黑曲霉发酵提取柠檬酸
7 黑曲霉发酵柠檬酸
实验目的
了解产物发酵生产的机理； 了解产物发酵生产的机理； 柠檬酸发酵的发酵条件 掌握发酵过程步骤
实验原理
柠檬酸的发酵
80%的糖代谢走EMP途径
生产菌中存在TCA的酶系
草酰乙酸的来源不是由TCA 供应，而是由2个CO2固定 提供，故C0mL三角瓶） 每组2瓶，其中一瓶放置数颗玻璃珠 其他灭菌物品 （每组1套） 小包装1.5mL离心管、蓝色黄色枪头若干， 培 养皿每组1包（每包不少于6个）
问题与思考 影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因 素有哪些？ 素有哪些？ 试设计分离筛选酵母菌发酵生产 酒精实验并阐述酒精产生机理
实验步骤
菌种获得（纯种） 种子液制备 无菌操作，取5mL无菌水至黑曲霉平板上， 用接种环轻轻刮下孢子，用枪吹吸数下制 成孢子悬液。 液体深层发酵 无菌操作，取3mL孢子悬液接种于玉米粉摇 瓶发酵培养基中。在转速为200rpm旋转摇 床上，30℃培养5～6天。
后续实验准备 黑根霉的分离培养 制作马铃薯培养基平板2块 单号组用接种环无菌操作，从酒酿样品中挑取 1环，在1块马铃薯培养基平板上进行划线分离。 双号组取安琪菌剂0.1g加入10mL带玻珠的无 菌水三角瓶进行稀释溶解，取稀释液0.1mL， 在1块马铃薯培养基平板上进行均匀涂布。 另外一块平板置于冷藏柜备用。 将划好的培养基平板置于517房间30℃培养箱 内正置培养3天，至周一进行结果观察和转接。
柠檬酸发酵的条件： 柠檬酸发酵的条件：
1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖 等），高浓度的糖； 2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源 （铵盐）； 3、合适的pH值； 4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速 250r/m）； 5、限制重金属离子如Mn2＋、Fe2＋、Zn2＋含 量。
实验七_黑曲霉发酵柠檬酸
菌种获得
实验步骤
孢子悬液制备 取约5mL无菌水至黑曲霉平板上，用灭菌 滴管轻轻刮下孢子，振荡数下制成孢子悬 液。
液体深层发酵
取约4mL孢子悬液接种于玉米粉摇瓶发酵 培养基中。在转速为200rpm旋转摇床上， 30℃培养5～6天。
牛肉膏蛋白胨培养基 （1.5L，分装10只 250mL三角瓶） 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g,琼脂15g， 水1000mL, pH7.4～7.6。制法：溶解分装后 121℃灭菌20min。
其他灭菌物品 （每组1套） 小包装1.5mL离心管、蓝色黄色枪头若干， 培养皿每组1包（每包不少于6个）
问题与思考
影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因 素有哪些？
黑曲霉柠檬酸pH控制
黑曲霉柠檬酸生产菌生长发育适宜PH3～ 7。在含糖合成培养基中，分生孢子在 PH6.8—7.2发芽良好．若起始pH较低(例 如4.5以下)，会强烈抑制它的发育。在 PH2.5以下，分生孢子不膨胀．当pH大于 7.5时分生孢子会剧烈膨胀，甚至破裂。一 般认为柠檬酸发酵在菌种生长期，pH维持 在4.5，而柠檬酸积累时即产酸期的最适 PH 2.0～3.0，pH 3.0以上容易产生草酸
改良CHALMERS培养基（1.5L，分装10只 250mL三角瓶） 大豆蛋白胨5g，牛肉浸膏5g，酵母浸膏5g ，葡萄糖10g，乳糖20g，碳酸钙10g，琼脂 15g，水1000mL， pH7.4～7.6 ，1%中性红 溶液5mL。制法：溶解分装后121℃灭菌 20min。
灭菌自来水 （20mL，于50mL三角瓶） 每组2瓶，其中一瓶放置数颗玻璃珠
孢子培养基 ：要求能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，所以 营养不要太丰富； 发酵培养基 ：既要使菌体能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要 使长好的菌体能迅速合成所需产物 ； 3、合适的pH值，黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵糖，产物以柠檬酸 为主；当pH接近中性时则大量产生草酸， 而柠檬酸产量很低； 4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速250r/m）； 5、限制重金属离子，如Mn2＋缺乏促进EMP途径畅通， 控制Fe2＋含 量使顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累 。
柠檬酸制备
柠檬酸制备
柠檬酸是一种重要的有机弱酸，广泛应用于食品、医药和化工等领域。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 原料准备：以薯干粉为主要原料，这是我国80%以上柠檬酸生产的基础原料。
2. 调制浆料：将薯干粉调制成浓度为18%～22%的浆料，以适合发酵过程的需要。
3. 灭菌发酵：将调制好的浆料送入已经经过蒸汽灭菌（0.2MPa，40～60分钟）的发酵罐中，进行黑曲霉深层发酵。
4. 中和处理：发酵结束后，使用碳酸钙对发酵液进行中和处理，以得到柠檬酸钙。
5. 酸解精制：通过硫酸酸解将柠檬酸钙转化为柠檬酸，然后进行精制，以去除杂质。
6. 浓缩结晶：将精制后的柠檬酸溶液进行浓缩，随后通过结晶过程得到柠檬酸晶体。
7. 干燥包装：最后将结晶出的柠檬酸进行干燥处理，并包装储存。
总的来说，整个制备过程需要严格控制各个环节的条件，以确保产品质量和生产效率。
柠檬酸作为一种无色晶体，无臭，易溶于水，其溶液显酸性。
在生物化学中，它是柠檬酸循环（三羧酸循环）的中间体，这一循环发生在所有需氧生物的新陈代谢中。
因此，柠檬酸不仅是工业上的重要化学品，也是生命科学中的关键物质。
黑曲霉产柠檬酸最适发酵条件的探讨
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【 键词 】 黑 曲霉 关 柠檬酸 发 酵 条件 添 加 剂 ， ５０×１４个 ／ ｌ接 入 菌 种 ， 床 转 速 ３ ０ 按 ． ０ ｍ 摇 ０ ｒ／ｍ ｎ 温 度 ３ ℃ ｉ， ４ 培 养 ４ ｈ后 记 录产 酸情 况 。 ８
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钙盐沉淀法提取柠檬酸[整理]
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钙盐沉淀法提取柠檬酸摘要：利用黑曲霉进行分离复壮，然后利用改良的马丁培养基进行发酵，再通过离心发酵液，利用两种不同的方法钙盐沉淀法和离子交换法进行分离柠檬酸，比较两种方法分离柠檬酸的产量，及两种方法的优缺点，同时还要注意发酵过程中，菌种的产量。
关键字；黑曲霉钙盐沉淀离子树脂交换引言：生产史;1784年C.W.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸。
他是通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。
天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州、意大利和西印度群岛。
意大利的产量居首位。
到1922年，世界柠檬酸的总销售额的90％由美国、英国、法国等垄断。
发酵法制取柠檬酸始于19世纪末。
1893年C.韦默尔发现青霉（属）菌能积累柠檬酸。
1913年B.扎霍斯基报道黑曲霉能生成柠檬酸。
1916年汤姆和柯里以曲霉属菌进行试验，证实大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。
如柯里以黑曲霉为供试菌株，在15％蔗糖培养液中发酵，对糖的吸收率达55％。
1923年美国菲泽公司建造了世界上第一家以黑曲霉浅盘发酵法生产柠檬酸的工厂。
随后比利时、英国、德国、苏联等相继研究成功发酵法生产柠檬酸。
这样，依靠从柑橘中提取天然柠檬酸的方法逐渐为发酵柠檬酸所取代。
1950年前，柠檬酸采用浅盘发酵法生产。
1952年美国迈尔斯试验室采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。
此后，深层发酵法逐渐建立起来。
深层发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。
中国用发酵法制取柠檬酸以1942年汤腾汉等报告为最早。
1952年陈声等开始用黑曲霉浅盘发酵制取柠檬酸。
轻工业部发酵工业科学研究所于1959年完成了200l规模深层发酵制柠檬酸试验，1965年进行了生产100t甜菜糖蜜原料浅盘发酵制取柠檬酸的中间试验，并于1968年投入生产。
1966年后，天津市工业微生物研究所、上海市工业微生物研究所相继开展用黑曲霉进行薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究，并获得成功，从而确定了中国柠檬酸生产的这一主要工艺路线。
柠檬酸发酵原理
去除阳离子杂质： 树脂进行离子交换，当有pH的溶液流出时，表示已有柠 檬酸流出，开始收集。 浓缩： 减压浓缩 结晶： 缓慢搅拌 缺点： 劳动强度大，设备易腐蚀，提取率仅70%左右，同时造 成环境污染。
谢 谢！
柠檬酸发酵工艺流程
主要内容
柠檬酸简介 菌种制备过程 黑曲霉发酵柠檬酸的机制 柠檬酸的发酵生产 柠檬酸的分离 提取
柠檬酸简介
•柠檬酸是一种重要的有机酸，又名枸橼酸，无色晶体， 常含一分子结晶水，无臭，有很强的酸味，易溶于水。
用途： • 用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多 价螯合剂，也是化学中间体。 • 柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子 促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。 所以可以起抗凝血作用。所以柠檬酸钠和草酸钠被称为抗 凝血剂。柠檬酸促进脂肪分解，快速实现减肥。
柠檬酸钙的生成： 发酵结束后滤去菌丝，滤液按总酸量的70% 加入碳酸钙 粉进行中和，随后煮沸柠檬酸钙沉淀出来，在95℃以上 高温时柠檬酸钙 溶解度低，而其他有机酸的钙盐溶解度 高，热水洗涤干净。
硫酸置换反应： 将洗净的柠檬酸加水搅成糊状，在搅拌下加入浓硫酸，温 度80℃以上，硫酸与钙离子形成硫酸钙沉淀下来，将柠 檬酸置换出来。硫酸的用量约为加入碳酸钙的85%-90%。 严格控制温度。
菌种制备过程
工业生产几乎都是用黑曲霉作为生产菌 黑曲霉产酸量高，转化率也高。且能利用 多种碳源，因而是柠檬酸生产的最好菌种。 菌源、平板涂布分离、挑选单菌落 、单菌落 小试管（6天）、鉴定（测酸、镜检）、制作 一代小试管、一代鉴定、制作二代茄子瓶、二 代鉴定、制作麸[fū]曲、鉴定、储藏
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程
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实验七黑曲霉发酵柠檬酸
需要加强黑曲霉发酵柠檬酸的 应用研究，探索其在不同领域
的应用潜力。
感谢您的观看
THANKS
06
结论与展望
本实验的结论
黑曲霉发酵柠檬酸实验表明，在适宜的条件下， 黑曲霉能够有效地将葡萄糖转化为柠檬酸。
通过优化培养基成分和发酵条件，可以提高柠檬 酸的产量和产率。
本实验为黑曲霉发酵生产柠檬酸提供了理论依据 和技术支持，为工业化生产提供了参考。
黑曲霉发酵柠檬酸的应用前景
01
柠檬酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等 领域。
柠檬酸的生物合成途径主 要涉及糖酵解、三羧酸循 环和柠檬酸循环三个过程。
丙酮酸在丙酮酸羧化酶的 作用下生成草酸，草酸进 一步被还原成柠檬酸。
ABCD
在糖酵解过程中，葡萄糖 被降解为丙酮酸，产生 ATP和NADH。
柠檬酸在三羧酸循环中被 氧化成二氧化碳和水，同 时释放能量供细胞代谢使 用。
影响柠檬酸发酵的因素
溶氧量控制
通过控制发酵罐内的搅拌速度和通气 量来调节溶氧量，以确保黑曲霉的正
常生长和代谢。
pH值监测与调节
定期监测发酵液的pH值，并适时添 加酸或碱来调节pH值至适宜范围。
泡沫控制
通过添加消泡剂或调节搅拌速度来控 制发酵过程中的泡沫。
柠檬酸的提取与测定
提取
发酵结束后，将柠檬酸菌泥与发酵液 分离，然后用有机溶剂将柠檬酸提取 出来。
01
02
03
营养物质
碳源、氮源、磷源等营养 物质的种类和浓度对柠檬 酸的产量有显著影响。
温度和pH值
适宜的温度和pH值可以提 高黑曲霉的发酵活性和柠 檬酸的产量。
溶氧浓度
溶氧浓度对柠檬酸的产量 也有影响，过高或过低的 溶氧浓度都不利于柠檬酸 的积累。
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黑曲霉发酵提取柠檬酸
实验一黑曲霉保藏菌的复苏
实验目的：了解黑曲霉保藏菌的生长状况和保藏菌的活化处理过程。
实验原理：能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。
目前国内主要利用黑曲霉（Aspergillus niger）通过固体发酵或液体深层发酵生产柠檬酸。
发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是微生物产生糖化霉首先将淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）转变为丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下乙酰辅酶A和草酰乙酸合成为柠檬酸。
产生的柠檬酸经碳酸钙作用形成柠檬酸钙沉淀，再经稀硫酸作用释放出柠檬酸。
实验步骤：1、观察保藏菌的生长状况，记录PH
2、黑曲霉复苏培养基的配制
（1）、分别称取蔗糖30g，KNO3 1g, K2HPO4 1g, 麸皮10%，MgSO4.7H2O 0.5g, KCL 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 于500ml搪瓷缸中。
（2）、加蒸馏水100ml，调节pH至7.0-7.2
（3）、牛皮纸包扎，灭菌
3、保藏菌的活化扩增
（1）配制5ºBe’麦芽琼脂培养基
（2）20℃麦芽汁，糖度为5
（3）加0.7%的琼脂
（4）加热，使其沸腾
（5）分装与试管中，每管约3ml
（6）包扎灭菌，制成斜面培养基
（7）在超净工作台上划菌，包扎
（8）置于28~30℃培养箱中培养
实验要求：分析复苏和保藏培养基的区别，原因，营养成分的差异和操作的目的和意义。
并加注参考文献。
实验二黑曲霉一级种子的制备
实验目的：了解种子扩大培养的程序，比较复苏均至一级种子的生境变化。
实验原理：黑曲霉在生长过程中不仅需要有充足的营养成分，而且还需要一定的氧气环境等。
通过拌菌等增加菌种与培养基营养成分的充分接触，获得良好的生长。
实验步骤：1、观察活化的保藏菌生长状况，并记录。
2、在超净工作台上，将2-4管/组，活化的保藏菌分别加入约3mL双蒸水。
3、在混匀器上，将活化的保藏菌制成孢子悬液。
4、在超净工作台上，将孢子悬液一次倒入察氏培养基中。
5、用灭过菌的玻棒，将菌液和培养基充分拌匀。
6、测定此时的pH值，并记录。
7、取5ml充分拌匀的菌液培养基，用滤纸过滤。
8、收集滤液于20ml 离心管中。
9、3000r/min, 离心5min。
10、收集上清于试管中，标记后置于-4℃冰箱中。
11、每隔2天，用灭过菌的玻棒，在超净工作台上拌菌。
同时测定pH，并取5ml样品，以上述做法，将收集的上清液保藏于-4℃冰箱中。
注意：标记时，要标明实验日期，组别，班号。
实验三黑曲霉二级种子培养基的制备
实验目的：了解菌种扩大培养基的成分差异及作用。
实验原理：根据黑曲霉种子生长的不同阶段和培养目的的不同，所需营养成分也有差异。
并为了使黑曲霉种子能够更好的适应发酵培养基的生长而要进行不断的种子驯化。
实验步骤：1、观察黑曲霉复苏种子的生长状况，并记录。
2、配制二级种子培养基（每组含量）
（1）分别称取麸皮30g，膨化大豆粉12g，于500ml搪瓷缸中。
（2）加入蒸馏水100ml，充分拌匀。
（3）调节pH值至5.0
（4）用折叠成8层的纱布覆盖搪瓷缸口。
（5）用牛皮纸包扎，灭菌。
实验四黑曲霉二级种子的培养
实验目的：了解种子扩大培养的级数确定和种子的驯化。
实验原理：为了有效的获得一定数量的发酵菌种，必须对复苏培养的菌种进行扩大培养，并使菌种能够更好的适应发酵培养基，而对二级种子培养基的营养成分做了调整。
实验步骤：1、在操作台上，迅速将一级种子拌入二级种子培养基中
2、用灭过菌的玻棒充分拌匀。
3、测定pH值
4、取出约5ml的拌种后的培养基
5、将剩余培养物，用8层纱布+牛皮纸包扎。
6、放于28℃恒温培养箱中培养
7、将取出的5ml培养物用滤纸过滤（注意多冲洗数次）
8、放于20ml离心管中，3000r/min, 离心5min。
9、收集上清于试管中，标记后置于-4℃冰箱中。
10、每隔2天，测定pH，并取5ml培养物，以上述做法，将收集的上清液保藏于-4℃冰箱中。
实验五黑曲霉发酵培养基的制备
实验目的：了解发酵培养基的基本成分。
比较发酵培养基与种子培养基的成分差异。
实验原理：黑曲霉发酵培养的目的是获得柠檬酸次生代谢物，因此要求在低氮高碳源的环境条件。
而黑曲霉种子培养在高氮高碳源的培养基中，更有利于种子的健壮生长。
实验步骤：1、观察黑曲霉二级种子培养基，并取样做记录。
2、分别称取玉米面200g，麸皮25g，膨化大豆粉25g于500ml搪瓷缸中。
3、加水200ml，搅拌均匀。
4、测定pH值。
5、包扎、灭菌。
6、同时将小搪瓷盘包扎灭菌，每组1个。
实验六黑曲霉生长过程中碳含量的变化测定
实验目的：了解培养基中糖含量的变化，描绘碳源在黑曲霉生长过程中的代谢含量的变化。
实验原理：黑曲霉生长过程中所需的碳源主要通过糖来提供，糖的提供方式有多种，如淀粉、玉米粉、麸皮和葡萄糖等，无论哪种糖都是要水解成单糖参与黑曲霉的生长代谢。
因此，我们用总糖含量的测定，来探究黑曲霉生长过程中的碳源走向。
实验步骤：1、葡萄糖标准曲线的制备
精确称取标准葡萄糖4mg于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成0.04mg/mL的葡萄糖标准溶液。
分别精确吸取0.0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL和2.0mL，加水至2.0mL，然后加入6%苯酚溶液1.0mL，边摇边迅速滴加5.0mL浓硫酸，摇匀，静置l0min，在490nm 处测定溶液的吸光值。
以吸光值为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2、糖含量的测定方法
取2.0mL溶液，加入6%苯酚溶液1.0mL及浓硫酸5.0mL，静置10min，摇匀，沸水浴15min后冷却至室温，使用可见分光光度计测定其吸光
值。
实验七黑曲霉生长过程中铵根离子的测定
实验目的：黑曲霉生长过程中需要消耗大量的碳源和氮源，氮源的提供途径有很多，参与代谢的只有N+,因此通过对NH4+ 的测定来探究氮源的代谢。
实验原理：铵根离子的测定方法为苯酚一次氯酸盐法。
试验步骤：1、配制A液:5g苯酚和25mg硝普钠溶于100ml水中;
2、配制B液:2ml次氯酸钠溶液和2.5g氢氧化钠溶于100ml水中。
3、测定时吸取0.2ml样品溶液于试管中，
4、加入3.8ml0.03mM硫酸（pH3.5)，
5、分别加入A、B液各0.5ml，
6、37℃水浴加热20min，
7、于625nm处测定吸光度。
分别取0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM的硫酸铵做成标准
曲线
实验六黑曲霉发酵菌的接种及培养
实验目的：了解黑曲霉发酵原理及发酵过程中的影响因子有哪些？实验原理：黑曲霉生产柠檬酸需要经过EMP和戊糖磷酸HMP途径共同完成。
其比率为EMP/HMP=2:1。
首先糖被氧化生成丙酮酸经氧化脱羧酶体系，生成乙酰辅酶A 经TCA生成中间代谢产物异柠檬酸脱氢脱羧生成а-酮戊二酸
HMP途径主要存在于孢子形成阶段，它提供合成核酸所需的前体物质。
因此EMP途径在黑曲霉柠檬酸产生菌中起主要作用。
实验步骤：。