CRISPR_Cas9新型基因打靶系统的研究进展
基于CRISPR Cas9技术的基因编辑研究进展
基于CRISPR Cas9技术的基因编辑研究进展基因编辑是一项近年来备受关注的生物技术，可以用于改变生物体的基因组。
CRISPR Cas9技术作为一种有效、精确的基因编辑工具，已经在科学界引起了广泛的兴趣和研究。
本文将对基于CRISPR Cas9技术的基因编辑研究进展进行介绍和探讨。
第一部分：CRISPR Cas9技术的原理CRISPR Cas9技术是一种基于细菌免疫系统的基因编辑工具。
CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”的缩写，意为“聚集规律间隔短回文重复序列”。
Cas9意为“CRISPR associated protein 9”，是CRISPR系统中的一个核酸酶。
这个复杂的系统由一系列的Cas蛋白以及一段短的引导RNA（gRNA）组成。
CRISPR Cas9技术的原理是通过引导RNA与Cas9蛋白结合形成复合物，这个复合物能够识别并结合到目标DNA的特定序列上。
一旦与目标DNA结合，Cas9蛋白将其剪切，从而导致DNA的损伤。
细胞为了修复这种损伤而进行自然修复过程，这个过程往往会产生不完全的DNA修复或添加、删除DNA碱基对的突变，从而改变了基因组。
第二部分：基于CRISPR Cas9技术的基因编辑应用基于CRISPR Cas9技术的基因编辑已经在多个领域展示了巨大的应用潜力。
以下是一些主要的应用领域的简要介绍：1. 农业应用：CRISPR Cas9技术可以用于改良作物的性状，提高抗病性和产量。
通过编辑目标作物的基因组，可以使其更适应特定的环境条件或产生更高的营养价值。
2. 医学研究：CRISPR Cas9技术可以用于研究特定基因对人类健康和疾病的影响。
通过编辑人类干细胞或动物模型的基因组，可以模拟疾病的发生和发展过程，帮助科学家们更好地理解疾病的机制，并寻找治疗方法。
3. 遗传病治疗：基因编辑可以用于修复基因突变导致的遗传病。
《2024年利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊的研究》范文
《利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊的研究》篇一一、引言随着基因编辑技术的不断发展，特别是CRISPR-Cas9系统的应用，人类对基因层面的操作已经进入了全新的时代。
其中，基因打靶技术对于解决某些遗传性疾病，如多基因疾病或遗传性病理性性状改良，具有重要的实践意义。
绒山羊作为我国重要的畜牧业资源，其毛质、毛量等性状对经济价值具有显著影响。
因此，本研究旨在利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊，以期改良绒山羊的遗传性状，提高其经济价值。
二、CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术简介CRISPR-Cas9是一种用于进行精确基因编辑的工具，它可以切割并改变特定的DNA序列。
体细胞核移植技术则是将动物的体细胞中的核与无核卵子进行结合，从而实现动物个体的复制。
本研究中，我们将利用这两种技术，实现对EDAR基因的打靶编辑，从而获得改良性状的绒山羊。
三、EDAR基因及其在绒山羊中的作用EDAR（Ectodysplasin A receptor）基因是调控毛质、毛量等性状的重要基因。
在绒山羊中，EDAR基因的变异可以导致毛质和毛量的变化，从而影响其经济价值。
因此，通过编辑EDAR基因，我们可以实现对绒山羊毛质和毛量的改良。
四、研究方法本研究首先从健康绒山羊中获取体细胞，并利用CRISPR-Cas9系统对EDAR基因进行打靶编辑。
通过精确的基因编辑技术，我们实现了对EDAR基因的定点切割和插入或删除特定序列的目的。
然后，我们将编辑后的细胞核与无核卵子进行核移植，形成新的胚胎。
最后，将胚胎植入受体母羊体内，使其成功受孕并产下基因打靶的绒山羊。
五、实验结果经过多次实验和优化，我们成功实现了对EDAR基因的打靶编辑。
通过PCR和测序等手段验证了基因编辑的成功率。
同时，我们也将成功的胚胎植入受体母羊体内，成功产下了基因打靶的绒山羊。
通过对新生绒山羊的观察和检测，我们发现其EDAR基因的表达情况已经发生了改变，并且其毛质和毛量等性状也得到了明显的改良。
《2024年利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊的研究》范文
《利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊的研究》篇一一、引言随着生物技术的飞速发展，基因编辑和动物克隆技术为农业、医药和生物科学研究提供了强大的工具。
在畜牧业中，利用基因编辑技术制备特定基因型或表型的动物模型已成为研究的热点。
本文以制备EDAR基因打靶绒山羊为例，探讨了利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术，通过定向修改绒山羊基因的方法来提升其育种效率，改进生产性状及生物医疗模型应用的可行性。
二、研究背景与意义EDAR（Ectodysplasin receptor）基因是影响动物毛皮性状的重要基因之一。
通过修改EDAR基因，可以有效地改变绒山羊的毛皮性状，提高其经济价值。
而CRISPR-Cas9系统作为一种高效的基因编辑工具，已经在多种生物中成功应用。
体细胞核移植技术则是一种克隆动物的有效方法。
将这两项技术结合使用，可以实现定向的基因修饰，并在不破坏原始动物优良性状的基础上进行无性繁殖。
因此，该研究对于畜牧业的遗传改良具有重要意义。
三、材料与方法3.1 实验材料（1）绒山羊体细胞；（2）CRISPR-Cas9系统相关试剂；（3）克隆载体；（4）受体母羊。
3.2 实验方法（1）利用CRISPR-Cas9系统对绒山羊体细胞进行基因编辑；（2）将编辑后的体细胞进行克隆培养；（3）将克隆后的体细胞核移植到受体母羊的卵细胞中；（4）将受体母羊进行妊娠和分娩，获得基因打靶的绒山羊。
四、实验过程与结果分析4.1 基因编辑采用CRISPR-Cas9系统对绒山羊体细胞的EDAR基因进行精准打靶，并实现了高效的基因修饰。
通过对多个靶点的设计、实验和效果验证，筛选出最佳基因修饰效率的靶点进行后续研究。
4.2 克隆培养通过常规的克隆培养技术，实现了修饰后体细胞的稳定繁殖。
并通过选择培养、生长曲线绘制等技术手段对克隆培养后的体细胞进行了生物学特性评估。
4.3 核移植与繁殖将克隆培养后的体细胞核移植到受体母羊的去核卵细胞中，并进行了移植后母羊的妊娠管理。
《2024年利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊的研究》范文
《利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊的研究》篇一一、引言随着基因编辑技术的飞速发展，尤其是CRISPR-Cas9系统的广泛应用，基因修饰动物模型的制备已经成为研究基因功能、疾病模型以及生物医药等领域的有效手段。
在畜牧业中，通过基因编辑技术改良动物品种，尤其是山羊等经济动物，不仅可以提高其经济价值，同时也能为人类健康提供更优质的资源。
本篇论文将探讨如何利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊。
二、CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术概述CRISPR-Cas9系统是一种基于DNA切割的基因编辑技术，通过该技术可以实现精准的基因编辑，对基因组进行特定的敲除或修饰。
体细胞核移植技术则是将去核卵细胞中的卵细胞核替换为特定供体细胞的细胞核，经过激活后可以发育为包含特定基因型胚胎的技术。
三、EDAR基因与绒山羊的关联EDAR（Ectodysplasin A receptor）基因是调控皮肤发育的重要基因之一，其突变或异常表达可能与羊毛质量和品质密切相关。
本研究以改良绒山羊品质为目的，尝试在山羊基因组上实施EDAR基因打靶操作。
四、研究方法1. 选择适当的山羊作为供体，并获取体细胞。
2. 通过CRISPR-Cas9系统对供体细胞的EDAR基因进行精准修饰。
3. 经过修饰的供体细胞通过体细胞核移植技术进行克隆胚胎的制备。
4. 将克隆胚胎移植到受体山羊体内，观察其发育情况及基因型。
五、实验结果通过本实验，我们成功实现了EDAR基因的打靶操作，并成功获得了基因修饰的绒山羊。
通过分析克隆胚胎的发育情况及后代的山羊基因型，我们发现该基因修饰不仅在分子层面上成功实施了目标修饰，同时并未对其他非目标区域造成明显的损害。
此外，我们也观察到部分基因修饰山羊在羊毛品质方面有显著提升。
六、讨论与展望本研究通过结合CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术成功实现了EDAR基因的打靶操作，并成功制备了基因修饰的绒山羊。
《2024年基于CRISPR-Cas9系统的外源基因在鸡体细胞中定点敲入的研究》范文
《基于CRISPR-Cas9系统的外源基因在鸡体细胞中定点敲入的研究》篇一基于CRISPR-Cas9系统的外源基因在鸡体细胞中定点敲入的研究一、引言基因编辑技术的进步使得人们可以在精确的DNA序列上进行基因修改，以实现对疾病治疗、作物遗传改良及生物研究等多方面应用的潜在影响。
CRISPR/Cas9系统作为一种有效的基因编辑工具，已经广泛地被用于动物、植物等众多领域。
近年来，将外源基因通过CRISPR/Cas9系统定点敲入到鸡体细胞中成为研究的热点。
本篇论文将重点讨论此技术的实现原理、过程以及其在鸡体细胞中的应用。
二、CRISPR/Cas9系统及其工作原理CRISPR/Cas9系统是一种基于细菌免疫系统的基因编辑工具，其工作原理主要分为三个步骤：首先，CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）共同形成引导RNA（guide RNA），用于识别特定的DNA序列；其次，Cas9蛋白通过与引导RNA结合，切割特定的DNA序列；最后，通过非同源末端连接或同源重组等方式修复断裂的DNA，实现基因的插入、删除或替换。
三、外源基因在鸡体细胞中定点敲入的实现在鸡体细胞中实现外源基因的定点敲入，首先需要设计并构建合适的CRISPR/Cas9系统。
这包括选择合适的引导RNA，以确保其能精确地识别目标DNA序列；选择高活性的Cas9蛋白以优化基因编辑的效率。
通过基因工程技术，将这些组件融合成一个可表达载体。
随后，该表达载体被引入鸡体细胞中，实现对特定位置的基因进行切割和修饰。
四、鸡体细胞中定点敲入的应用外源基因在鸡体细胞中定点敲入的应用非常广泛。
例如，在鸡的遗传育种中，通过将某些特定的外源基因敲入到鸡的基因组中，可以改良其遗传性状，如生长速度、产蛋量等。
此外，此技术还可用于疾病模型的研究、疫苗开发和药物筛选等领域。
在疾病模型的研究中，可以通过将疾病相关基因的敲入，构建出相应的疾病模型，为研究疾病的发病机制和治疗方法提供重要的工具。
基因组定向编辑技术——CRISPR Cas9的研究进展
Hans Journal of Agricultural Sciences 农业科学, 2014, 4, 142-150Published Online December 2014 in Hans. /journal/hjas/10.12677/hjas.2014.46022Advances in Genome Directional EditingTechnologies of CRISPR/Cas9Yao Yao, Xueyan Qian, Dongquan Guo*Agro-Biotechnology Research Institute, Jilin Academy of Agricultural Sciences, ChangchunEmail: *xzgdq@Received: Nov. 18th, 2014; revised: Nov. 25th, 2014; accepted: Dec. 8th, 2014Copyright © 2014 by authors and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/AbstractCRISPR/Cas (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) refers to an adaptive immune system that is gained from the long-term evolution of the organism which is widespread in bacteria and archaea. The system is able to degrade the invading virus or phage DNA. TypeⅡof CRISPR/Cas system has become the most popular method due to its simplicity.This paper summarizes the basic structure, principle, technical characteristics and the progress of CRISPR/Cas, as well as the application prospect of the technology.KeywordsCRISPR/Cas System, Cas9 Protein, Targeted Genome Modification基因组定向编辑技术——CRISPR/Cas9的研究进展姚瑶，钱雪艳，郭东全*吉林省农业科学院农业生物技术研究所，长春Email: *xzgdq@收稿日期：2014年11月18日；修回日期：2014年11月25日；录用日期：2014年12月8日*通讯作者。
CRISPRCas9的应用及脱靶效应研究进展
CRISPRCas9的应用及脱靶效应研究进展一、本文概述CRISPR-Cas9是一种基于细菌防御机制的基因编辑技术，自其问世以来，已经在生物学、医学等多个领域产生了深远的影响。
本文旨在全面概述CRISPR-Cas9技术的应用现状以及脱靶效应的研究进展。
我们将首先介绍CRISPR-Cas9技术的基本原理及其在基因编辑、疾病治疗、农业生物技术等领域的广泛应用。
随后，我们将重点关注CRISPR-Cas9技术中的脱靶效应问题，探讨其产生机制、影响因素以及目前的检测与防控策略。
通过综述最新的研究成果，我们希望为相关领域的研究者提供有价值的参考，推动CRISPR-Cas9技术的安全、高效应用。
二、CRISPR-Cas9的应用CRISPR-Cas9系统作为一种强大的基因编辑工具，已经在众多领域展现了广阔的应用前景。
自从其问世以来，科学家们已经在基因组编辑、基因功能研究、疾病治疗、农业生物技术以及药物开发等多个领域取得了令人瞩目的成果。
在基因组编辑方面，CRISPR-Cas9系统提供了一种精确、高效且相对简单的手段来修改生物体的基因组。
通过设计特定的sgRNA，研究人员可以精确地定位到目标DNA序列，并利用Cas9蛋白的切割活性在特定位置造成双链断裂。
随后，细胞内的DNA修复机制将介入修复这些断裂，从而导致目标基因的突变或删除。
这种技术已经被广泛应用于各种生物体，包括人类细胞、小鼠、斑马鱼、果蝇、植物等。
在基因功能研究方面，CRISPR-Cas9系统提供了一种高通量的方法来研究基因的功能。
通过构建基因敲除或敲入的细胞系或动物模型，研究人员可以系统地研究特定基因在生物体发育、生理和疾病过程中的作用。
CRISPR-Cas9还可以用于研究基因间的相互作用以及基因调控网络。
在疾病治疗方面，CRISPR-Cas9系统为遗传性疾病的治疗提供了新的希望。
通过纠正致病基因中的突变或删除致病基因，CRISPR-Cas9有可能根治许多遗传性疾病，如囊性纤维化、镰状细胞贫血、杜氏肌营养不良症等。
提高CRISPRCas9系统靶向编辑效率方法的研究进展
提高CRISPR/Cas9系统靶向编辑效率方法的研究进展作者：赵盼盼王丽袁园园来源：《江苏农业科学》2017年第01期摘要：近年来，CRISPR/Cas9系统经过一系列改造后已成为继锌指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定点编辑的新技术，目前，该技术已成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确编辑，但是该技术在农作物等植物中的应用还比较受限，且其脱靶效应等问题还有待解决。
本文首先简要综述了CRISPR/Cas9系统的发展历程、结构组成和作用机制及其在农作物中的应用，进而综述了近年来探索出的提高CRISPR/Cas9系统靶向编辑效率的方法。
最后，对基因组编辑技术在农作物和作物育种上的应用进行了展望。
关键词：CRISPR/Cas9系统；向导RNA；脱靶效应；农作物中图分类号：S188 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2017）01-0012-04基因组编辑技术产生于20世纪80年代，在CRISPR/Cas出现之前，科学家们只能通过对庞大的突变体库进行筛选，或通过同源重组途径来对DNA进行编辑。
由于细胞发生随机同源重组的效率只有百万分之一，用同源重组方法进行基因编辑耗时长、成本高，因此限制了基因组编辑技术的广泛应用[1-2]。
21世纪初，科研人员相继开发出锌指核酸酶（zinc finger nucleases，简称ZFNs）技术和类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-likeeffector nucleases，简称TALENs）技术，基因组编辑技术得到迅速发展[3]。
2013年初，《Science》《Nature》《Biotechnology》《Cell》等杂志几乎同时报道了1种不依赖于FokⅠ核酸酶的基因组编辑技术——clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease 9（CRISPR/Cas9），CRISPR/Cas9技术具有多个选择的靶向基因的位点，可实现多基因编辑，编辑的类型包括基因的定点插入、小片段的缺失、多个位点同时突变、基因定点的插入/缺失indel突变等。
CRISPR_Cas9的应用及脱靶效应研究进展_郑武
研究者在大肠杆菌的基因组中首次发现了这一奇特 的重复间隔序列 [2] ，但当时并未引起很大的反响。 随后，在其他细菌和古细菌中也发现了这一特殊的 序列 [3]。 2005 年，研究者发现这些间隔序列和噬菌 体的基因序列匹配度很高，暗示着 CRISPR 可能参 之后有研究者提出了一 与了微生物的免疫防御 [4~6]， 种假设机制： CRISPR 通过一种类似于真核生物的 RNAi 机制来行使免疫功能 [7]。直到 2011 年，才揭 示了 CRISPR/Cas 系统的分子机制： 当病毒首次入侵 时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的 CRISPR 的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录 生成 crRNA 前体 (pre-crRNA)，pre-crRNA 经过加工 形成含有与外源基因匹配序列的 crRNA，该 crRNA 与病毒基因组的同源序列识别后，介导 Cas 蛋白结 合并切割，从而保护自身免受入侵 [8~10]。 2013 年， 研究者报道了 CRISPR/Cas9 系统可高效地编辑基因 组。其中分别在人类细胞和小鼠细胞中成功对部分 基因实现了编辑 [11,12]。至此开始， CRISPR/Cas9 系 统在生命医学研究领域掀起了一场革命。 1.2 CRISPR/Cas9 系统的应用 在医学领域，利用 CRISPR/Cas9 技术，有多项 革新式的报道。 Fah 基因突变会导致遗传性酪氨酸 血症，研究者利用 CRISPR/Cas9 在肝细胞中成功修 复了该基因， 减缓了疾病小鼠体重下降的临床表现[13]。 这一研究证明了该技术在人类遗传病治疗上的前 景。此外，将 sgRNA 和 Cas9 注射到带有白内障致 病基因 CRYGC 突变的小鼠受精卵中，发现有 1/3 小 鼠的白内障得到了治愈 [14]。在此基础上，以精原干 细胞为材料进行基因修复，随后也得到基因修复的 小鼠 [15]。研究者利用 CRISPR/Cas9 基因修复技术， 首 次 成 功 地 在 感 染 有 HIV-1 病 毒 的 细 胞 中 灭 活 HIV-1 病毒基因，该研究为 HIV 的治疗探索了新的 临床治疗方法 [16]。 肿瘤细胞基因组测序可以发现大量与癌症相关 的候选基因。但是，要从大量的候选基因中筛选到 真正与肿瘤发生、发展相关的基因，却是一项艰巨 的工程。而利用 CRISPR/Cas9 系统，在小鼠体内实 现了这些特定基因的敲出。相对于过去通过逐个敲 除小鼠特定基因的方法来说，该方法大大加速了研 究的进程 [17]。 CRISPR/Cas9 技术在规模化研究基因
CRISPRCas9基因敲除研究进展
902021年 第1期CRISPR/Cas9基因敲除研究进展白祥慧（青海师范大学生命科学学院，青海 西宁 810008）摘 要：功能基因组学的发展促进基因敲除技术的进步，基因敲除技术从载体的构建到细胞筛选再到动物模型都取得长足进步。
基因敲除手段种类繁多，其中CRISPR/Cas9作为常用的基因编辑技术，具有高效、便捷、精确等优点，在农业、医学、生物学的模型构建中被广泛运用。
随着科研工作的逐渐深入，CRISPR/Cas9技术逐渐渗透到植物和微生物研究领域中。
文章综述近年来CRISPR/Cas9的应用，为科研工作的开展提供参考。
关键词：CRISPR/Cas9；基因；敲除中图分类号：S 852 文献标识码：A 文章编号：1672-9692（2021）01-0090-03Research progress of CRISPR/Cas9 gene knockoutBai Xianghui(College of Life Science, Qinghai Normal University, Qinghai Xining 810008)Abstract: The development of functional genomics has promoted the development of gene knockout technology, which has made great progress from vector construction to cell screening to animal models. There are many kinds of gene knockout methods, among which CRISPR/Cas9, as a common gene editing technology, has the advantages of high efficiency, convenience and accuracy, making it widely used in the construction of models in agriculture, medicine and biology. CRISPR/Cas9 technology has gradually infiltrated the field of plant and microbial research as scientific work demands. In the paper, the application of CRISPR/Cas9 in recent years is briefly reviewed to provide reference for the development of scientific research.Key words: CRISPR/Cas9; Gene; Knockout收稿日期：2020-11-17作者简介：白祥慧，硕士在读，研究方向为动物生理。
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ｒｅ—
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）基因，目前发现的有包括Ｃａｓｌ～Ｃａｓｌ０等
多种类型皿３【。Ｃａｓ基因与ＣＲＩＳＰＲ共同进化，构成
ｃｒｏｓｓｉｎｇ－ｏｖｅｒ（Ｘ）ｉｎ
Ｐ１］、ＺＦＮ（Ｚｉｎｃ
ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）和ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎ－
ＣＲＩＳＰＲ区域共同发生作用，被命名为Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ
加）而导致移码突变发生，最终引起基因表达的沉 默。自然状态下产生精确的ＤＳＢ效率极低，根本无 法满足研究甚至临床的需要。如何在基因组中人为 高效而精确地引入ＤＳＢ是近年来科学家们一直千 方百计想要解决的问题。随着分子生物学技术的发 展和基础研究的不断深入，一些新的原理和技术也 逐渐发现和开发出来，例如Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ［Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ
万方数据
江苏农业学报
２０１３年第２９卷第４期
外，研究较为成功的还有ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）
是富含ＡＴ长度为３００—５００ ｂｐ的区域，被认为可能
和非同源末端连接（Ｎｏｎ
ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ
ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ，
是ＣＲＩＳＰＲ簇的启动子序列¨川。Ｒｅｐｅａｔ长度为
２１—４８
ＮＨＥＪ），同样可以达到基因打靶的目的。
白质中部的ＨＮＨ ２个独特的活性位点¨２｜，在
噬菌体。细菌在噬菌体的长期选择压力下，进化出 多种防御机制，例如吸附抑制、ＤＮＡ注入抑制、无效 感染以及限制．修饰系统等¨仉１２ｊ。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ
ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ
ｒｅ—
ｂｐ，由于含有回文序列，可形成发卡结
实现ＮＨＥＪ发生的前提条件是基因组ＤＮＡ的
双链断裂（Ｄｏｕｂｌｅ
ｓｔｒａｎｄ
构¨６｜。重复序列之间被长度为２６—７２ ｂｐ的Ｓｐａｃｅｒ
隔开ｕ弘１９ Ｊ。Ｓｐａｃｅｒ区域由俘获的外源ＤＮＡ组
ｂｒｏｋｅｎ，ＤＳＢ），而诱发ＤＮＡ
的修复动员机制∞Ｊ。在修复过程中，将外源ＤＮＡ
法一Ｊ，称之为ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介导的打靶系统。不同
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介导的打靶系统作用
细菌抵御噬菌体等外源ＤＮＡ入侵时，在Ｌｅａｄｅｒ
原理
的调控下，ＣＲＩＳＰＲ被转录为长的ＲＮＡ前体（Ｐｒｅ．
ＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ，ｐｒｅ．ｃｒＲＮＡ），然后加工成一系列短的
于传统的打靶技术，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９表现出许多优越 性，例如：可以同时沉默任意数量的单个基因、具有 优良的靶向性并且构建简单、成本低等。该技术自 发明以来，迅速被广大中外研究人员接受而广泛应 用于研究中，成为当今生命科学技术研究的新热点。
ｔｏ
ｂｒｅａｋ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ，ａｎｄ
ａ
ｔｏ
ｓｉｌｅｎｃｅ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂａｓｅｄ
ｏｎ
ｔｈｉｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ ｈａｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＲＮＡｉ，Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ，ＺＦＮ ａｎｄ
Ｃｏｓｔ
ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎｔｏ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ ｔｏ ｒｅｓｉｓｔ ｉｎｖａｄｉｎｇ ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ，ｉｓ
ｏｎｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｍｍｕｎｅ ｍｅｃｈａ－
ｎｉｓｍｓ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｕｎｄｅｒ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｅｘｃｅｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ．Ｉｎｓｉｄｅ ｂａｃｔｅｒｉａ，ＣＲＩＳＰＲ ｃｌｕｓｔｅｒ ｇｅｎｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｉｔｓ ｌｅａｄ－
ａｎｄ ｓｉｍｔｄｔａ—
ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｇｅｎｅｓ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ，ｔｈｅ
ａｎｄ ｔｈｅ ｗｏｒｋｉｎｇ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｉｂｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ；ｃｒＲＮＡ；ｔｒａｃｒＲＮＡ
ｐｅａｔｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）系统也是其中较为有
ｃｒＲＮＡ成熟和双链ＤＮＡ剪切中发挥作用¨４琊１。此 外，ｐｒｅ．ｃｒＲＮＡ转录的同时，与其重复序列互补的反 式激活ｃｒＲＮＡ（Ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ，ｔｒａｃｒＲＮＡ）也
转录出来，并且激发Ｃａｓ９和双链ＲＮＡ特异性ＲＮａｓｅ ＩＩＩ核酸酶对ｐｒｅ—ｃｒＲＮＡ进行加工ｏ ９Ｉ。加工成熟后， ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ和Ｃａｓ９组成复合体，识别并结合
质内切酶剪切加工转录出的ｐｒｅ—ｃｒＲＮＡ，加工成熟
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的结构
细菌生存的自然环境中同时存在着细菌病毒．
后的ｃｒＲＮＡ与Ｃａｓ蛋白质聚合成大的复合体识别 并剪切与ｃｒＲＮＡ互补的外源核酸序列¨９’２６卫８矧；ＩＩ 型与上述两种系统存在着截然不同的区别，而且ＩＩ 型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统在目前研究中最深入旧…。在ＩＩ 型系统中ｐｒｅ．ｃｒＲＮＡ的加工由Ｃａｓ家族中的Ｃａｓ９ 单独参与¨９｜。Ｃａｓ９含有在氨基末端的ＲｕｖＣ和蛋
一个高度保守的系统。
２
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ．１ｉｋｅ ｅｆｆｅｅｔｏｒ
ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）等，都成功
地在多个物种上实现了打靶Ｈ剖，而且成为目前分子 生物学领域中重要而且常用的研究手段。２０１３年２ 月底，国际著名期刊（Ｃｅｌｌ｝）杂志报道了加州大学旧 金山分校的研究人员发现一种更精确关闭基因的方
江苏农业学报（Ｊｉａｎｇｓｕ ｌ ｏｆＡｇｒ．Ｓｃｉ．），２０１３，２９（４）：９０７－９１１
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＪＳｎｙＸｂ．ｃｏｒｎ
李辉，施振旦．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９新型基因打靶系统的研究进展［Ｊ］．江苏农业学报，２０１３，２９（４）：９０７－９１１． ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－４４４０．２０１３．０４．０３７
特定的基因失活或定点删除的技术。通常意义上的 基因打靶主要是应用ＤＮＡ同源重组（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＨＲ）原理，用设计的同源片段替代靶 基因片段，从而达到基因敲除的目的¨ｊ，但是ＨＲ在 体细胞中的发生率极低，不足１×１０引引，比较适用于 干细胞中，对于无干细胞建系的大型哺乳动物来说 利用ＨＲ打靶十分困难。随着技术的发展，除了ＨＲ
效的一种获得性免疫机制¨３。１４。。ＣＲＩＳＰＲ簇是一个
广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊ＤＮＡ重
复序列家族¨５。１ ６｜，其序列由一个前导区（Ｌｅａｄｅｒ）、多
个短而高度保守的重复序列区（Ｒｅｐｅａｔ）和多个间隔 区（Ｓｐａｃｅｒ）组成。Ｌｅａｄｅｒ一般位于ＣＲＩＳＰＲ簇上游，
万方数据
李辉等：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９新型基因打靶系统的研究进展
基因打靶是自上世纪８０年代末发展起来的一 种新型分子生物学技术，是通过特定的途径使机体
收稿日期：２０１３－０４—１０ 基金项目：江苏省六大人才高峰项目［苏农函（２０１２）３５号］ 作者简介：李辉＜１９８２一），男，山东惠民人，博士，助理研究员，主要 研究方向为转基因动物及分子生物学。（Ｔｅｌ）０２５— ８４３９０７７２；（Ｅ—ｍａｉｌ）ｌｈｌｙｄｋ＠１２６．ｃｏｒｎ
中图分类号：Ｑ３４３．１＋１
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ
ⅡＨｕｉ．ｕｔｅ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｉａｎｇｓｕ
Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａ耐ｎ９２１００１４，Ｃｈｉｎａ）
的５’一ＧＧ—Ｎ１８．ＮＧＧ－３’特征区域的ＮＧＧ位点∞９。，这
显微注射的方式注入斑马鱼单细胞期的受精卵中， 结果发现，所有不同比例的ＲＮＡ都产生了打靶位点 的突变，表明打靶的效率与传统的ＺＦＮ和ＴＡＬＥＮ 相似。同时中国科学家也利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９打靶 系统对斑马鱼的ｅｔｓｒｐ，ｇａｔａｚｌ和ｇａｔａ５基因进行了突 变研究，结果发现３５％的特异位点都成功突变∽¨。 多篇报道利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９打靶系统在人和小鼠
整合人ＤＳＢ中或者将ＤＳＢ处部分序列删除（或增
成㈣ｊ，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源ＤＮＡ 入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉 默，达到保护自身安全的目的。 通过对ＣＲＩＳＰＲ簇侧翼序列分析发现，在其附 近存在一个多态性家族基因口７’２他］，编码的蛋白质 均含有可与核酸发生作用的功能域（具有核酸酶、 解旋酶、整合酶和聚合酶等的活性），并且与
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９新型基因打靶系统的研究进展
李辉，施振旦
（江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京２１００１４）
摘要：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统是细菌在噬菌体长期选择压力下进化出来的一种有效抵御外源ＤＮＡ入侵的免疫 机制之一。在菌体内，ＣＲＩＳＰＲ簇在其前导区的调控下转录成ｐｒｅｃｒＲＮＡ，在ｔｒａｃｒＲＮＡ和Ｃｏｓ９参与下加工成成熟的 ｃｒＲＮＡ，并弓ｌ导ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９复合体识别结合外源ＤＮＡ特定序列，剪切ＤＮＡ双链，沉默外源基因的表达。 基于此种原理，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统被开发成一种新型的基因打靶系统。相对于稍早的ＲＮＡｉ、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ、ＺＦＮ和 ＴＡＬＥＮ系统，此新型打靶系统具有操作简单、效率高、成本低、可同时沉默任意数量的基因等优点。本文着重对 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９打靶系统的结构、工作原理及目前的应用进行综述，并对该系统在未来生命科学研究以及临床中的 应用进行了展望。 关键词： ｃｍｓＰＲ／ｃａｓ９：基因打靶；ｃｒＲＮＡ；ｔｒａｅｒＲＮＡ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－４４４０（２０１３）０４－０９０７－０５