猪瘟的间接免疫荧光实验_畜牧兽医_农林牧渔_专业资料.ppt
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间接免疫荧光讲ppt课件
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 • 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。 阴性对照：阴性血清+荧光标记物 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 阳性对照：阳性血清+荧光标记物 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光， 阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 •
1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一 定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度 过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
注意事项
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原 而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右）， 高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如 流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长 染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多 。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三 缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
猪瘟ppt课件
71
疫苗质量问题 ：
质量差的疫苗免疫猪后，抗体水平不能达到防止 亚临床感染的水平，可引起亚临床感染 此猪不表现明显的临床症状，但终身带毒或散毒， 成为猪瘟病毒主要贮存宿主
72
母源抗体的干扰 ：
母源抗体对初生仔猪有保护作用，但也会影仔猪 的免疫效果，即母源抗体的双重性 因此，在给仔猪注射高质量猪瘟疫苗时，能否起 到良好的免疫效果与母源抗体滴度有关 当母源抗体滴度高时，免疫接种疫苗，病毒会被 抗体中和而起不到保护作用
4
病毒灭活取决于含有病毒的基质，60℃10分钟， 细胞培养液失去感染性；血液中病毒68℃30分钟， 不能使其灭活
该病毒在pH5-10条件下相当稳定，高于或低于该 pH时，病毒的感染性很快被破坏 脂溶剂如乙醚、氯仿很快灭活病毒，病毒对于2% 氢氧化钠、氯制剂和复合醛等药物敏感
5
猪是CSFV惟一的自然宿主和重要的传染源，患病 猪和可疑猪的直接接触是主要的传播方式 CSFV可通过口、鼻、泪腺分泌物、尿液和粪便排 泄出来 怀孕母猪接触慢性CSFV毒株时，病毒可以传播给 子宫中的胎儿
2
CSFV只有一个血清型，毒力变化很大
强毒株可以引发急性疫病和高死亡率，中等毒力 毒株一般引起亚急性或慢性传染，慢毒株可以引 起猪胎儿和新出生的仔猪死亡 CSFV的毒力特性不稳定，经过猪一代或多代传代 后观察到毒力增强
3
培养猪瘟病毒最常用的是猪肾细胞，病毒在胞浆 中复制，不引起细胞病变 病毒可能在细胞胞浆内成熟，这与在感染细胞的 表面检测不到病毒抗原相一致
21
间接免疫荧光讲ppt课件
• 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
阳性对照：阳性血清+荧光标记物
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，
阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
.
7
4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就
有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在 当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐 渐下降。
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
荧光显微镜、玻片架、滤. 纸、37℃温箱等。
3
实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体
标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷 盒内，37℃保温30min。
体。
.
2
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
.
6
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
• 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。
荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。
阴性对照：阴性血清+荧光标记物
.
5
《间接免疫荧光实验》课件
的准确性和可靠性。
培训与技能 提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结 果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面 的抗原，研究细胞结构和 功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体， 如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并 将其与实验目的和预期结果进行 比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原 和抗体反应，探索免疫疾 病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生 虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类 。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、 封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样 本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样 本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察 和检测荧光标记物，提高实验 的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE
培训与技能 提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结 果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面 的抗原，研究细胞结构和 功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体， 如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并 将其与实验目的和预期结果进行 比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原 和抗体反应，探索免疫疾 病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生 虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类 。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、 封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样 本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样 本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察 和检测荧光标记物，提高实验 的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE
《间接免疫荧光法》课件
06
问题与展望
常见问题及解决方案
荧光染色不均
可能是由于抗体浓度过高或孵育 时间不足，解决方案是调整抗体
浓度和孵育时间。
非特异性染色
可能是由于血清内源性荧光物质干 扰，解决方案是使用去内源性荧光 物质处理。
荧光淬灭
可能是由于荧光物质不稳定，解决 方案是使用更稳定的荧光物质或采 用避光染色技术。
研究展望
01
02
03
04
医学诊断
用于检测和诊断各种疾病，如 自身免疫性疾病、感染性疾病
等。
生物学研究
用于研究细胞表面抗原、细胞 内抗原等，以及探索细胞与细
胞之间的相互作用。
农业科研
用于检测植物病毒、细菌和真 菌等病原微生物，以及研究植
物抗病性等。
环境监测
用于检测环境中的有害物质和 污染物，如重金属、农药等。
优化抗体标记技术
探索更高效、特异性和稳定的抗体标记技术 ，提高荧光染色的敏感度和特异性。
深入研究荧光物质
研究荧光物质的性质和作用机制，为提高染 色效果提供理论支持。
拓展应用领域
将间接免疫荧光法应用于更多疾病的研究和 诊断，如肿瘤、感染性疾病等。
建立标准化操作流程
制定标准化的操作流程和质控标准，提高实 验结果的可靠性和可比性。
通过使用针对特定抗原的抗体 ，间接免疫荧光法能够特异地 识别和标记目标抗原。
定位准确
间接免疫荧光法能够准确地定 位抗原的位置，有助于了解抗 原在细胞或组织中的分布情况 。
可视化结果
通过荧光显微镜观察，间接免 疫荧光法能够直观地展示抗原 的存在和分布，便于结果的解
读和分析。
局限性
抗体依赖
间接免疫荧光法依赖于针对特定抗原的抗体，如果抗体不适用或不可 获得，该方法可能无法应用。
间接免疫荧光讲ppt课件
荧光显微镜、玻片架、滤纸、37℃温箱等。
实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体 标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷 盒内，37℃保温30min。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三 缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性 荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+） 荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（ +++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧 光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为 （±）或（-），即可判定为阳性。
4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就 有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在 当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐 渐下降。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一Βιβλιοθήκη （内铺一层浸湿的纱布垫）3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 • 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。 阴性对照：阴性血清+荧光标记物 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 阳性对照：阳性血清+荧光标记物 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光， 阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 •
实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体 标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷 盒内，37℃保温30min。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三 缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性 荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+） 荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（ +++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧 光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为 （±）或（-），即可判定为阳性。
4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就 有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在 当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐 渐下降。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一Βιβλιοθήκη （内铺一层浸湿的纱布垫）3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 • 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。 阴性对照：阴性血清+荧光标记物 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 阳性对照：阳性血清+荧光标记物 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光， 阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 •
正向间接血凝检测猪瘟抗体水平 猪瘟抗体检测 猪病防治课件
+++：血细胞凝集, 布满孔底, 边缘不整齐, 有 时卷曲成荷叶状。
出现“++” 以上凝集者判为阳性。
六、临床应用
1、间接血凝抗体滴度在1：32-1：64时，攻毒 可获得100%保护，1：16-1：32时有80%保护， 1：8时则完全不能保护。
2、猪瘟间接血凝实验适用范围 （1）检测仔猪母源抗体水平 （2）猪瘟疫苗免疫猪群抗体水平的监测 （3）测定猪瘟抗体消长时间
8、加间接血凝抗原 在第1排1－6孔和对照孔各 加血凝抗原25ul.
9、振荡 血凝板在振荡器上或用手轻拍摇动， 使诊断液中的红细胞与血清混匀。
10、盖上与血凝板相符的玻璃板，以防水分蒸 发，在室温下（10-36℃）静置2h判断结果。
五、结果断
1、先检查对照孔是否合格 阴性血清对照和 稀释液对照孔，红血球应全部沉入孔底，无凝 集现象(－)或呈阳性(+)的轻度凝集为合格；阳 性血清对照应呈(++)凝集为合格。
正向间接血凝检测猪瘟抗体水平
• 一、实验目的 掌握间接血凝测定猪瘟抗体的方法
• 二、材料用具 猪瘟间接血凝抗原（猪瘟正向血凝诊断液）、
阳性对照血清、阴性对照血清、稀释液、待检 猪血清样品、96孔110°微量血凝板 、微量移 液器10-100微升 、玻璃板。
三、反应原理
将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒 性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用， 在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现 象，称间接凝集反应或被动凝集反应。以红细胞为 载体的间接凝集反应叫间接血凝。
4、稀释待检血清 用微量移液器向血凝板的第1 孔-6孔各加稀释液50ul，吸待检血清50ul加入第 1孔，混匀后从中取出50ul加入第2孔，依此类 推直至第6孔混匀后弃去50ul，第1孔-6孔的血 清稀释度依次为1：2，1：4，1：8，1：16，1： 32和1：64。
出现“++” 以上凝集者判为阳性。
六、临床应用
1、间接血凝抗体滴度在1：32-1：64时，攻毒 可获得100%保护，1：16-1：32时有80%保护， 1：8时则完全不能保护。
2、猪瘟间接血凝实验适用范围 （1）检测仔猪母源抗体水平 （2）猪瘟疫苗免疫猪群抗体水平的监测 （3）测定猪瘟抗体消长时间
8、加间接血凝抗原 在第1排1－6孔和对照孔各 加血凝抗原25ul.
9、振荡 血凝板在振荡器上或用手轻拍摇动， 使诊断液中的红细胞与血清混匀。
10、盖上与血凝板相符的玻璃板，以防水分蒸 发，在室温下（10-36℃）静置2h判断结果。
五、结果断
1、先检查对照孔是否合格 阴性血清对照和 稀释液对照孔，红血球应全部沉入孔底，无凝 集现象(－)或呈阳性(+)的轻度凝集为合格；阳 性血清对照应呈(++)凝集为合格。
正向间接血凝检测猪瘟抗体水平
• 一、实验目的 掌握间接血凝测定猪瘟抗体的方法
• 二、材料用具 猪瘟间接血凝抗原（猪瘟正向血凝诊断液）、
阳性对照血清、阴性对照血清、稀释液、待检 猪血清样品、96孔110°微量血凝板 、微量移 液器10-100微升 、玻璃板。
三、反应原理
将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒 性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用， 在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现 象，称间接凝集反应或被动凝集反应。以红细胞为 载体的间接凝集反应叫间接血凝。
4、稀释待检血清 用微量移液器向血凝板的第1 孔-6孔各加稀释液50ul，吸待检血清50ul加入第 1孔，混匀后从中取出50ul加入第2孔，依此类 推直至第6孔混匀后弃去50ul，第1孔-6孔的血 清稀释度依次为1：2，1：4，1：8，1：16，1： 32和1：64。
间接免疫荧光讲ppt课件
荧光显微镜、玻片架、滤纸、37℃温箱等。
实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体 标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷 盒内，37℃保温30min。
间接免疫荧光讲
基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原 反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧 光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗 原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病 毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免 疫病理检查。染色程序分为两步，第一步，用未知 未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上， 在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然 后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标 记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步 发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和 已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗 体。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三 缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体 标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷 盒内，37℃保温30min。
间接免疫荧光讲
基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原 反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧 光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗 原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病 毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免 疫病理检查。染色程序分为两步，第一步，用未知 未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上， 在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然 后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标 记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步 发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和 已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗 体。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三 缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。