荧光光谱法研究亚甲基蓝与蛋白质的结合反应
实验验证亚甲基蓝测蛋白质含量的可靠性
实验验证亚甲基蓝测蛋白质含量的可靠性
简介
本文档旨在讨论亚甲基蓝作为测量蛋白质含量的可靠性。
亚甲基蓝是一种广泛应用于生物学实验中的染色剂，常被用于测定蛋白质含量。
我们将探讨使用亚甲基蓝的优点和局限性，并进行一系列实验来验证其可靠性。
优点
- 亚甲基蓝是一种价格相对较低的染色剂，易于获得和使用。
- 它与蛋白质结合紧密，不易与其他物质相互作用，从而减少了测量误差的可能性。
- 亚甲基蓝对不同类型的蛋白质都有较好的反应性，使其适用于各种样品。
局限性
- 亚甲基蓝与蛋白质的反应是基于吸光度的测量，而非直接定量。
因此，测得的结果只能提供蛋白质含量的相对信息。
- 亚甲基蓝对某些蛋白质不够敏感，可能导致低测量值误差。
- 在使用亚甲基蓝进行测量时，可能会出现与其他物质的非特
异性结合，从而干扰蛋白质含量的准确测量。
实验验证
我们将设计一系列实验来验证亚甲基蓝测蛋白质含量的可靠性。
实验包括以下步骤：
1. 准备一系列已知蛋白质浓度的样品。
2. 使用亚甲基蓝染色方法对样品进行处理。
3. 通过吸光度测量法确定处理后样品的吸光度值。
4. 使用标准曲线对吸光度值进行校正，以获得相对蛋白质含量。
结论
通过一系列实验证明，亚甲基蓝是一种可靠的用于测量蛋白质
含量的方法。
尽管存在一些局限性，亚甲基蓝的优点仍然使其成为
一种常用的选择。
对于大多数实验室，亚甲基蓝是一种简便且经济
的方法，可以提供对蛋白质含量的相对测量。
但在特定研究领域或
需要精确定量的情况下，可能需要考虑其他更精确的方法。
时间分辨光谱技术研究亚甲基蓝与小牛胸腺DNA的相互作用
态电荷转移生成 自由基 ， 称为 Ｉ 型反应．当 Ｍ Ｂ的浓度较高时， Ｂ自身就可以作为还原剂 ； Ｍ 在低浓 度 （ ０ ｍ ｌＬ 的 ＭＢ溶液 中 ，ＭＢ对 自身 的 Ｉ型反 应 可 以忽 略 ，同 时在 该浓 度 下 ＭＢ主 要 以单 体 １ ｏ ） Ｘ１ ／ 存 在 ¨ 基 态 ＭＢ分 子与 的 Ⅱ型 （ ； Ｏ 化学猝 灭 ） 自氧 化反 应 可 以忽 略 ．ＭＢ具 有 高 的光 敏 化单 态 氧 量 子产率（ ０５ ， ． ） 本实验采用偏离强吸收带波长 的 ５２ｎ ３ ｍ脉 冲光激发得到 了较强的单态氧发射信
刘 涛等 ：时间分辨光谱技 术研 究亚 甲基蓝与 小牛胸腺 Ｄ Ａ的相互作用 Ｎ
公 司 ） ３ Ｄ １０ Ｐ型长通 滤光 片和 １ ５ ＷＢ ０ ； Ｒ Ｉ０ Ｌ ２ ０ １０型带通 滤光 片 （ 国 Ｏ ｉ 美 ｍｇ 司 ） ａ公 ．
１ ２ 实验 方法 ．
用重水充分溶解 ｃ Ｎ 于 ４ｑ下静置 ２ ． ｔ Ａ， Ｄ Ｃ ４ｈ 将适量的 Ｍ Ｂ晶体溶 于重水 中， 配制成浓度为 １ × １ ｍｏ Ｌ的 ＭＢ溶 液 ．保持 ＭＢ的浓 度为 １×１ ｍ ｌＬ ０ ｌ ／ ０一 ｏ ，配 制 ８份不 同浓 度 比例 的 ｃ Ｎ — ／ ｔ ＡＭＢ混合 Ｄ
Ｔ ９ １ Ｕ ０ 双光束型紫外一 可见分光光度计 （ 北京普析通用仪器有限公司） Ｓｅｔ Ｐｏ ０ ｉ ； ｐｃａｒ ３ ０ 光谱仪 ｒ
（ 国 Ａ ｔｎ 司 ） Ｙ 一０ Ｃ型皮 秒激 光器 （ 国 Ｑ ａｔｍ公 司 ） Ｓ ４ ５型前置 放大 器 和 Ｓ ４０型 多 美 ｃ 公 ｏ ； Ｇ ３０ 法 ｕｎｕ ；Ｒ４ Ｒ３ 通 道信 号平 均器 （ 国 Ｓａｆｒ ｅｅｒｈＳｓ ｍ ） 美 ｔ ｏｄＲ ｓａ ｙｔ ｓ ；Ｈ１３０４ ｎ ｃ ｅ ０ ３－５型 近红 外 光 电倍 增 管 （日本 Ｈａ ｍ ｔ ｍａ ａｓ ｕ
荧光光谱法研究亚甲基蓝与蛋白质的结合反应
荧光光谱法在生物分析中的应用---亚甲基蓝与蛋白质的结合反应刘超-生物化工-2009010236荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段。
荧光测试中的发射峰特征、荧光偏振、能量转移及荧光寿命等指标可以对蛋白质分子中荧光生色基团的结构及其所处的微环境提供有用的信息。
在生物体中，蛋白质是必不可少的生命物质，有关蛋白质的各类研究，是目前生命科学、化学和临床医学中共同关注和感兴趣的课题。
亚甲基蓝是一种具有平面结构（结构式见图1）的碱性生物染色剂，在医学临床诊断及化学分析中已有较长的应用历史，且可用于亚硝酸盐、磺氨类、氰化物及一氧化碳等中毒的解毒药。
近年来又发现MB对DNA具有插入作用，MB可被用于抗癌药物的体外筛选；此外MB的光化学性质及作用机理与血卟啉很相似，被认为可能成为一种新型光敏剂而用于癌症的光化学治疗。
新近的研究还表明MB在溶液中分子的聚集状态与溶剂及介质有关。
本文应用荧光光谱法研究了人体生理pH值条件下，亚甲基蓝与牛血清白蛋白间的相互作用，测定了结合常数、结合位点数及结合距离，从而由分子水平的角度认识蛋白质分子与小分子之间相互作用的机理，为生命科学研究提供有用的信息和数据。
实验方法：配制0.05mol/L的Tris-HCl并含0.10mol/LNaCl的缓冲溶液(pH=7.0),恒定体系pH值和离子强度，以此缓冲溶液分别配制MB溶液和BSA贮备液。
测定方法：在10ml的容量瓶中，依此加入一定量的BSA,MB溶液，以缓冲溶液稀释至刻度，混匀后室温下测定荧光光谱、同步荧光光谱及与蛋白质分子比为1:1的MB吸收光谱，测定中固定BSA的浓度而改变MB浓度。
结果与讨论:MB对BSA荧光猝灭的机理外加分子与荧光体分子相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭，并有动态和静态猝灭之分。
通过观察MB对BSA 猝灭曲线（图2）可知，对于MB 从低到高整个浓度范围内曲线都呈现出好的线性，表明室温下MB 对BSA 的荧光猝灭为静态过程。
荧光光谱法在蛋白质研究中的应用
如 果 这 时 分 子通 过 发 射 相应 的光 量子 来 释放 剩 余 能
量 而 回到基 态 的各 个 不 同 的 振 动 能 级 ， 产 生 了荧 就 光 。因此 ， 低 第 一 级 电 子 激 发 态 振 动 能 级 是 产 生 最 荧 光 的基 础 。 由于 分 子发 射 荧 光 前 已有 一 部 分 能 量
Ａｂ ｔａ ｔ Ｆ ｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｓ ｅ ｔ ｏ ｃ ｐ ｉ ｅ ｙ ｍｐ ｒａ ｔ ｏ ｓ ｕ ｙ ｎ ｐ ｏ ｅｎ ｔ ｕ ｔ ｒ ｎ ｃ ｎ ｏ ｍａ ｉｎ ｓｒ ｃ ： ｌ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｐ ｃ ｒ ｓ ｏ ｙ ｓ ｖ ｒ ｉ ｏ ｔ ｎ ｆ ｒ ｔ ｄ ｉ ｇ ｒ ｔ ｉ ｓｒ ｃ ｕ ｅ ａ ｄ ｏ ｆ ｒ ｔ ｏ ｃ ａ ｇ ｓ Ｔｈ ｏ ｃ ｐ ｎ ｒｎ ｉ ｌ ｆｆｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｐ ｃ ｒ ｓ ｏ ｙ ａ ｅ ｉ ｔｏ ｕ ｅ ｔ ｉｓ ， ｈ ｎ ｔ ｅ ａ ｐ ｉａ ｉｎ ｏ ｈｎ ｅ． ｅ ｃ ｎ ｅ ｔａ ｄ ｐ ｉ ｃｐ ｅ ｏ ｌ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｓ ｅ ｔｏ ｃ ｐ ｒ ｎ ｒ ｄ ｃ ｄ ａ ｒ ｔ ｔ ｅ ｈ ｐ ｌ ｔ ｆ ｆ ｃ ｏ
4测定酶的活性em荧光光谱法是测定酶活性的一种方法主要是氨基酸中仅有芬香族氨基酸trptyrphe是发荧光根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定其的基团但由于三者在普通荧光光谱中的激发光谱和灵敏度要比紫外及可见分光光度法高若干个数量发射光谱相互重叠不能同时测定给研究蛋白质的工作带来困难
亚甲基蓝mb检测ros原理
亚甲基蓝mb检测ros原理
亚甲基蓝(Methylene Blue，MB)是一种常用的染色剂，常用于细
胞学、生化学和临床诊断等领域。
而亚甲基蓝MB检测ROS则是现代医
学领域中应用较广的ROS检测试剂之一，其原理如下。
ROS即活性氧自由基，是细胞生命活动中必不可少的一种物质，
但过量的活性氧自由基会破坏细胞中的结构与各种相关生物分子，从
而引发多种疾病。
因此，现代医学研究中对ROS的检测就显得尤为重要。
传统的ROS检测方法一般包括荧光分子探针法和化学方法，荧光
分子探针法通常通过观察分子的荧光强度或某个荧光基团的发射光谱
来检测ROS的含量，但其常常存在灵敏度低、特异性不高等不足；化
学方法则易受其他物质的影响、难以直观观察等问题。
而亚甲基蓝MB检测ROS则具有运行简单、灵敏度高、可靠性强
等优点。
它的原理是，亚甲基蓝MB与ROS发生氧化反应后，生成顺式
亚甲基蓝（MB+），顺式亚甲基蓝比亚甲基蓝MB+的吸收峰红移，吸收
峰在665nm处，可以通过比色法、荧光法、光谱法等方法，检测出顺
式亚甲基蓝的含量，并反映ROS的浓度。
其中，荧光法中通常用于激
发顺式亚甲基蓝而不影响其结构与性质的波长为630nm的激光。
总之，亚甲基蓝MB检测ROS是一种快速、具有较高灵敏度和可
靠性的检测方法，可广泛应用于细胞工程、基因检测、抗氧化剂筛查、药物筛选等领域，为医学研究与临床诊断提供了有力的技术支持。
荧光光谱法研究克仑特罗与蛋白质的结合作用
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第 23 卷第 1 期 分析试验室 Vol. 23. No. 1 2004 年 1 月 Chinese Journal of Analysis Laboratory 2004 - 1
2 结果与讨论 2. 1 CLT 对 BSA 荧光猝灭的机理 BSA 的内源荧光来自于分子中色氨酸残基和
Volmer 常数 。对图 1 结果做动态猝灭处理 ,得猝灭
常数 Ksv = 3. 157 ×10 LΠ mol , 直线相关系数 r =
3
019989 ,由无猝灭剂时生物大分子平均寿命 τ 0 = 10
- 8Biblioteka s得[7 ]( mol ・ τ : Kq = KsvΠ 10 LΠ s) 。 0 = 3. 157 ×
图2 BSA 的荧光光谱 ( a) 和 CLT 的吸收光谱 ( b)
Fig. 2 Fluorescence spectra of BSA (a ) and absorption spec2 tra of CL T ( b)
cBSA = cCLT = 110 × 10
-4
利用同步荧光光谱可以分析蛋白质的构象 。 同步荧光光谱即固定激发波长与发射波长的间距 Δ λ,同步扫描激发和发射单色器所得到的荧光光 λ= 15 nm 所得的同步荧光只显示蛋白质 谱 。由Δ λ = 60 nm 的同步荧 酪氨酸残基的光谱特性 , 而 Δ 光只表现色氨酸残基的荧光 。因为残基的最大发 射波长与其所处环境极性有关 ,故由发射波长的改 [9 ] 变可判断蛋白质构象的变化 。测定中 ,固定 BSA 的浓度 ,改变 CLT 的浓度 。由图 3 可以看出 BSA 的荧光主要由色氨酸残基发出 , 且随 CLT 浓度的 增大 ,色氨酸残基发射峰蓝移 ,酪氨酸发射峰红移 , 表明 CLT 的加入引起了 BSA 的构象变化 。
荧光光谱法在蛋白质研究中的应用
荧光光谱法在蛋白质研究中的应用尹燕霞;向本琼;佟丽【摘要】荧光光谱法对研究蛋白质结构及其构象变化是很重要的.描述了荧光光谱的概念、发光机理及特点,介绍了荧光光谱仪的仪器原理和结构,记述了荧光光谱技术在检测蛋白质的构象变化、蛋白质的含量和酶活性方面的具有应用.【期刊名称】《实验技术与管理》【年(卷),期】2010(027)002【总页数】5页(P33-36,40)【关键词】荧光光谱法;蛋白质;构象【作者】尹燕霞;向本琼;佟丽【作者单位】北京师范大学,生命科学学院,北京,100875;北京师范大学,生命科学学院,北京,100875;北京师范大学,生命科学学院,北京,100875【正文语种】中文【中图分类】O657.3;TQ937某些物质被一定波长的光照射时,会在较短时间内发射出波长比入射光长的光,这种光称为荧光。
荧光光谱在各方面的应用及有关的方法称为荧光光谱技术。
1.1 荧光发光机制每一个分子具有一系列分离的电子能级,每一电子能级中又有一系列的振动能级和转动能级。
当物质被光照射后,大约在10-15s内光被物质吸收,物质分子获得能量,分子内的电子跃迁到较高能级而变成激发态。
处于激发态的分子很不稳定,它首先通过内转换将部分能量转移给周围分子,回到最低电子激发态振动能级(称为第一级电子激发态振动能级),处于这一能级的分子平均寿命大约是10-8s,如果这时分子通过发射相应的光量子来释放剩余能量而回到基态的各个不同的振动能级,就产生了荧光。
因此,最低第一级电子激发态振动能级是产生荧光的基础。
由于分子发射荧光前已有一部分能量被消耗,所以荧光能量要比物质吸收的光能量小,因而荧光的发射波长总比激发波长长。
1.2 常用荧光参数荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便以及能提供较多的物理参数等优点。
因而被广泛地应用于各个研究领域。
它能提供包括激发谱、发射谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命等许多物理参数,这些参数从各个角度反映分子的构象情况,通过对这些参数的测定,不但可以做一般的定量分析,而且可以推断生物大分子在各种环境下的构象变化,从而阐明蛋白质结构与功能的关系。
亚甲基蓝染色的原理
亚甲基蓝染色的原理亚甲基蓝（Methylene Blue）是一种常用的染料，广泛应用于生物学、医学等领域中。
其原理是通过与细胞内的某些成分产生特定的相互作用，从而实现染色效果。
亚甲基蓝的分子结构中含有一个碱性亚甲基蓝阴离子（B）和一个酸性次甲基蓝阳离子（C）。
这两个离子通过电荷交换作用而保持相互结合。
在水溶液中，亚甲基蓝可以完全解离为B阴离子和C阳离子。
亚甲基蓝在染色过程中，常常与细胞内的一些生物分子或结构发生特异性的化学反应。
对于细胞和组织来说，主要表现为与核酸、蛋白质和多肽等大分子化合物的相互作用。
亚甲基蓝的染色作用主要包括以下几个方面：1. 与核酸的相互作用：亚甲基蓝可以通过静电相互作用或氢键形成复合物与DNA或RNA分子相结合。
当亚甲基蓝与DNA分子结合时，可以通过两种机制实现染色效果：一种是静电相互作用，亚甲基蓝的阳离子与DNA的阴离子相互吸引；另一种是插入机制，亚甲基蓝的分子结构可以插入到DNA的双链结构中，从而与DNA分子相互作用并染色。
2. 与蛋白质的相互作用：亚甲基蓝可以通过静电相互作用、氢键和范德华力等力作用与蛋白质结合。
与DNA分子不同，亚甲基蓝与蛋白质的结合是非特异性的，即亚甲基蓝可以与细胞中的各种蛋白质结合而染色。
这种染色机制主要是利用亚甲基蓝分子结构的亲脂性，与蛋白质亲和力的形成。
3. 与细胞内其他小分子的相互作用：亚甲基蓝还可以通过与细胞内其他小分子的氧化还原反应形成某些特定的有色产物。
例如，亚甲基蓝与细胞内的一些氧化还原酶如谷胱甘肽还原酶等反应，会形成蓝色的氧化产物。
这种染色机制主要是利用亚甲基蓝作为还原剂，与细胞内的氧化产物发生反应而形成染色的产物。
总的来说，亚甲基蓝染色的原理是通过与细胞内大分子化合物如DNA、RNA和蛋白质等发生特异性的相互作用，从而实现染色效果。
亚甲基蓝的分子结构中含有碱性离子和酸性离子，可以与细胞内的化合物发生电荷交换作用。
在染色过程中，亚甲基蓝还可以通过与细胞内其他小分子的反应形成染色产物。
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荧光光谱法在生物分析中的应用
---亚甲基蓝与蛋白质的结合反应
刘超-生物化工-2009010236
荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段。
荧光测试中的发射峰特征、荧光偏振、能量转移及荧光寿命等指标可以对蛋白质分子中荧光生色基团的结构及其所处的微环境提供有用的信息。
在生物体中，蛋白质是必不可少的生命物质，有关蛋白质的各类研究，是目前生命科学、化学和临床医学中共同关注和感兴趣的课题。
亚甲基蓝是一种具有平面结构（结构式见图1）的碱性生物染色剂，在医学临床诊断及化学分析中已有较长的应用历史，且可用于亚硝酸盐、磺氨类、氰化物及一氧化碳等中毒的解毒药。
近年来又发现MB对DNA具有插入作用，MB可被用于抗癌药物的体外筛选；此外MB的光化学性质及作用机理与血卟啉很相似，被认为可能成为一种新型光敏剂而用于癌症的光化学治疗。
新近的研究还表明MB在溶液中分子的聚集状态与溶剂及介质有关。
本文应用荧光光谱法研究了人体生理pH值条件下，亚甲基蓝与牛血清白蛋白间的相互作用，测定了结合常数、结合位点数及结合距离，从而由分子水平的角度认识蛋白质分子与小分子之间相互作用的机理，为生命科学研究提供有用的信息和数据。
实验方法：配制0.05mol/L的Tris-HCl并含0.10mol/LNaCl的缓冲溶液
(pH=7.0),恒定体系pH值和离子强度，以此缓冲溶液分别配制MB溶液和BSA贮备液。
测定方法：在10ml的容量瓶中，依此加入一定量的BSA,MB溶液，以缓冲溶液稀释至刻度，混匀后室温下测定荧光光谱、同步荧光光谱及与蛋白质分子比为1:1的MB吸收光谱，测定中固定BSA的浓度而改变MB浓度。
结果与讨论:MB对BSA荧光猝灭的机理外加分子与荧光体分子相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭，并有动态和静态猝灭之分。
通过观察MB对BSA 猝灭曲线（图2）可知，对于MB 从低到高整个浓度范围内曲线都呈现出好的线性，表明室温下MB 对BSA 的荧光猝灭为静态过程。
为进一步证实此猝灭特征，把此过程按动态猝灭处理，即式(1)
为双分子猝灭过程速率常数，为动态猝灭常称为Stern-Volmer猝灭方程，K
Q
数，为猝灭剂不存在时荧光体分子平均寿命，猝灭剂的浓度。
而
，由于生物大分子荧光平均寿命约为，故可由猝灭曲线的斜率求得猝灭常数。
由图2实验数据，按式（1）可以求得MB对BSA
猝灭的，而各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为，显然MB对BSA荧光的猝灭过程速率常数远大于扩散控制的，可见其猝灭过程确
为形成化合物所引起的静态猝灭，而不是由于动态碰撞引起的动态猝灭。
在静态猝灭作用中，静态猝灭荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光体-猝灭剂分子间的结合常数表达式推导求出。
设生物大分子P与药物D成键时有n个等同且独立
的结合位置，则有下述反应：其中为生成物，相应的结合常数为
设生物大分子的总浓度为，药物的总浓度为，则由反应（2）的计量关系可得：。
当反应体系中仅有生物大分子P为荧光体时，则有，这里分别为加入和不加入药物D时浓度为的生物大分子溶液的荧光强度。
将这些浓度关系代入
式（3）可得固
定浓度而改变，按式（4）的线性关系可以确定与n。
根据图2 的MB对BSA荧光发射谱的猝灭关系，将343nm处的相对荧光强度实验数据按式（4）以对做一元线性回归，由回归系数可进一步求出MB 与BSA 反应时的结合常数，结合
位点数n=1.03，相应的线性相关系数为0.9988。
这一结果表明MB与BSA有较强的结合作用，且可形成一个结合位点，并服从独立等同的位点结合模型。
若小分子化合物与血清白蛋白的结合为顺序结合，则依据非辐射能量转移机制可以求出小分子的结合位置与蛋白质分子中产生荧光的残基间的距离。
按能量转移理论，转移效率E与授体-受体间距离r及临界能量距离
相关，这里是
时的临界距离式中，为偶极空间取向子，N为介质的折射指数，为授体的光量子效率，J为授体（蛋白质）荧光发射光谱与受体（药物）吸收光谱间的光谱重叠积分，可表示为
其中为授体在波长r处的荧光强度，则为受体在波长r处的摩尔消光系数，能量转移
效率E可按下式确定：图3为MB 与BSA分子比为1:1时的吸收光谱及BSA荧光光谱的重叠光谱图。
将图中谱重叠部分（300-500nm的波长范围）分割成极小的矩形面积求和，得重叠积分
J=1.27810-15cm.(mol/L)。
BSA有两个色氨酸残基，分别位第134 位和212位，而BSA 的荧光主要来自于第212位的色氨酸残基。
在
上述实验条件下，取色氨酸残基量子效率,N取水和有机物的平均值1.366，取向因子取授体’受体各向随机分布的平值2/3，将以上各量代入式（6），
求得临界距离，由式（8）及图2荧光强度（分子比1:1）得能量转
移效率E=0.54，进而按式（5）得BSA中第212位色氨酸残基与MB 分子间的距离.r=1.67nm.
固定激发波长与发射波长的间距，同步扫描激发和发射单色器即得同步荧光光谱。
这光谱已被用于蛋白质构象变化的分析，由=15nm所得的同步荧光只显示蛋白质酪氨酸残基的光谱特性，而=60nm同步荧光仅表现出色氨酸
残基的荧光。
因残基的最大发射波长与其所处环境之极性有关，故由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化。
固定BSA的浓度，逐渐增加MB的浓度，绘制BSA 的同步荧光光谱。
图4(a)和（b）分别为BSA中的色氨酸和酪氨酸残基的荧光谱图，可以看出在此实验条件下BSA的荧光主要源于色氨酸残基，且随MB浓度增大，色氨酸的最大荧光发射波长有一定的蓝移，而酪氨酸的最大发射波长产生红移，表明MB的加入引起了BSA的构象变化。