高二生物植物的组织培养

第5章 植物的组织 培养
植物组织培养基的配制 烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立
实验目的： 1.掌握植物组织培养基(MS)的配制(Murashige and Skoog) 2.通过实验，掌握无菌操作方法，熟悉烟草愈伤组织的诱导及 再生体系的建立的整个过程。 3.学习再生体系的建立方法，为掌握其他植物的组织培养奠定 基础；同时为转基因技术提供一个平台。
注意事项： 1.实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。 2.用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀性的 药品，应将其放在小烧杯中称量。 3.各种母液应保存在2-4摄氏度的冰箱中，以免变质、长霉。 4.用高压灭菌锅时，一定要先检查一下其中的水是否合适。
接种： 在无菌的条件下，取烟草无菌苗的叶片， 剪成（0.5～1cm）*(0.5～1cm)大小的小块， 接种于诱导培养基MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L中诱导愈伤组织，在此培养基上 能诱导出愈伤组织并能够诱导出不定芽。 不定芽生根： 将在愈伤组织中生成的不定芽移栽到1/2 MS培养基中，其目的是诱导不定芽生根， 使其发育成烟草小植株。
3.灭菌： 通常培养基应在汽相121摄氏度的条件下在 高压灭菌锅内灭菌20 min。 在高压灭菌锅的加热过程中，在气压指针上 升到0.05 Mpa时，放一次气，然后在温度达121 摄氏度时，保持此压力灭菌15-20 min。灭菌完 成后，待灭菌锅的压力降到0时，打开灭菌锅， 取出培养基，放平，待培养基凝固后备用。
接种第一天
接种第二天，因为外植体细胞开始被诱导脱分化， 并不断分裂增殖，造成叶片中央与边缘的细胞分 裂不均匀，因此，叶片中央凸起。
接种第五天，脱分化细胞不断分裂增殖，形成愈伤组织， 表现为叶片边缘泛黄增厚，叶片中央进一步凸起。
接种第九天，脱分化细胞不断增值，愈伤组织 不断增厚，整个叶片都翘起，并且已经开始再 分化形成绿色生长点。
169.02 287.54 61.83 166.064 241.95 分析纯 237.93 249.68
汉语名
硫酸亚铁
分子式
FeSO4.7H2O C2H5NO2 C8H11O3N.HCl
生产公司

372.24 278.01
纯度
分析纯 分析纯
乙二胺四乙酸钠 Na2-EDTA.2H2O
植物材料灭菌的常用药品和原理 1.乙醇： • 原理：脱水作用和溶脂性，从而使Protein脱水、 变性、沉淀及质膜破损、透性增加，使微生物致死。 • 使用浓度：70％（V/V） • 灭菌时间：5－60 s 2.次氯酸盐： • 原理：在水中形成次亚氯酸（HClO），HClO分解 后形成盐酸和新生态氧（ HClO→HCl+〔O-〕）， 〔O-〕具有很强的 氧化性而具有杀菌作用。 • 使用浓度：0.5％－2.5％的有效氯 • 灭菌时间：5－15 min
1号 2号
50 50
3号
ZnSO4.7H2O MnSO4.4H2O H3BO3 NaMoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O KI
Na2－EDTA FeSO4 .7H2O VB1 VB6 甘氨酸 烟酸（VB3） 肌醇 蔗糖 琼脂
8.6 22.3 6.2 0.25 0.025 0.025 0.83
37.3 27.8 0.4 0.5 2 0.5 100 3％ 0.6％－1.2％
430 1115 310 12.5 1.25 1.25 41.5
746 556 20 25 100 25 1000
500 （扩大100倍）
10
4号
100 （扩大200倍） 500 （扩大100倍） 100
5
5号
10
6号 7 8
3.升汞（HgCl2）： • 原理：汞离子可与带负电荷的蛋白质 结合，使菌体蛋白变性，酶失活。其 杀菌效力极强。 • 使用浓度：0.1-0.2％（W/V） • 灭菌时间：10 min 4.新洁尔灭： • 原理：广谱表面活性灭菌剂。 • 使用浓度：1：200（V/V） • 灭菌时间：30 min或更长
10 30 g 8g
大量元素 (20倍)
KNO3 NH4NO3 MgSO4· 7H2O
MS母液配制用量g.L-1 38 33 7.4
每升培养基取用量mL/L
50
KH2PO4
CaCl· 2 H2 O
3.4
8.8 4.46 1.72 1.24 0.166
微量元素 (200倍)
MnSO4· 4H2O ZnSO4· 7H2O H3BO3 KI
实验步骤：
1.母液的配制：
见MS培养基配制表
2.培养基的配制： 1）称取一定量的蔗糖，溶解于适量蒸馏水中（不能太 多），倒入500ml容量瓶中。 2）吸取各种母液（吸取量根据培养基的最终体积决 定），加入到上述容量瓶中。 3）吸取各种激素（所配制的培养基是：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L ），加入到上述容量瓶中。 4) 定容到500 ml。 5）将上述溶液调pH值到5.8-6.0。 6) 将上述溶液加入琼脂后，于电炉上煮沸。 7）将上述培养基冷却至40-50 摄氏度后，将其分装到 100 ml三角瓶中。 8）将三角瓶用封口膜封口。并对不同的培养基做好标 记。
MS培养基配制表
母液 化合物 NH4NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2 含量（终浓度） mg/L 1650 1900 170 370 440 称量（mg） 16500 19000 1700 3700 4400 母液 配制量（ml） 500 （扩大20倍） 同上 吸取量 （ml/L）
细胞分裂素类
• 在组培中的作用：促进细胞分裂和由callus或器官上 分化不定芽。
• 常用种类及作用：BAP（苄氨基嘌呤）、6－BA（苄 基腺嘌呤），zip（异戊烯氨 基嘌呤）和KN（激动素） • 使用时先配成母液，母液的浓度一般为0.1 mg/ml或 • 1 mg/ml；配时一般溶于0.5或1 mol/L的HCl或稀薄的 NaOH中，再定容。
5 5
生长素类
• 在组培中的作用：诱导细胞的分裂和根的分化。 • 常用种类及作用：IAA(吲哚乙酸)、 NAA、 IBA、 NOA（萘氧乙酸）、 2.4－D、 2.4.5－T（三氯苯 氧乙酸） • 使用时先配成母液，母液的浓度一般为0.1 mg/ml 或1 mg/ml；配时一般先将其粉末溶于95％乙醇或 0.1 mol/L的NaOH中，再定容。
实验用品： 1.仪器和用品：500 ml试剂瓶1个；100 ml试剂瓶5个； 250 ml试剂瓶4个；高压灭菌锅；电子天平； 烧杯（大、中、小各2个）、玻璃棒、移液管、 搪瓷缸、培养瓶、电炉、pH计或精密pH试纸、 容量瓶（大、中、小各1个）
2.化学药品及试剂
汉语名 硝酸铵 磷酸二氢钾 硝酸钾 硫酸镁 氯化钙 硫酸锰 硫酸锌 硼酸 碘化钾 钼酸钠 氯化钙 五水硫酸铜 分子式 生产公司 分子量 NH4NO3 上海通亚精细化工厂 80.04 KH2PO4 中国江苏南京中山集团公司化工厂 136.09 KNO3 上海鑫达精细化工有限公司 101.10 MgSO4.7H2O 山东省化工研究院 246.47 CaCl2.2H2O (上海)四联化工厂 147.03 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CaCl2.6H2O CuSO4.5H2O 上海试剂工厂 山东潍坊市试剂厂 济南化学试剂厂 上海化学采购站 北京五十六0一化工厂 济南试剂总厂 济南化学试剂厂 纯度 分析纯
甘氨酸 盐酸吡哆醇 盐酸硫胺素
中国科学院上海生物化学研究所 中国医药上海化学试剂站 中国新兴化工试剂研究所
75.07 205.64 337.27
分析纯
C12H17ClH4OS.HCl
烟酸
肌醇
C6H5NO2
C6H12O6
北京芳草医药化工研制公司
中国政翔化学试剂研究所
123.11
180.16
化学纯
3-吲哚乙酸IAA（b-Indoleacetic acid） 天津天泰精细化工品有限公司 萘乙酸 NAA 叶酸 C12H10O2 C19H19O6N7 中国医药上海化学试剂公司 上海化学试剂厂
第九天（诱导生成愈伤组织）
接种第十九天，绿色生长点进一步发育形成了不定芽， 不定芽长度最长可达1 cm 。
第十九天（长出幼叶）
将不定芽在无菌条件下，从芽的基部切下，然后插入生根培养基 中（1/2 MS），诱导生根。
芽的生根情况
5
NaMoO4· 2 H2 O
CuSO4· 5 H2 O CoCl· 6 H2 O
0.05
0.005 0.005 7.46 5.56 0.2 0.05 0.01 0.05 0.01
铁盐 有机附加物 (200倍)
Na2-EDTA· 2 H2 O FeSO4· 7H2O 甘氨酸(氨基乙酸) VB6 VB1 烟酸 肌醇
125.1 186.21 441.42
分析纯 化学纯
2,4-D （2,4-dichlorophenoxyacetic acid ）上海雪满生物科技有限公司 6-BA（N6-benzylaminopurine） 上海伯奥生物科技有限公司 蔗糖 琼脂 sucrose Agar 天津市广成化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 225.25 342.29 分析纯 B.R