刃天青显色法检测结核分枝杆菌的耐药性
结核分枝杆菌培养、药敏实验及质量控制
斜面向上，37℃ 水平放置24小时
均匀接种0.1ml, 2支/标本 37℃竖直培养8周
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四、结果的观察与报告，直至满8周 • 记录菌落生长及污染情况。
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报告方式
分枝杆菌培养阴性： 斜面无菌落生长 菌落生长不足斜面面积1/4者，报实际菌落数。 分枝杆菌培养阳性（1+）： 分枝杆菌培养阳性（2+）： 分枝杆菌培养阳性（3+）： 菌落生长占斜面面积的1/4 菌落生长占斜面面积的1/2 菌落生长占斜面面积的3/4
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二、标本前处理
原理：分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力。 目的：液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌
原则：
- 尽可能杀灭标本中的杂菌 - 尽可能保存标本中的分枝杆菌
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操作
静置 15分钟
痰标本
1－2倍 4% NaOH
振荡匀化
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三、接种和孵育
显微镜下结核分支杆菌形态
结核分枝杆菌显微镜下形态
结核分枝杆菌生长特性：
缓慢：在一般培养基上分裂一代需要 10多小时，
一般10-30天肉眼可见菌落生长。
菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，
有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或 米色，不透明。
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二：短期保存
1.1ml分枝杆菌菌液-70oC保存； 2.罗氏培养基上菌落加无菌液体石蜡后， 4oC保存。
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微量刃天青显色法快速测定结核分枝杆菌MIC及菌型鉴定
微量刃天青显色法快速测定结核分枝杆菌MIC及菌型鉴定陈军;陈志飞;饶有益;陈丽峰;王飞;肖勇【摘要】目的用刃天青显色法快速测定结核分枝杆菌(MTB)MIC及菌型初步鉴定,并确定抗结核药物折点浓度.方法用30株国家结核参比实验室熟练度测试质控菌株和64株临床分离菌株为试验菌株,在96孔培养板中,用Middlebrook 7H9液体培养基将抗结核药物进行连续双倍稀释后,加入一定浓度菌液,用刃天青显色法测定MIC.根据罗氏培养基药敏比例法结果,用ROC曲线分析建立显色法药物折点浓度.同时选择24株非结核分枝杆菌(NTM),用对硝基苯甲酸(PNB)进行初步的菌型鉴定.结果刃天青显色药敏试验5种抗结核药物链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇和氧氟沙星的折点浓度分别为1、0.5、0.5、2、2μg/mL,其敏感性分别为100%、97%、97%、88%和100%,特异性分别为100%、100%、100%、91%和100%.在菌型鉴定中,94株MTB在PNB中均未生长,24株NTM均生长.结果刃天青显色法测定MIC具有操作简便、快速、成本低廉和准确的优势,且能进行初步的菌型鉴定,适于结核病专业实验室应用.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2011(029)003【总页数】2页(P174-175)【关键词】结核分枝杆菌;最低抑菌浓度;刃天青【作者】陈军;陈志飞;饶有益;陈丽峰;王飞;肖勇【作者单位】武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】R378.91结核病是严重威胁公共卫生安全的慢性传染性疾病。
传统罗氏培养基药敏方法需时较长，而商品的液体培养基快速药敏方法如BACT/ALERT 3D系统[1]，不仅需要仪器，而且成本高昂，难以推广使用。
结核分枝杆菌的抗酸染色原理
结核分枝杆菌的抗酸染色原理一、简介结核分枝杆菌是引起结核病的主要病原体，对其进行准确快速的检测具有重要意义。
抗酸染色是一种常用的方法，能够直接观察到结核分枝杆菌的存在和形态特征。
二、抗酸染色的原理抗酸染色是通过特殊的染色方法，使结核分枝杆菌在显微镜下呈现红色或紫色，而其他非酸酸杆菌则呈现蓝色。
2.1 理论基础结核分枝杆菌具有特殊的细胞壁结构，其细胞壁主要由脂质和脂酸构成，其中包含大量的酚类脂质，这种脂质能够抵抗常规染色方法中的酸性染料。
2.2 染色原理抗酸染色采用的是富尔曼-韦尔染色法，主要包括以下几个步骤：1.制备菌液：从患者的痰液或其他病变部位采集样本，制备结核分枝杆菌的菌液。
2.固定：将菌液涂在玻璃片上，用火焰烘烤使其固定。
3.酸性染料染色：将固定的菌液涂上红色的酸性染料，如碱性红或苏木精。
4.脱色：用酸醇溶液洗去多余的染料。
5.革兰染色：用紫色的革兰染料染色。
6.脱色：用醇洗去多余的染料。
7.固定：用盐酸醇固定染色。
8.洗净：用水洗净玻璃片。
9.干燥：让玻璃片自然干燥。
10.镜检：将染色好的玻璃片放在显微镜下观察，结核分枝杆菌呈现出红色或紫色。
三、抗酸染色的应用抗酸染色广泛应用于结核病的诊断和治疗过程中。
3.1 诊断结核病通过抗酸染色，医生可以直接观察到患者样本中是否存在结核分枝杆菌，从而判断是否患上结核病。
3.2 监测结核治疗效果在治疗结核病的过程中，通过定期进行抗酸染色检测，可以评估患者的结核菌负荷，判断治疗是否有效。
3.3 检测结核菌耐药性结核分枝杆菌的耐药性是结核病治疗的重要指标之一。
抗酸染色方法可以辅助判断结核菌对抗结核药物的敏感性，从而指导药物的选择和调整。
四、抗酸染色的优缺点抗酸染色方法虽然在结核病的检测中具有一定的优势，但也存在一些局限性。
4.1 优点•简单快速：整个染色过程只需几分钟，可以在短时间内完成。
•直观可靠：直接观察到红色或紫色的结核分枝杆菌，确保结果准确可靠。
耐药结核病的实验室诊断及药物相关性研究
耐药结核菌
ｉ
添加单 体药液及 Ｏ Ａ Ｄ Ｃ
ｌ
添加单体药液不加 Ｏ Ａ Ｄ Ｃ
２ ． ４ ． １ 二氢青 篙素及 青蒿琥 酯的抑菌作 用 参照刃天 青氧 化还 原显色法检测结核 菌在含药微量液体培养基 中生长情况 。简述
圆圈
２ ０ １ ３ Ｎ Ｏ ． ８ …
临床医学
耐药结核病 的实验室诊 断及药物相关性研究
魏建林 河北省邢台市第二 医院检验科 ， 河北 邢台 ０ ５ ４ ０ ０ １
［ 摘要】目的 以 Ａ Ｓ Ｎ及 Ｄ Ｈ单独或者联合 Ｉ ＮＨ及 Ｒ Ｆ Ｐ初步对耐 Ｒ Ｆ Ｐ结核菌进行研 究 ，研究其是不是可 以联 合 Ｉ Ｎ Ｈ或 Ｒ Ｆ Ｐ 发生如逆转耐药性或降低 耐药性等 ， 或者研究其是不是具有作用于抗结核分枝杆菌 。 方法 各 种中药单体是不是具备 杀死 细菌或者抑制细菌的作用可 以通过刃天青 显色法做 出具体 判断。中药单体配上 Ｒ Ｆ Ｐ或 Ｉ Ｎ Ｈ是不是具备逆转或者协同结核
ｌ
显色法 ． ３ ７ 。１ ４ ｄ
ｉ
逆转 耐药 ． ３ ７ ｏ ２ ４ ｈ
如下 ： 用０ ． ５ ％Ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ ８ ０生 理盐水研 磨结 核菌 至乳浊 状后 略沉 淀， 去其上层面 的菌液 ， 调至 １ 个麦 氏单 位 （ 用米 氏 ７ Ｈ９液 ） ， 之 后对其进行稀释 ， 稀 释 比例为 ： ｌ ： １ ０ 。 将稀释厚 的液体加 于孔 板中 （ 每孔加 １ ０ ０ ） ， 之后 ， 将稀 释后 的青蒿素单 体液加 于孔板 （ 每 孑 Ｌ 加人 １ ０ ０ Ｉ ｘ Ｌ ） ， 使药 物终浓度为 ２ ０ ０ ５ ｇ ／ ｍ Ｌ 。 对于无菌对照孔 ，
结核分枝杆菌的微生物学诊断方法
结核分枝杆菌的微生物学诊断方法
1.痰液涂片染色：这是最常用的方法之一、将痰液制备成涂片，进行
酸性染色，如抗酸杆菌染色和耐酸染色。
结核分枝杆菌是抗酸杆菌，其细
胞壁富含脂质，可以抵抗酸性染料的脱色作用。
这种方法可以快速检测出
结核分枝杆菌的存在。
2.结核分枝杆菌的培养：这是鉴定结核分枝杆菌的“金标准”。
痰样
品通常会涂在含有富含营养物质的培养基上，并在适当的温度和湿度条件
下孵育。
结核分枝杆菌需要一个相对较长的孵育时间（通常需要数周）才
能生长和生成可见的菌落。
分枝杆菌的培养是确诊结核病的关键步骤，同
时还可以进行对特定抗结核药物的药敏试验。
3.伊红染色：这种方法旨在鉴定酸酒杆菌属分枝杆菌和其他酸杆菌的
超微结构。
伊红染色可使细胞壁和细胞内储存的色素显现为红色或粉红色。
该方法可以帮助确定分枝杆菌的类属。
4.PCR检测：聚合酶链反应（PCR）能够通过扩增目标基因片段来检
测和诊断结核分枝杆菌。
这种方法具有高度特异性和灵敏度，并可以通过
荧光标记的探针来定量检测。
5.蛋白质组学：蛋白质组学技术通过检测和分析结核分枝杆菌内部蛋
白质的组成和变化，可以为诊断和治疗提供信息。
质谱法是一种常用的蛋
白质组学技术，可以通过检测菌落样品中的特定蛋白质来鉴定结核分枝杆菌。
总的来说，微生物学诊断方法在结核分枝杆菌检测和鉴定中起着至关
重要的作用。
这些方法可以帮助医生确定结核病的诊断和治疗方案，并对
结核分枝杆菌的流行病学研究和控制提供重要的科学依据。
结核病的实验室诊断方法及评价
耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。
因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。
其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。
基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。
多种以PCR为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。
这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。
由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
世界卫生组织《结核分枝杆菌耐药相关基因突变目录(第2版)》解读
录-包含高质量$全面的表型耐药相关基因突变列表 行了更细致分层'其根据MN! 对不同药敏试验
及其置信度分级%%%&"但纳入菌株的地理区域代表性 方法的认可程度"将表型药敏试验数据分为7个层
较差"且有关新药和再利用药物耐药相关基因突变 级"前2个层级为使用MN!推荐试验方法得到的
的数据非常有限'因此"MN!于(&(2年修订并发 数据集!MN! 数据集#'第%层级包括根据最新
序的耐药结核病分子诊断技术%%&&'新一代靶向测 #:@5>+,?-5:"SIT##或欧洲核苷酸档案馆数据库
序技术可以通过对临床标本直接检测"实现对十几
的同步更新 !*E>5/A,:SE4.A5?-FAC>4G-PA"*SC#
"
种抗结核药物耐药性的快速判定"但基于目前对部 可以获取更多公开数据'因此"第(版,目录-纳入
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一种利用硅胶显色法检测结核菌药敏的微孔板性能评价
一种利用硅胶显色法检测结核菌药敏的微孔板性能评价黄飞;陈俊林;顾德林;瞿梅【摘要】目的:评价一种利用硅胶显色法快速检测结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)药敏的可视化微孔板的性能.方法:对自行研制的24孔固载有变色硅胶的微孔板进行二氧化碳加压测试、紫外线照射试验、暴露试验、渗漏试验、二氧化碳可逆性吸收试验,利用变色硅胶微孔板对南通市第六人民医院结核病实验室保存的30株MTB临床分离株进行利福平(RFP)药敏检测,继以50份结核病患者涂阳痰标本进行培养及RFP药敏检测并与BACTEC MGIT960及Xpert MTB/RIF 检测RFP药敏结果进行比较.结果:自制的变色硅胶微孔板有良好的二氧化碳吸收能力及防紫外线照射变性、防空气中二氧化碳干扰、防液体培养基渗漏、防二氧化碳逆向吸收能力;30株MTB临床分离株RFP药敏检测结果与BACTEC MGIT960检测结果完全一致;50份涂阳痰标本最佳药敏报告时间为(16.5±2)d,RFP药敏检测结果和BACTEC MGIT960检测结果高度一致(符合率97.5％),较Xpert MTB/RIF检测的RFP耐药结果精准.结论:变色硅胶微孔板可以用来作为检测MTB药敏的新型工具,具有成本低、操作简单、检测快速、便于观察判断等优点,适合临床推广应用.【期刊名称】《医疗卫生装备》【年(卷),期】2018(039)009【总页数】6页(P10-15)【关键词】结核分枝杆菌;硅胶显色法;利福平;药敏试验;评价【作者】黄飞;陈俊林;顾德林;瞿梅【作者单位】南通市第六人民医院结核科,江苏南通 226011;南通市第六人民医院结核科,江苏南通 226011;南通市第六人民医院结核科,江苏南通 226011;南通市第六人民医院结核科,江苏南通 226011【正文语种】中文【中图分类】R318;R378.9110 引言耐药结核病的防治工作是困扰中国公共卫生的大问题之一[1]，而利用先进技术快速精准检测标本中结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）药物敏感性是控制耐药结核病的关键步骤。
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１ ２ 方 法 ． １ ２ １ 刃 天 青 显 色 法 参 考 Ｆ ａ ｚ ｌｕ Ｓ 方 法 ＿ ， 稍 加 改 ． ． ｒｎ ｂａ Ｇ １ 并 ］ 变 。采 用 ２ ４孔 细 胞 培 养 板 微 孔 板 ， 第 １孔 中 添 加 抗 结 核 药 在
早 有 报 道 ， 法 可 以 检 测 临 床 分 离 结 核 分 枝 杆 菌 的 最 小 抑 制 浓 该 度 （ Ｃ ］ ＭＩ ） 。本 研 究 分 别 从 河 南 省 的 ３个 结 核 病 医 院 检 测 了
Ｄｒ ｇ ｒ ｓｓ ａ ｃ ｅ ｔｎ ｆ Ｍ ｙ ｏ ａ ｔｒ ｕ ｔ ｅ ｃ ｏ ｉ ｙ ｒ ｓ ｚ ｉ ｉｒ ｐｌｔ ｓ ａ Ｗ Ａ Ｎ Ｇ ｉ 。 ｕ ｅ ｉｔ ｎ ｅ ｔｓｉ ｇ ｏ ｃ ｂ ｃ ｅ ｉ ｍ ｕｂ ｒ ｕｌｓｓ ｂ ｅａ ｕｒｎ ｍ ｃ ｏ ａ ｅ ａ ｓ ｙ Ｍ ｎ ＦＵ Ｇｕａｎ ｙｕ 。 ｇ—
平 （ Ｆ ） 乙胺 丁 醇 （ ＭＢ 、 酸链 霉 素 （ Ｍ） 耐 药 性 ， 与 比例 法作 比较 。 结果 刃 天 青 显 色法检 测 平 均 时 间 为 Ｒ Ｐ、 Ｅ ）硫 Ｓ 的 并
８ｄ， 比 例 法相 比 结 果 一 致 性 好 ，ＮＨ、 Ｐ、 与 Ｉ ＲＦ ＥＭＢ、 Ｍ Ｓ ４种 药 物 的 折 点 浓 度 分 别 为 ０ ２ ２ ０、 ． ２ ０／ ／ ． ５、 ． ４ ０、 ． ｚ ｍＬ。 ｇ
【 要 】 目 的 用 刃 天 青 显 色法检 测 结 核 分 枝 杆 菌 对 ４种 一 线 抗 结 核 药物 的 耐 药 性 ， 摘 并探 讨 该 法 的 临床 应 用 价 值 。方 法 来 自河 南省 ３家 结核 病 医 院 的 共 ２０株 结核 分 枝 杆 菌 分 别 用 刃 天 青 显 色法 检 测 异 烟 肼 （ＮＨ） 利 福 ４ Ｉ 、
ｃ ｌｉｏ ａ ｅ ｙｃ ａ ｔ ｒｕｍ ｕｂ ｒ ｕｌ ｉ ｒ ｍ ｕｂ ｒ ｕ ｏ ｉ ｓ ｔ ｌ ｎ Ｈ ｅ ａ ｐｒ ｖｉ ｅｗ ｅ ｅ ａ ｌｅ ｏ ｔ ｓ ｈ ｉ ａ ｓ ｉ ｔ ｓｏｆＭ ｏｂ ｃ ｅ ｉ ｔ ｅ ｃ ｏｓｓ ｆｏ ３ ｔ ｅ ｃ ｌ ｓｓ ｈｏ ｐｉａ ｓｉ ｎ ｎ ｏ ｎｃ ｒ ｐｐ ｉｄ ｔ ｅ ｔｔ ｅ ｒ
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检 验 医学 与 临 床 ２ １ ０ ２年 ７月 第 ９卷 第 １ ３期
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论 著 ・
刃天 青 显 色 法检 测 结 核 分 枝 杆 菌 的 耐 药 性
王 敏 付 光 宇 罗江卫。 １ 郑州人 民 医院 呼吸科 ， ， （． ３ 郑 州安 图绿 科 生物 工程有 限公 司 ． ４０１） ５ ０ ６ ４ ０ ０ ；． 州大 学基 础 医学院 ５０３ ２ 郑 ４ ００ ； ５ ０ １
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用 蒸 馏 水 稀 释 后 用 ０ ２ ｍ 滤 膜 除 菌 ， 福 平 （ Ｐ 用 少 量 二 ．２ 利 ＲＦ ）
甲基 甲 酰 胺 溶 解 后 加 灭 菌 蒸 馏 水 至 所 需 量 过 滤 ， 液 置 原
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一
省 结 核 病 医 院 。培 养 基 ： Ｈ９培养 基 基 础 ， 养 液 在 ＯＡＤ ７ 营 Ｃ基 础上 稍 作 改 变 ， 分 包 括 葡 萄 糖 、 化 钠 、 牛 血清 、 酸。 成 氯 小 油 ７ Ｈ９培 养 基 基 础 与 营 养 液 混 合 均 匀 后 无 菌 过 滤 ， ４℃ 保 存 备 用 ， 个 月 内 用 完 。 刃 天 青 盐 ， 去 离 子 水 配 制 成 ０ ０ 的 溶 １ 用 ．２ 液 ， 菌 过 滤 ， ℃ 避 光 保 存 备 用 ｌ 。异 烟 肼 （ＮＨ） 利 福 平 无 ４ ２ ］ Ｉ 、 （ Ｆ ） 乙 胺 丁 醇 （ ＭＢ 、 酸 链 霉 素 （ Ｍ） 为 纯 品 ，ｉｍａ ＲＰ、 Ｅ ）硫 Ｓ 均 ｓ ｇ 公 司产 品 。异 烟 肼 （ＮＨ） 乙胺 丁醇 （ ＭＢ 、 酸 链 霉 素 （Ｍ ） Ｉ 、 Ｅ ）硫 ｓ
我 国 每 年 有 １ 万 人 死 于结 核 病 ， 全 球 ２ 个 结 核病 高 负 ３ 是 ２ 担 周 家 之 一 。耐 多 药 结 核 菌 株 的增 加 ， 结 核 病 的 防 治 带 来 了 给 极 大 的 困 难 。传 统 的 结 核 药 敏 试 验 是 在 罗 氏 固体 培 养 基 上 进 行 的 ， 物 按 一 定 的 稀 释 梯 度 加 入 培 养 基 中 ， 分 离 培 养 阳 性 药 将 曲 细 菌 接 种 于 含 药 培 养 基 中 ， 察 分 枝 杆 菌 在 含 药 培 养 基 中 的 观 生 长 情 况 。 由于 结 核 杆 菌 生 长 缓 慢 ， 般 的 结 核 杆 菌 分 离 培 养 一 需 时 ２ ６周 ， 敏 试 验 需 时 ４ ６周 ， 需 ６ １ ～ 药 ～ 共 ～ Ｏ周 ， 仅 费 不 时 ， 耽 误 了患 者 的合 理 治疗 ， 更 因此 缩 短 药 敏 试 验 时 间 ， 增 加 并 准 确 性 ， 一个 迫 切 的 问 题 。Ｂ Ｔ Ｃ ＭＧ Ｔ ９０检 测 系统 虽 是 ＡＣ Ｅ Ｉ ６ 然 缩 短 了时 间 ， 现 了 自动 化 ， 是 设 备 昂 贵 ， 以得 到 普 及 。 实 但 难
结 论 刃天 青 显 色 法检 测 结核 分枝 杆 菌 的 耐 药 性 具 有 成 本 低 、 捷 、 作 简便 、 确 等优 点 ， 结核 耐 药检 测 提 供 了 快 操 准 为