Glypican-3与原发性肝癌

Glypican-3及其与原发性肝癌关系的研究进展罗飞兵张焜和*南昌大学第一附属医院消化内科，江西省消化疾病重点实验室，南昌330006摘要Glypican-3（GPC3）为Glypican家族中的一员，属膜性（membranous）硫酸乙酰肝素多糖蛋白。

在哺乳动物的胚胎期，GPC3通过影响多个分子信号通路而对组织器官的发育起重要调控作用，其功能缺失将导致过度生长和畸变综合征（SGBS）。

成人GPC3的异常表达与多种肿瘤的发生发展关系密切。

GPC3在肝细胞癌（HCC）中表达上调，与HCC的生物学特性相关，在肝癌的早期诊断、生物治疗和预后评估中具有良好的应用前景。

关键词Glypican-3；原发性肝癌；分子机制；肝癌诊断；肝癌治疗磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（Glypican-3，GPC3）为Glypican家族的一员，在哺乳动物的胚胎期可通过影响多个分子信号通路而对组织器官的发生和生长发挥重要调控作用，其基因突变和功能丧失时导致过度生长和畸变综合征（Simpson-Golabi-Behmel Syndrome，SGBS）。

出生后GPC3异常表达与多种肿瘤的发生、发展关系密切，在乳腺癌和卵巢癌中为表达缺失，在肾癌、肺鳞癌、甲状腺癌、梅克尔细胞癌、胃癌、大肠癌等呈过表达。

在肝细胞癌（HCC）早期，GPC3即呈高表达，并认为对HCC有具有早期诊断价值。

本文在介绍GPC3的分子结构及其生物学功能的基础上，重点就其与HCC发生、发展和临床意义的研究进展作一综述。

1. Glypican-3的分子结构及其表达特点Glypican家族为膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白（heparan sulfate proteoglycan，HSPG），在脊椎动物有6个成员（GPC1~6）[1,2]。

它们的基本结构相似，包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素（HS）链和糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）。

HS链通过戊醛糖-半乳糖-半乳糖-葡萄糖醛酸（Xyl-Gal-Gal- GlcA）连接到核心蛋白的丝氨酸残基上，GPC蛋白通过GPI锚定于细胞外膜上。

HS可通过脱乙酰化、加硫酸盐、同分异构等而被修饰。

Glypican蛋白约含500个氨基酸，核心蛋白分子量约60-70kd，因有许多二硫化物连接着氨基酸残基，使核心蛋白整体呈球状结构。

靠近N-末端含有14个保守的半胱氨酸残基，C-末端约为序列相同的50个氨基酸残基。

人类GPC3基因最早由Pilia等[3]于1996年克隆，又称MXR7、OCI-5、GTXR2-2基因，与果蝇的Dally基因有同源性，定位于染色体Xq26.10区，全长>900Kb，是人类基因中最大的基因之一。

GPC3基因由8个外显子组成，5＇端上游2Kb为最小启动序列，启动子区内的转录因子结合部位包括6个SP1结构、7个AP2结构和2个CAAT盒，但无TATA盒，转录产物长度为2130bp，编码580个氨基酸残基的GPC3蛋白前体，分子量大小约为66kD。

哺乳动物的GPC3氨基酸残基序列90%以上相同[1]，在核心蛋白下游富含半胱氨酸结构区的下端，即第358位精氨酸和359位丝氨酸处可以被酶切割而分成两段，使N-端约含40Kd的GPC3蛋白成为可溶性蛋白片段，可分泌入血。

GPC3在人体内的表达有明显的组织特异性和组织分化时相特异性。

Iglesias *通讯作者，yfyzkh@等[4]将胚胎和胎儿期分为4个阶段（P1：5-8周，P2、P3、P4：9-28周），用免疫组化染色观察各器官系统的GPC3表达情况：肝实质细胞在4个阶段均有明显表达；原始胰腺和胰腺管仅在P1期高表达；原始泌尿生殖系统中，P1、P2期有弱表达，P3、P4期只在男性生殖系统有弱表达；四肢的间叶细胞只在P1期表达；P2、P3期的脊髓和脊髓神经背根有强表达，大脑无表达，而出生后到成人阶段，除在胎盘、乳腺、间皮、卵巢、肺及肾组织有弱表达外，其他正常组织无表达。

2 Glypican-3的生物学功能及其作用机制GPC3发挥作用的关键时段在胚胎及胎儿期，即在组织器官的形成、生长阶段扮演着重要角色，可能主要是负性调节作用，防止组织器官生长过大并在整体上调节身体大小[5]。

Liu等[6]用正常肝细胞进行体外实验，发现GPC3蛋白和mRNA表达同时达到高峰时，细胞分裂增殖开始下降，提示其负性调节肝细胞生长。

GPC3基因突变和功能丧失时，导致一种与X染色体偶联的疾病——SGBS[3]，表现为明显的脸部特征、巨舌、腭裂、并指（趾）、多指（趾）、多乳头、囊状和发育不良肾、隐睾、尿道下裂、先天性心脏病、肋骨和椎骨发育不良、脐疝或腹股沟疝、肌张力下降等，并增加患某些肿瘤的机率，如Wilms瘤、肝细胞癌等[7]。

Beckwith-Wiedemann综合征与SGBS的临床表现有许多相似处，前者是由于胰岛素样生长因子-II（IGF-II）过度表达所致的疾病，所以早期的研究者认为，在胚胎及胎儿期GPC3负性调节IGF-II的表达，当GPC3突变和功能丧失时，IGF-II出现过度表达，激活IGF-II信号通路而出现相关疾病[3]。

但Chiao等[8]比较分析了GPC3与IGF-II、IGF-I或IGF-I受体分别双突变后的症状，发现GPC3和IGF信号通路没有生物学和遗传学上的明显联系。

Song等[9]观测GPC3基因敲除鼠，也没有发现GPC3在胚胎及胎儿期执行生长调控作用与IGF信号通路有关，但却观察到其与Wnt信号通路的关系，即在胚胎期，GPC3通过刺激非经典Wnt/JNK信号通路抑制经典Wnt/β-catenin信号通路来发挥对器官生长的调控作用。

Filmus等[10]认为GPC3通过促进和稳定Wnt蛋白与其受体蛋白Frizzled的结合和相互作用而激活Wnt信号通路。

另有报道GPC3通过调节几种不同的生长因子如成骨蛋白2（BMP2）、BMP7、成纤维细胞生长因子7（FGF7）等来调控肾脏的形态发育[11]。

近期有研究者发现GPC3与刺猬分子信号通路（Hh）关系密切。

已知Hh 通路在胚胎发育期对胚胎生长和形体控制起着十分重要的作用，与细胞生长、分化及肿瘤的成长密切相关；在胚胎发育成熟后，Hh通路对肠道干细胞的增殖亦起到重要的调节作用。

持续的Hh信号通路激活可诱发组织器官过生长，并可诱发内胚性肿瘤。

Capurro等[12]研究发现，无GPC3表达的裸鼠胚胎中，Hh信号通路是增强的，在正常胚胎鼠的纤维原细胞中，GPC3通过高亲和地结合Hh蛋白而竞争性地抑制其与相应受体Patched结合，并促进刺猬蛋白内吞和降解，达到负性调控Hh信号通路，且认为SGBS病人至少部分原因归于Hh信号通路的过度激活[13]。

3. GPC3与原发性肝癌3.1 GPC3在肝细胞癌中表达上调及其机制出生后，GPC3表达缺失或过表达可能导致机体肿瘤的发生。

1997年有学者报道GPC3 mRNA在HCC组织中高表达，随后，越来越多的研究者证实在HCC组织中，不管是GPC3 mRNA还是蛋白均呈过表达。

GPC3的表达上调在HCC的早期即已发生[14,15]，但目前对GPC3在HCC中表达上调的机制和其对HCC发生、发展的影响尚不完全清楚。

Morford等[16]通过动物实验发现，Zhx2（一种转录抑制因子，包含2个锌指结构和4个同源异型结构域）能抑制成年鼠肝脏GPC3的表达，而通常在HCC 中，Zhx2基因表达沉默[17]，可能正是由于失去了Zhx2的抑制作用使得GPC3出现过度表达；还发现甲胎蛋白调节素2（Afr2）也能上调GPC3在肝癌细胞中的表达。

Lai等[18]研究发现，敲除了硫酸酯酶2（Sulfatase-2）基因的Huh细胞系其GPC3表达明显下降，并在裸鼠体内试验得到同样的结果，而增强Sulfatase-2的表达GPC3的表达也增强，故认为Sulfatase-2可上调GPC3表达。

3.2 GPC3促HCC生长的机制GPC3对HCC的发生、发展均有影响，其作用机制复杂而多样。

Kwack等[19]发现GPC3可抑制成纤维细胞生长因子2介导的细胞增殖，同时降低肝癌细胞与I型胶原、纤维连接蛋白之间的粘附力，增强细胞的迁移和侵袭能力。

Kittaka 等[20]证实GPC3蛋白是激活整合素（integrin）信号通路的关键蛋白之一，通过此信号通路可促进肝癌细胞的增殖和增强其侵袭力。

但王冰等[21]将携带GPC3基因的重组真核表达载体（pEGFP-N2-GPC3）转染人肝癌细胞系SK-Hep-1后，发现细胞的增殖力和粘附力明显下降，而侵袭力则增强，认为GPC3能抑制肝癌细胞的增殖和粘附，促进其转移，这与Capurro等[22]的研究不完全一致，可能与选用的肝癌细胞系不同有关。

Cheng等[23]研究显示，转染GPC3基因的NIH3T3细胞系GPC3蛋白过表达，细胞呈失控制性生长，将低表达GPC3的PLC-PRF-5肝癌细胞系转为高表达，其生长速度明显增快，而敲除了GPC3基因的HuH-7细胞系生长受抑，并发现GPC3 N-末端富含脯氨酸的结构域可特异性地结合IGF-II和IGF-1R，激活IGF信号通路，从而促进肝癌细胞生长。

Capurro等[22]发现GPC3核心蛋白能与Wnts（如Wnt3a）形成复合物，表达GPC3的肝癌细胞对Wnt3a的结合能力更强，提示GPC3能增强肝癌细胞对Wnt的反应性。

另外发现GPC3能抑制肝癌细胞是β-catenin的降解，导致细胞质β-catenin大量堆积。

以上提示GPC3激活Wnt信号通路促进肝癌细胞的生长。

3.3 GPC3对HCC的诊断价值GPC3在肝癌与良性肝病的表达差异明显。

Llovet等[24]报道在丙型肝炎后肝硬化背景的早期肝癌组织中（<2cm的肝癌结节），GPC3表达率100%，其他良性肝病和正常肝组织中表达率为0。

缪辉来等[15]的研究结果显示：肝癌组织GPC3阳性表达率为81.5%，而癌旁及远肝癌组织无表达。

Wang等[25]用组织芯片技术免疫组化染色检测肝癌组织GPC3，发现有肝硬化背景的肝癌组织GPC3染色阳性率达90%，而正常肝脏背景下的肝癌组织GPC3阳性率为64%，肝脏高级别腺瘤和早期肝癌组织GPC3阳性率为48%，良性结节或低级别腺瘤组织GPC3阳性率仅3%，可以很好地把肝脏良性结节或肝脏腺瘤和肝癌区分开来，据此认为GPC3是早期肝癌诊断标志物，这与Wang等[26]的结论一致。

Di等[27]发现GPC3对早期肝癌诊断的敏感性是69%，特异性是91%。

Shirakawa等[28]比较了HCC 和ICC（肝内胆管癌）组织中GPC3表达情况，发现HCC表达率78.3%，而ICC 无表达，可以很好的区分两类肝癌。