP）试剂盒采用的是AMP缓冲液法。
5.原理在AMP的缓冲环境下，磷酸对硝基苯在碱性磷酸酶的作用下，可以水解成磷酸盐和对硝基苯酚。
在一定底物浓度范围内,磷酸对硝基苯的水解产物对硝基苯酚会引起405nm处吸光度的上升，其上升速率与血清中碱性磷酸酶的活力成正比。
−→−+OH−−磷酸盐对硝基苯酚磷酸对硝基苯碱性磷酸酶+26.仪器日立7600自动生化分析仪7.试剂7.1试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供7.2试剂瓶内主要成分：R1：AMP缓冲液（PH10.50）、乙酸镁；R2：AMP缓冲液（PH8.85）、磷酸对硝基苯、乙酸镁。
AMP：2-氨基-2-甲基-1-丙醇7.3试剂稳定性：试剂在2-8℃避光保存，有效期1年。
试剂工作液在2-8℃避光保存，可稳定4周，15-25℃可保存稳定4天。
7.4试剂准备：试剂为即用式。
8.标准品和质量控制8.1校准程序：使用某某公司提供的标准品对自动分析仪进行校准。
按照公司标准品使用要求，并以9g/L氯化钠溶液或去离子水为空白，经校准测定，仪器自动对标准品响应量通过合适的数学模型绘制校准曲线。
8.2质控品某某公司提供的生化复合定值质控血清做为室内质控品。
每日在测定前做一次质控。
该质控品为干粉包装，在2-8℃冰箱可稳定到失效期，使用前用5ml去离子水复溶，待质控物充分溶解（大约30分钟）后使用。
碱性磷酸酶测定试剂盒(NPP底物-AMP缓冲液法)产品技术要求zhongshengbeikong
碱性磷酸酶测定试剂盒（NPP底物-AMP缓冲液法）适用范围：本产品用于体外定量测定人血清中碱性磷酸酶的活性。
1.1包装规格液体双剂型试剂1（R1）：80mL×3，试剂2（R2）：60mL×1；试剂1（R1）：80mL×2，试剂2（R2）：20mL×2；试剂1（R1）：60mL×3，试剂2（R2）：45mL×1；试剂1（R1）：40mL×3，试剂2（R2）：30mL×1；试剂1（R1）：40mL×3，试剂2（R2）：10mL×3。
1.2主要组成成分试剂1（R1）液体：AMP缓冲液350mmol/L（pH 10.5）2.5mmol/LMgCl2试剂2（R2）液体：对硝基苯磷酸盐 16mmol/L2.1 外观试剂盒中各组件的外观应满足：2.1.1试剂1（R1）应为无色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损；2.1.2 试剂2（R2）应为淡黄色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损。
2.2 净含量液体试剂净含量不少于标示值。
2.3 试剂空白吸光度在波长410nm（400nm～420nm）（光径1cm）处，试剂空白吸光度（A）应≤1.000；试剂空白吸光度变化率（△A/min）应≤0.005。
2.4准确度测定GBW(E)090593，相对偏差应不超过±10％。
2.5分析灵敏度对应于活性为120U/L的ALP所引起的吸光度变化率（△A/min）的绝对值应在0.010～0.050范围内。
2.6重复性重复测试同一样本，变异系数（CV）应≤5%。
2.7批间差测试同一样本，批间差（R）应≤6%。
2.8线性范围在[1，1200]U/L（37℃）范围内，线性相关系数（r）应≥0.990；在(20，1200] U/L（37℃）范围内，线性相对偏差应不超过±10％；在[1，20]U/L（37℃）范围内，线性绝对偏差应不超过±2U/L。
03 实验三 碱性蛋白酶活力测定
实验三. 碱性蛋白酶活力测定【实验目的】1. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
2. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
【实验材料】1.实验器材电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度计2.实验试剂(1)福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。
回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml。
过滤，置于棕色瓶中暗处保存。
使用前加4倍蒸馏水稀释。
(2)1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。
(3)pH10缓冲溶液：甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。
碱性蛋白酶活力测定
碱性蛋白酶活力测定1 定义1克固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1µg酪氨酸为1个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。
2 福林法2.1 原理碱性蛋白酶在一定的温度与pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
2.2 试剂和溶液2.2.1福林酚试剂已配2.2.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)21.2g，用水溶解并定容至500mL。
2.2.3 三氯乙酸（CCl3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸16.34g，用水溶解并定容至500mL。
2.2.4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.05mol/L按GB601配制。
2.2.5 硼酸缓冲溶液（pH10.5）甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。
使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1000mL。
上述缓冲溶液，需用pH计校正。
2.2.6 10g/L 酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用硼酸缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内储存，有效期为3天。
2.2.7100µg/mL L-酪氨酸标准溶液a.称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100µg/mL L-酪氨酸标准溶液。
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碱性蛋白酶活性测定试剂盒使用说明
分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
货号：BC2300
规格：50T/24样
产品内容：
试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加10mL蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。
临用前加入10mL试剂一，沸水浴中溶解。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加50mL蒸馏水溶解。
试剂五：液体×1瓶，4℃保存。
标准品：液体×1支，0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。
产品说明：
AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。
此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。
该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。
在碱性条件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，测定680nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、 1.5mL EP管、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组
织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。
2.血清或培养液：直接测定。
3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
二、测定操作：
1.分光光度计预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。
2.试剂二、试剂三和试剂四置于40℃水浴保温30min。
3.对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培养液），200μL试剂二，混匀后置于40℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A对照管。
4.测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培养液），200μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A测定管。
（注意与对照管不同，先加试剂三，后加试剂二）
5.空白管：取一支EP管，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂四200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A空白管。
6．标准管：取EP管，加入200μL标准品，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A标准管。
注意：空白管和标准管只需测定一次。
三、计算公式：
1.按照样本蛋白浓度计算
AKP活性单位定义：40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
AKP活性（nmol/min/mg prot）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白
管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T=625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A 空白管）÷Cpr
C标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定，需要另外测定；建议称取同样质量的样品，加入1mL蒸馏水匀浆提取离心后，用本公司蛋白质含量测定试剂盒测定；V1：加入反应体系中粗酶液（血清或培养液）体积，100μL=0.1mL；T：催化反应时间，10min。
2．按照样本质量计算.
AKP活性单位定义：40℃每克样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
AKP活性（nmol/min/g）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T=625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W
C标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；W：样品质量，g；V1：加入反应体系中粗酶液体积，100μL=0.1mL；V2：粗酶液总体积，1mL；T：催化反应时间，10min。
3.按照液体体积计算
AKP活性单位定义：40℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
AKP活性（nmol/min/mL）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A 空白管）×稀释倍数÷V1÷T=625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）C标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；V1：加入反应体系中血清或培养液体积，100μL=0.1mL；T：催化反应时间，10min。
4.按照细胞数量计算
AKP活性单位定义：40℃每104个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
AKP活性（nmol/min/104cell）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（细胞数量×V1÷V2）÷T=625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷细胞数量
C标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；V1：
加入反应体系中粗酶液体积，100μL=0.1mL；V2：粗酶液总体积，1mL；T：催化反应时间，10min。
注意事项：
临用前配制的试剂配置好后3天内使用完毕。