结核分枝杆菌对吡嗪酰胺的药物敏感性试验分析

结核分枝杆菌对吡嗪酰胺的药物敏感性试验分析[摘要] 目的研究吡嗪酰胺对结核杆菌的药物敏感性，分析结核分枝杆菌对吡嗪酰胺的耐药现况，为结核病的临床用药和防治工作提供参考。

方法对复活传代成功的结核分枝杆菌进行抗酸染色后，采用绝对浓度法的间接法，选用含缓冲对的蛋黄琼脂培养基，对结核杆菌菌株进行吡嗪酰胺的药物敏感性测定。

结果测定的60株结核分枝杆菌中有15株敏感，44株耐药，一株未生长。

结核分枝杆菌对吡嗪酰胺敏感率为25.42%（15/59），耐药率为74.58%（44/59）。

结论随着吡嗪酰胺被广泛使用治疗，结核分枝杆菌对吡嗪酰胺的耐药性不断增高，目前耐药性比较高，临床用药时必须谨慎使用或联用其他药物有效治疗。

[关键词] 结核分枝杆菌；吡嗪酰胺；药敏试验；耐药性[中图分类号] r969.2 [文献标识码] a [文章编号] 2095-0616（2013）01-31-03结核病（tuberculosis，tb）是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染性疾病，是现在世界上最普遍和最严重的人类传染病之一，也是全世界由单一致病菌致死最多的疾病之一。

由于耐药性结核杆菌的出现与传播、艾滋病的流行以及人口的频繁流动等原因，结核病疫情呈现全球性回升。

吡嗪酰胺（pyrazinamide，pza）作为治疗结核病最有效的一线药物之一，而被广泛应用于短程化疗方案中，最终导致耐吡嗪酰胺的结核菌也越来越多，因此进行pza耐药性的检测，对临床治疗及控制结核病具有重要的意义。

但由于吡嗪酰胺仅在ph为5.5～5.6的酸性条件下才能转化为杀菌的吡嗪酸，而结核菌在酸性条件下生长很差，甚至不生长，从而导致吡嗪酰胺的药敏试验一直是实验室中的一个难题[1]。

目前，最常用于结核杆菌药敏试验的罗氏培养基的ph为6.5～6.8，将其调至ph为5.6则不适用结核菌良好生长，故难应用于pza药敏试验[2]。

然而应用蛋黄琼脂培养基测定结核杆菌对pza药物敏感程度与应用罗氏培养基相比，可保证培养基在5.50～6.65范围内，在此环境中结核菌可以生长，pza也可以发挥抑菌作用[3]。

本试验运用罗氏培养基复活结核杆菌再用含有缓冲对的蛋黄琼脂培养基做药敏试验。

由于吡嗪酰胺在体内抑菌浓度为12.5μg/ml，达到50μg/ml可杀灭结核杆菌，且本品在细胞内抑制结核杆菌的浓度比在细胞外低10倍，再参照文献[3]，最后对60株传代复活的结核菌株进行含吡嗪酰胺浓度为50μg/ml的药敏试验，进而对吡嗪酰胺的耐药情况进行分析研究，为临床用药治疗提供参考。

1 材料与方法1.1 菌株来源2005年11～12月中旬和2006年3～5月中旬，在广州市黄石医院检查为疑似肺结核患者的痰液接种于罗氏培养基培养并保存于4℃冰箱的结核分枝杆菌菌株，当时病例发病前均无服用过抗结核药物，或接受抗结核治疗不足1个月。

结核参考菌株（h37rv敏感株）由广州市胸科医院提供，在4℃冰箱保存。

1.2 结核分枝杆菌的复活1.2.1 培养基的成分配制酸性罗氏培养基。

成分：谷氨酸纳（纯度95%以上）3.6 g， kh2po4 7 g，mgso4·7h2o 0.12 g，枸椽酸镁 0.3 g，甘油6 ml，蒸馏水300 ml，马铃薯淀粉15 g，新鲜鸡卵液500 ml，2%孔雀绿水溶液10 ml。

1.2.2 制备方法各盐类成分溶解后，加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴煮沸1 h呈糊状（不时摇动，防凝块），待冷后，加经消毒纱布过滤的新鲜鸡卵液，混匀，再加入2%孔雀绿水溶液，混匀，分装于经121℃高压灭菌的中型试管，每管加培养基7 ml，斜置血清凝固器内1～2层，斜面高度占试管2/3，90℃ 1.5 h或85℃ 1 h间歇两次（加热使培养基凝固）。

冷却后，37℃无菌试验24 h。

培养基斜面颜色鲜艳，表面光滑无泡，有一定韧性和酸碱缓冲能力，4℃保存，1个月内使用。

1.2.3 接种方法用接种环挑取1～2环保存于4℃冰箱的结核菌菌株，转接于酸性罗氏培养基，在斜面密集接种。

每株结核菌同时接种两支酸性改良罗氏培养基，每管要做好标记。

此转接过程需在生物安全柜里进行，注意无菌操作及个人防护措施。

然后放于37℃恒温箱培养。

每周观察1次，记录细菌生长情况，2～3周为止（视结核菌生长情况而定）。

1.3 抗酸染色试验由于结核分枝杆菌为抗酸菌，用接种环取复活的结核杆菌1～2环，均匀涂于含有少量生理盐水的载玻片上，待自然干燥，微火焰固定，抗酸染色镜检。

在蓝色背景上呈红色的为抗酸菌，确证为结核分枝杆菌。

1.4 药敏试验具体操作参照文献[3]及一种新的吡嗪酰胺耐药测定培养基的研制及结核病诊断细菌学检验规程[4]。

1.4.1 药品吡嗪酰胺（广东华南药物有限公司，h51020878），纯品，片状。

1.4.2 培养基蛋黄琼脂培养基。

配制方法如下：（1）基础液配制。

磷酸氢二钠5.0 g，枸橼酸2.1 g，磷酸二氢钾2.4 g，枸橼酸镁0.6 g，天门冬素（味精）3.6（7.2）g，甘油12 ml，2%孔雀绿20 ml，琼脂27.0 g，蒸馏水600 ml。

将上述成分高压灭菌后保持在60～65℃水浴待用。

（2）稀释蛋黄液。

用新鲜鸡蛋，在无菌条件下将蛋清除净，留蛋黄。

350 ml蛋黄加灭菌蒸馏水（60～65℃）1 000 ml摇匀，置60～65℃水浴待用。

（3）含吡嗪酰胺培养基的配制。

无菌条件下，将基础液与蛋黄稀释液按6 ： 10的比例混合摇匀，用精密到5.4的ph试纸测定其ph值，固定磷酸氢二钠的量，加入枸橼酸调节凝固前培养基的ph值为5.4左右，结果多加枸橼酸0.1 g。

根据文献[3]介绍，按照上述比例配制，培养基凝固前（50℃）ph值为5.41，凝固后（室温）ph为5.63，符合吡嗪酰胺药敏试验要求。

然后取部分上述蛋黄培养基分装于经高压灭菌的中型试管，每管6 ml，置于斜面凝固，用作不含药的对照培养基。

按剩余培养基的量计算，加入一定量的粉状pza，制成浓度为50μg/ml 的含吡嗪酰胺药物培养基。

同样每管6 ml分装于经高压灭菌的中型试管，置于斜面，凝固后待用。

1.4.3 菌悬液的制备刮取初生长2周的培养物或经2次传代后生长2～3周的亚培养物（刮取斜面各个部分的培养物），置于装有少量0.5%tween-80生理盐水的试管壁上，用玻璃棒研磨成乳酪状并混于0.5%tween-80生理盐水内，与麦氏标准比浊管比浊，配成1 mg/ml菌悬液。

1.4.4 接种方法将1 mg/ml的菌悬液10倍稀释至10～2 mg/ml，以灭菌吸管准确吸取0.1 ml分别接种于含药培养基和对照培养基的斜面上，各管的接种量均为3～10 mg。

置37℃孵育，4周观察结果。

1.4.5 质控每批药敏试验应以结核分枝杆菌参考菌株（h37rv）检测含药培养基质量。

1.4.6 结果判定标准根据结核分枝杆菌的菌落特点，在酸性罗氏培养基中形成颗粒状或菜花形的乳酪色的粗糙型菌落，数量大时则是巧克力色判断结核杆菌生长情况。

对照培养基菌落数必须在200以上且无融合。

若菌落数低于50时，重新做药物敏感性测定。

（-）：培养基斜面上无分枝杆菌菌落生长。

（+）：菌落数约占斜面面积的1/4。

（2+）：菌落数约占斜面面积的1/2。

（3+）：菌落数约占斜面面积的3/4。

（4+）：菌落呈菌苔样生长。

菌落数少于20个时，报告菌落数。

含药培养基菌落数少于20个时，当作不生长。

低浓度含药培养基上生长的菌落数多于20个时，即可判定为耐药。

低浓度生长、高浓度不生长为中度耐药；高、低浓度均生长为高度耐药。

1.5 统计学处理所有数据采用spss13.0统计学软件进行处理，计数资料采用x2检验，以p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 实验组与对照组菌株培养情况60株培养结核菌株，对照培养基中有1株没有生长，其余59株均生长，结果为4+，长满整个斜面。

菌落数均在200以上无融合。

浓度50μg/ml的含药培养基中，除了对照中没有生长的1株外，其余59株中有15株生长，长满整个斜面（4+），为敏感株；有44株一样长出结核杆菌菌落（4+），为耐药株。

可见，药敏试验是有意义的。

见表1。

2.2 59株结核杆菌菌株对吡嗪酰胺敏感性测定结果测定的60株结核分枝杆菌中有15株敏感，44株耐药，1株未生长。

结核分枝杆菌对吡嗪酰胺敏感率为25.42%（15/59），耐药率为74.58%（44/59）。

3 结论吡嗪酰胺于zhang y等[5]在1940年由在合成氨基吡啶过程中作为一种中间化合物首次被合成的，它的抗结核菌活性于1952 年被yeager等发现。

但其与利福平和异烟肼联用治疗结核病显著缩短化疗时间的独特作用是在其用于治疗结核病29年之后的1981年才见报道[6]。

往后，吡嗪酰胺在临床用药时常与其他抗结核药（如链霉素、异烟肼、利福平及乙胺丁醇）联合，用于治疗结核病。

pza 是一种烟酰胺类似物，与异烟肼相似也是一种抗mtb的原药，但其发挥作用所要求的环境不同，吡嗪酰胺需要在酸性环境才表现抗菌活性且最低抑菌浓度（mic）与ph值在7.0以下存在好的正相关性[7]。

吡嗪酰胺通过被动扩散进入mtb细胞内，在mtb细胞内由吡嗪酰胺酶（pzase）将其转化为具有抗mtb活性形式的吡嗪酸，所以pzase活性对吡嗪酰胺表现抗mtb活性是必需的。

目前，随着临床上广泛应用吡嗪酰胺，导致结核分枝杆菌对吡嗪酰胺的耐药性不断升高。

敖军平等[8-9]在结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的噬菌体检测技术与耐药基因突变研究中对109株结核分枝杆菌临床分离株进行pza耐药性测定，常规绝对浓度药敏法检测结果为敏感35株，耐药74株；phab法检测结果为敏感34株，耐药75株，与绝对浓度法检测结果的符合率为91.7%。

两种方法测得结核杆菌对吡嗪酰胺的耐药率分别为67.89%，68.81%。

本次试验结果显示，结核分枝杆菌对吡嗪酰胺的耐药率高达74.58%。

相对于以往2.4%[3]的耐药率，可见结核杆菌对吡嗪酰胺的敏感性大幅度下降，在未来的结核病防治工作中一定要对吡嗪酰胺的耐药性加以监控并且在临床用药治疗时一定先谨慎检测患者结核杆菌对吡嗪酰胺的耐药程度，合理用药。

结核分枝杆菌对吡嗪酰胺的药物敏感性大幅度下降也使得结核杆菌对吡嗪酰胺耐药机制研究受到关注。

由于编码吡嗪酰胺酸的pnca基因突变而引起吡嗪酰胺酶活性下降是导致对吡嗪酰胺天然敏感的结核分枝杆菌产生继发性耐药的主要原因，牛分枝杆菌及其他分枝杆菌均对吡嗪酰胺天然耐药，其机制各不相同[10]。

出现这种情况很多都是由于治疗过程中不合理的联合用药、间断用药、不执行归口管理与治疗等。

所以在今后的结核病防治工作中，重点为社会性综合防治措施，抓好结核患者的发现、登记、管理和合理治疗，定期做好吡嗪酰胺耐药性的检测，了解其耐药情况，指导临床合理用药以降低其耐药率。