结核分枝杆菌的快速检测和药敏试验
结核病的实验室诊断方法及评价
结核病的实验室诊断方法及评价耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。
因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。
其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。
基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。
多种以PCR 为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。
这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。
由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
微量刃天青显色法快速测定结核分枝杆菌MIC及菌型鉴定
微量刃天青显色法快速测定结核分枝杆菌MIC及菌型鉴定陈军;陈志飞;饶有益;陈丽峰;王飞;肖勇【摘要】目的用刃天青显色法快速测定结核分枝杆菌(MTB)MIC及菌型初步鉴定,并确定抗结核药物折点浓度.方法用30株国家结核参比实验室熟练度测试质控菌株和64株临床分离菌株为试验菌株,在96孔培养板中,用Middlebrook 7H9液体培养基将抗结核药物进行连续双倍稀释后,加入一定浓度菌液,用刃天青显色法测定MIC.根据罗氏培养基药敏比例法结果,用ROC曲线分析建立显色法药物折点浓度.同时选择24株非结核分枝杆菌(NTM),用对硝基苯甲酸(PNB)进行初步的菌型鉴定.结果刃天青显色药敏试验5种抗结核药物链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇和氧氟沙星的折点浓度分别为1、0.5、0.5、2、2μg/mL,其敏感性分别为100%、97%、97%、88%和100%,特异性分别为100%、100%、100%、91%和100%.在菌型鉴定中,94株MTB在PNB中均未生长,24株NTM均生长.结果刃天青显色法测定MIC具有操作简便、快速、成本低廉和准确的优势,且能进行初步的菌型鉴定,适于结核病专业实验室应用.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2011(029)003【总页数】2页(P174-175)【关键词】结核分枝杆菌;最低抑菌浓度;刃天青【作者】陈军;陈志飞;饶有益;陈丽峰;王飞;肖勇【作者单位】武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】R378.91结核病是严重威胁公共卫生安全的慢性传染性疾病。
传统罗氏培养基药敏方法需时较长，而商品的液体培养基快速药敏方法如BACT/ALERT 3D系统[1]，不仅需要仪器，而且成本高昂，难以推广使用。
结核病实验室诊断技术介绍
1．结核分枝杆菌鉴定方法1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。
1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。
目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。
1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。
扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。
目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。
目前在国内区县级应用评估。
1.4 夹层杯结核病诊断方法将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。
直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。
夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。
夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。
1.5 环介导等温扩增方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。
同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。
2．结核分枝杆菌培养方法2.1 固体培养培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。
虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。
2.2 液体培养液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。
BACTEC MGIT 960快速培养及药敏在肺结核诊治中的应用评价
BACTEC MGIT 960快速培养及药敏在肺结核诊治中的应用评价彭亦平;谭彩萍;熊国亮【摘要】目的：探讨BACTEC MGIT-960全自动分枝杆菌检测技术在结核病诊断中的应用价值。
方法用BACTEC MGIT-960对1538例肺结核患者的痰标本进行分离培养及药敏实验，并与痰涂片抗酸染色及罗氏培养法对比。
结果 BACTEC MGIT-960培养阳性率为42.85%，显著高于涂片阳性率25.42%；BACTEC MGIT-960培养及药敏时间分别为12.5d和8.3d，显著短于罗氏培养法的34.6d和31.2d；BACTEC MGIT-960法与罗氏培养法总的培养及药敏符合率分别为91.02%（kappa=0.82）和96.02%（kappa=0.82），两者具有高度的一致性。
结论BACTEC MGIT-960培养及药敏技术是一种比较理想的快速结核菌检测方法，在肺结核诊治中具有良好的应用价值。
%Objective To evaluate the application of the BACTEC MGIT 960 system for mycobacterial culture and drug sus-ceptibility test in patients with pulmonary tuberculosis. Methods 1538 sputum samples from patients with pulmonary tuberculosis were collected for mycobacterial culture and drug susceptibility testing by BACTEC MGIT 960 system ,and compare with the result by L-J (Lowenstein-Jensen) culture method and sputum smear for acid-fast staining method. Results The positive rate of culture by BACTEC MGIT 960 system was42.847%,significantly higher than that of 25.42%by sputum smear method. The report time of culture and drug susceptibility testing by BACTEC MGIT 960 system were 12.5d and 8.3d,significantly less than that of 34.6d and 31.2d by L-J method. The results of culture and drug susceptibility testingby BACTEC MGIT 960 system and L-J method showed high coincidence (kappa=0.82). Conclusions BACTEC MGIT 960 system is a ideal rapid method for mycobacterial culture and drug susceptibility test and has good application value.【期刊名称】《江西医药》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】3页(P21-22,30)【关键词】BACTEC MGIT 960;结核分枝杆菌;肺结核【作者】彭亦平;谭彩萍;熊国亮【作者单位】江西省胸科医院内三科，南昌 330000;江西省胸科医院内三科，南昌 330000;江西省胸科医院检验科，南昌 330000【正文语种】中文【中图分类】R521目前临床用于结核分枝杆菌检测的主要方法是痰涂片抗酸染色、L-J培养（慢培）及药敏试验。
结核分枝杆菌药敏试验分析
公 司生产 。结核分枝 杆菌药 敏培养 基 （ 比例 法 ） 由广 州凯升 生物科 技有 限公 司生 产。
果 ９ ６例药敏试验 中， 结核分枝杆菌总耐药菌株为 ４ １ 例， 总耐药率为 ４ ２ ． ７ ％， 其 中耐多药菌株 ２ ９株 ， 耐 药率为 ３ ０ ． ２ ％ 。结论
复治 。
本市结核患者 已出现耐药趋势 ， 且有向耐多药发展 ， 而在 没有 出现更有 效新药替
代 已产生耐药 的药物前 ， 必须坚 持科 学合理 的抗 结核病 药物 治疗原 则 ， 从 而 减少传 染性 肺结 核患 者 的
培养基 ， 接种完毕 置 ３ ７ ￣ Ｃ恒温培养箱 内培养 。
１ ． ２ ． ２ 药 敏试验
将所有培养 出的 阳性 标本待 测菌液 制备
成１ ０～ ２ ｇ ／ Ｌ和 １ Ｏ一 ４ ｇ ／ Ｌ菌悬液 ， 分 别用 ２ ２ Ｓ ＷＧ标 准接种 环蘸取 １ 环（ 即０ ． ０ １ ｍ １ ） 的菌液 ， 用划线法将 ｌ Ｏ～２ ｇ ／ Ｌ菌悬 液均 匀 接 种 分 别 含 异 烟 肼 （ Ｉ Ｎ Ｈ） 、 利福 平 （ Ｒ Ｆ Ｐ） 、 链 霉 素 （ Ｓ Ｍ） 、 吡 嗪酰 胺 （ Ｐ Ｚ Ａ） 、 乙胺 丁 醇 （ Ｅ Ｍ Ｂ） 、 对 氨 基 水 杨 酸 （ Ｐ Ａ Ｓ ） 、 丙硫异烟胺 （ １ ３ ２ １ Ｔ Ｈ） 、 卡那 霉 素 （ Ｋ Ｍ） 、 卷 曲霉 素 （ Ｃ Ｐ Ｍ） 药敏 培养基表面 ， 将ｌ ０— ４ ｇ ／ Ｌ菌悬 液接种 于对 照培 养基表 面 ， 应注意是 菌液尽 可能均匀 分散于培 养基斜 面。接
结核分枝杆菌
（1）原发感染
结核分枝杆菌 侵入肺泡 被肺泡中 吞噬细胞吞噬 在吞噬细胞内繁殖 导致 巨噬细胞裂解释放出的细菌 释放出大量细 菌在肺泡内引起渗出性炎症即为原发性灶。细菌 随淋巴管到达肺门淋巴结，引起淋巴结肿大称原 发综合征 感染3-6周，机体产生特异性细胞免疫，同 时也产生迟发超敏反应
机体免疫力低下时，原发感染灶恶化，结核 分枝杆菌经气管淋巴道或血流播散，形成全身性 粟粒性结核 。 当机体抵抗力强时，使感染灶形成结核结节。 淋巴结病灶逐渐纤维化和钙化，不治自愈。但病 灶内常有一定量的细菌长期潜伏，不断刺激机体 产生免疫。也可成为以后内源性感染的来源
2 肺外感染 结核杆菌可经血液循环引起肺外感染， 如脑、肾、结核，痰被咽入可引起肠结核、 结核性腹膜炎等。一般认为血中播散的大 多是L细菌
(三) 免疫性 人类对结核分枝杆菌的感染率甚高，但发病率 不高。这表明人体对结核分枝杆菌有相当强的 免疫力。 （1）结核的免疫为有菌免疫或称传染性免疫 。这种免疫系指结核分枝杆菌(或BCG) 进入机 体后使机体对细菌再次入侵有免疫力；而当细 菌或其成分从体内彻底消失后机体的免疫力也 随之消失。遗传因素决定对结核病的易感染性 ， HLA-Bw15为易感个体。
（三）抵抗力 结核分枝杆菌因细胞壁含有大量脂类，故对 理化因素抵抗力较强。耐干燥，在干燥的痰内 可存活6-8个月。含有结核分枝杆菌痰液的尘埃 经8-10d仍有传染性。此菌对化学消毒剂的抵抗 力也较一般细菌强，在3%HCl或6%H2SO4中不被杀 死。因此常用于处理有杂菌污染的检材，以便 进行分离培养。对湿热敏感，60℃30min可杀死 细菌；在70%-75%乙醇中数分钟即被杀死 ，对 紫外线敏感
结核病诊断细菌学检验规程
结核病诊断细菌学检验规程一、样本采集结核病诊断细菌学检验的样本主要包括痰液、肺泡灌洗液、血液等。
采集样本时应遵守无菌操作原则，避免交叉感染。
样本采集后应尽快送检，并注明采样时间、病人姓名、年龄、性别、疾病等信息。
二、样本处理1.痰液处理：将痰液放入无菌容器中，加入等量1%氢氧化钠溶液，混合均匀，作用15分钟后用无菌水冲洗2～3次，再取沉淀物涂片检查。
2.肺泡灌洗液处理：将肺泡灌洗液过滤后，离心沉淀，取沉淀物涂片检查。
3.血液处理：抽取病人静脉血5～10毫升，离心沉淀，取沉淀物涂片检查。
三、抗酸染色涂片染色采用萋-尼氏染色法，涂片干燥后用萋-尼氏染色液染色，然后用碳酸钠溶液冲洗，最后用无水乙醇脱色，晾干后镜检。
抗酸染色阳性表明涂片中有抗酸菌存在，可用于初步诊断结核病。
四、培养法将处理后的样本接种在罗氏培养基或改良罗氏培养基上，置37℃恒温箱中培养。
结核分枝杆菌在此培养基上生长缓慢，需时约6～8周。
培养阳性表明有结核分枝杆菌生长，可用于确诊结核病。
五、药敏试验药敏试验用于检测结核分枝杆菌对药物的敏感性。
试验方法有多种，如纸片法、比例法等。
药敏试验结果可作为选择和调整抗结核药物的依据。
六、鉴定与分型通过形态学、生化反应和基因鉴定等方法对结核分枝杆菌进行鉴定与分型。
这些方法有助于了解结核病的传播途径和特点，为预防和治疗提供依据。
七、质控与报告发放结核病诊断细菌学检验的质控包括室内质控和室间质评。
室内质控主要是对检验过程进行质量控制，包括试剂质量、仪器校准等；室间质评则是通过参加实验室间的比对试验来评估检验结果的准确性。
检验结果经审核后发放给临床医生或病人。
报告应包含样本采集时间、病人信息、检验方法、检验结果等内容。
结核菌药物敏感性测定
结核菌药物敏感性测定标准化操作及质量保证手册国家结核病参比实验室2010年3月前言结核病细菌学检查是结核病控制规划重要的组成部分，随着现代结核病控制策略（DOTS）在我国的广泛实施，以及结核病控制三大目标的全面实现，结核病防治政策与技术策略有了很大的发展，在继续扩展高质量的DOTS的基础上，积极应对耐多药肺结核（MDR-TB）、结核菌/艾滋病病毒（TB/HIV）和其他挑战。
为满足当前结核病防治工作的需要，结核病实验室的工作任务也从之前的以痰涂片镜检发现传染性肺结核病人为重点，扩展到细菌学诊断、耐药结核病诊断等更加广泛的服务领域。
结核分枝杆菌药物敏感性测定（简称）是耐（多）药结核病防治中必不可少的重要工具，其主要作用是诊断耐药结核病、选择和调整耐药结核病治疗方案、开展耐药监测以了解某一地区结核分枝杆菌的耐药水平。
目前耐多药结核病规划性管理（PMDRTB）已在我国部分地区开展了试点，并将以较快的速度在全国扩展。
但在我国公共卫生领域，分枝杆菌药敏试验开展得并不普遍，大部分结核病防治机构的结核病实验室没有相应的经验和技术，缺乏系统的标准化文件，存在标准不一致、操作不规范、质量良莠不齐的问题。
为进一步规范药敏试验的操作，保证工作质量和试验人员安全，国家结核病参比实验室与世界卫生组织合作，编制了本册《结核分枝杆菌药物敏感性测定标准化操作手册》，详细描述结核菌药敏试验各个过程的操作程序。
目前世界卫生组织推荐的药敏试验方法包括比例法、绝对浓度法和液体培养法。
其中比例法为目前我国流行病学监测和耐多药结核病规划管理项目所采用的方法，将在本手册中重点介绍。
绝对浓度法是我国三十多年沿用的药敏试验方法，为目前我国大多数结核病专科医院常规使用的用于临床检测的方法，本手册也有独立章节进行描述，方法引自《中国防痨协会结核病诊断实验室检验规程》。
本手册参考世界卫生组织系列的结核病实验室标准化操作程序（SOP）的主要框架和内容，按照我国结核病规划的实际情况和具体要求进行了调整，并通过在部分省份的试点进一步进行了修改和完善，使之更具有可操作性，供开展药敏试验的实验室使用。