食品中沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

２ＣｌｇｆｅｒａｄｃｅｏｔＣｉａｇｉｌｒｌｎｖｒｉ，Ｇｕｎｚｏ１６２ｈｎ）．ｏｌｅＶｔｉｒＭｅｉｎ，ＳｕｈｈｎＡｒｕｔａＵｉｅｓｅｏｅｎｙｉｃｕｙｔａｇｈｕ５０４，Ｃｉａ
ｗａｅｅｏｅ．ｓｔｏｒｍｅｓｗｅｅｄｓｇｅｃｏｄｎｏｔｅｎｃｅｔｅｓｑｅｃｆｈａｇｔｉｖｇｎａｍｏｓｄｖｌｐｄＡｆｐｉｒｒｅｉｎｄａｃｒｉｇｔｈｕｌｏｉｅｕｎｅｏｅｔｒｅｎＡｅｅｉＳｌ — ｅｄｔｎ
ＡｂｔａｔＩｉｓｒｃ：ｔＳｉｍｐｏｔｎｅｅｔｒａｔｏｄｔｃｔ
ｏｅ￣ｉｏｄｏｏｄｍａｅｉｌｉｒｅｓｕｅｔｅｆｏａｅｙＡａｄｓｎｎｌｎｆｏｒｆｏｔｒａｓｎｏｄｒｏａｓｒｈｏｄｓｆｔ．ｒｐｉｅｈｔａｌｔｅ７Ｓｌｎｌａｔｒａｔａｎａｐｃｆｃａｐｉｃｔｎ，ｂｔｔｅ４ｎｎｔｏ．Ｔｅｒｓｌｓｏｄｔａｌｈａｍｏｅｌｂｃｅｉｌｓｒｉｓｈｄｓｅｉｍｌｆａｉｓａｉｉｏｕｈｏ一
ｓｉｅｌｏ — ｄａｄｉｔｅｍａａｌｃｔｎ（ＡＭＰｍｅｈｄａｓｙｆｒｈｏ－ｏｎａｏｅａｍｏｅｌｅｃｏｉｖｐｍｅｉｔｏｈｒｌｍｐｉａｉＬｔｏｅｓｉｆｏ）ｔｏｓａｅｆｄｂｒｅｐｔｇｎＳｌｎｌｄｔｔｎｏｔｏｈａｅｉ
ＨＵＡＮＧｉｈｉＳＪｎ— ａ，ＵＮｅｈ，ＣＨＥＮ２ＺＨＵＡＮＧｉｗｅ，ＬＩＹｉｇ，ＷＡＮＧｉｇｓＹｕ — ｕｉＲｕｉＳｈ．ｎＵｎＪｎ．ｉ
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扩增，同时建立沙门氏菌人工污染的食品模型，比较了ＬＭＰ法与活菌计数检测的敏感性．结果表明，该方法仅对Ａ沙门氏菌产生特异性扩增，灵敏度高迭３６～３ｍＬ，食品样品经细菌富集培养后，检测灵敏度高达８５ ‘ ．．所建立的２
检测沙门氏菌方法具有较高的特异性与灵敏性，操作简单、快速，可用于沙门氏茵污染食品的快速检测．关键词：沙门氏菌；侵袭性因子Ａ；环介导等温扩增技术中图分类号：Ｒ１５５５．文献标志码：Ａ文章编号：０９ — １７２１）５０６—５４３２３（０２０．４８０
ａｉｃａｌｏｔｍｉａｅｏｓｃｎｔｕｔｄｔｖｌａｅｔｅｓｎｉｖｔｆＬｔｉｒｆｉｌｃｎａｎｔｄｆｄｗａｏｓｒｃｅｏｅａｕｔｈｅｓｔｉｏＡＭＰａｓｙａｄｂｃｅｉｌｃｌｃｕｔｇｙｏｉｙｓａｎａｔｒａｅｌｏｎｉｎ
ｎｌｅｌ７ｓｒｉｓｏｎｍｏｅ￣ａｄ４ｎｎＳｌｎｌｂｃｅｉｒｅｅｔｄｂＡＭＰ。ａｄｍｅｎｉｈｏｅｏｄ．ｔａｎｆＳｌｎｌｎｏ．ｎｍｏｅ￣ａｔｒａｗｅｅｄｔｃｅｙＬｎａｗｈｌｔｅｍｄｆｅ
（．天津大学化工学院，天津３０７；２华南农业大学动物医学院，广州５０４）１００２．１６２
摘要：食品及其原料中沙门氏茵的快速、现场检测对食品安全控制具有重要意义．根据沙门氏菌ｉｖ基因核苷ｎＡ
酸序列设计一组引物，应用环介导等温扩增技术（ＡＭＰ，分别对７种不同血清型沙门氏茵和４种非沙门氏菌进行Ｌ）
Ｄｅｅｏｍｅｔｆｏ — ｅｉｔｓｔｅｍａｖｌｐｎｏＬｏｐＭｄａｅＩｏｈｒｌＡｍｐｉｃｔｎＡｓａｏｌａｉｓｙｆｒｉｆｏＳａｍｏｅｌｔｃｉｎｉｏｌｎｌＤｅｅｔｏＦｏｄａｎ
勋ｏｅｌａｔｒ１ｔｉｓｓｂｔｄｎｇｔｅｒａｔｎ．ｅｓｉｉｆＡＭＰａｓｙｆｒｕｅｃｌｃｌｒｆａｍｏｎｌｂｃｅｉｒｎｕｍｉｅｅａｉｅｃｉｓＳｎｉｖｔｏａａｓａｔｖｏｔｙＬｓａｒｅｌｕｔｅｏｌ — ｏｐｕＳ
第４５卷
第５期
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Ｖｂ＿５ＮＯ５Ｉ４．
Ｍａ２２ｖ０１
２１０２年５月
ＪｕｎｌｆｉｎｉｎｖｒｉｏｒａｏａｊＵｉｅｓｙＴｎｔ
食品中沙门氏菌ＬＭＰ快速检测方法的建立Ａ
黄金海，孙跃辉，陈瑞，庄世文，刘莹，王静思

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加环引物LAMP法快速检测沙门氏菌方法的研究

引言
沙门氏菌属（ａｏｅａＳｌｎｌ）ｍｌ是肠杆菌科的一类革兰氏阴性肠道杆菌，是一种重要的人兽共患病病原茵，可引起
伤寒、肠炎等多种疾病．肉、蛋、奶等畜产品中含有多种营养成分，适合沙门氏菌的生长，是该菌的主要传播媒介．在我国细菌性食物中毒中，７．０有０８％是由沙门氏菌引起的，而在引起沙门氏茵中毒的食品中，肉、蛋、奶等
氏菌的ｉａ因为靶基因，选择ＰＲ的特异性引物，并基于该基因设计出ＬＭＰ反应的引物；究对ＬＰ体系的ｎ基ｖＣＡ该研ＭＡ反应温度、ＮＴｄＰ浓度和镁离子浓度等扩增条件也进行了优化，并检测了ＰＲ和ＬＰ的引物特异性，比较了ＰＲ法、ＣＭＡＣＬＰ法和加环引物的ＬＰ法的灵敏度．结果表明：ＰＲ法检测的灵敏度为２２ｘ０ｃ／，未加环引物的ＬＭＰＭＡＭＡ普通Ｃ．８ｌｆｍｌｕＡ
Hale Waihona Puke 物（Ｆ和Ｌ）有助于该法提高扩增效率．ＬＢ，虽然环引物和内引物都作用于环结构上，但是环引物所杂交的ＬＭＰＡ形成的环结构是内引物杂交的环结构以外位置，它们的扩增机制并不相同．目Ｊ前，对环引物在进行ＬＭＰＡ反应
中所起的作用的研究较少．本次试验在ＬＭＡＰ反应中加入环引物，并分别与普通ＬＭ和ＰＲ进行比较，ＡＰＣ研究加入环引物对ＬＭ法检测沙门氏菌检测的影响，ＡＰ从而建立一套高效的快速检测沙门氏菌的方法．
１材料与方法
１材料与试剂．１
ＬＭＰ反应试剂：ｓＤＡｐｙｒｅａｅｒｇｅｔ自ＮｗＥｇｎｉｌ公司；ＡＢｔＮｏｍｅｓｌｇａｍｎ购ｌａｒｆｅｎｌｄｏｂａＢａ甜菜碱（ｅｉ）自北Ｂｔｎ￣ａｅｌ

肠炎沙门菌LAMP检测方法的建立

肠炎沙门菌LAMP检测方法的建立邓显文;谢芝勋;谢丽基;谢志勤;刘加波;庞耀珊;彭宜;范晴【摘要】为建立一种能快速检测肠炎沙门菌(SE)的方法,本研究根据基因库中SE种特异性基因(sdfⅠ)的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了SE的LAMP可视化检测方法.该方法的敏感性可达100 fg DNA,高于常规PCR方法100倍；全部反应可在1h内完成；可通过肉眼观察颜色直接判定结果；对其他常见病原体的检测结果均为阴性.结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于SE感染的快速检测.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)005【总页数】4页(P27-30)【关键词】肠炎沙门菌;环介导等温扩增;检测【作者】邓显文;谢芝勋;谢丽基;谢志勤;刘加波;庞耀珊;彭宜;范晴【作者单位】广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001【正文语种】中文【中图分类】S852.612肠炎沙门菌是目前引起人类食物中毒的主要病原之一，其感染主要是因食用了被肠炎沙门菌污染的动物性食品，尤其是家禽的肉蛋食品，近年来，肠炎沙门菌食物中毒和动物感染肠炎沙门菌十分严重，已引起养殖业和公共卫生界的高度重视［1－4］。

目前应用PCR技术对SE的检测已有报道［5－9］，PCR检测方法虽然快速、敏感性较高，但是需要使用昂贵的仪器和试剂等，环介导等温扩增（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型核酸扩增技术，该技术具有简捷、成本低廉和结果可视化等优点，目前在一些病原微生物的检测中被广泛应用［10－11］。

加环引物LAMP法快速检测沙门氏菌方法的研究

加环引物LAMP法快速检测沙门氏菌方法的研究李雪;唐善虎;郝小倩;岑璐伽【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(038)001【摘要】探讨了加环引物对LAMP的影响,并与普通PCR法进行了比较,建立一套快速检测沙门氏菌的新方法.以沙门氏茵的inva基因为靶基因,选择PCR的特异性引物,并基于该基因设计出LAMP反应的引物；该研究对LAMP体系的反应温度、dNTP浓度和镁离子浓度等扩增条件也进行了优化,并检测了PCR和LAMP的引物特异性,比较了PCR法、LAMP法和加环引物的LAMP法的灵敏度.结果表明:普通PCR法检测的灵敏度为2.28×103cfu/ml,未加环引物的LAMP法的灵敏度为2.28×101cfu/ml,加环引物的LAMP法的灵敏度为2.28×100cfu/ml.通过三种方法的比较可知:LAMP法检测沙门氏菌比PCR法更加快速、灵敏,而加环引物可进一步提高LAMP的扩增效率.本研究为快速检测沙门氏菌方法的构建奠定了基础,并认为LAMP在检测微生物方面有着广泛的发展前景.【总页数】5页(P64-68)【作者】李雪;唐善虎;郝小倩;岑璐伽【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041【正文语种】中文【中图分类】TS201.3【相关文献】1.PMA-LAMP法对克氏螯虾样品中沙门氏菌的快速检测 [J], 张毅;胡定金;付云洁;魏辉2.加环引物LAMP法快速检测布鲁氏杆菌方法的研究 [J], 郭恋;蒙晓雷;李秀梅;李颖;杨爱华;王健春;赵静3.使用环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测鸡蛋中的沙门氏菌 [J], 李雪;唐善虎;郝小倩;岑璐伽4.沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立 [J], 郭澍强;贺生芳;郝俊虎;谈静慧;杨旭光;李婧5.牛奶中活沙门氏菌BCAC-EMA-Rti-LAMP快速检测方法的研究 [J], 张天添; 陈鹄; 吴国平; 舒梅; 林丽萍; 钟婵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

使用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测鸡蛋中的沙门氏菌

主要是由于外部原因引起的，了减少沙门氏菌污染，为建议企业做好蛋壳的消毒工作，强生产、存、加储运输和销售过程的管理。关键词：鸡蛋内容物；蛋壳；ＡＰ；Ｃ国标法ＬＭＰＲ；
中图分类号：３８３ｇｈｌｈｒｆｒ，ｅｔｒａａｓｓｏａｍｏｅｌｎｅｇｓｒｃｓｗｒｈｉａｓｒａｍｏｅｌｏｈｇｓｅ１ａ．ＴｅｅｏｅｘｅｎｌｃｕｅｒＳｌｎｌｏｇｕａｅｅｅｔｅｍａｎｃｕｅｆａｆｏ
试验结果表明：ＡＬＭＰ和ＰＲ的沙门氏菌检出率均高于国标法，ＬＭＣ而ＡＰ法敏感性、特异性和符合率也均高于ＰＲ法，Ｃ因此，ＡＬＭＰ是一种快速、敏感和高度特异性的沙门氏菌检测方法，得推广。本研究中还发现，蛋值在鸡内容物检出沙门氏菌的鸡蛋样品中，大约有７％的鸡蛋在蛋壳上都能检出沙门氏菌。因此，门氏菌污染鸡蛋０沙
ＲａｉｔｃｉｎｏｌｎｌｎＥｇｓＵｓｎｏｐｐｄＤｅｅｔｆＳａｍｏｅｌｉｇｉｇＬｏ－ｍｅｉｔｄＩｏｈｒｌｏａｄａｅｓｔｅｍａ
Ａｍｐｉｃｔｎ（ＡＭ）ｌｉａｉＬＰｆｏ
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ＬＡＭＰａｄＰｔｏｓＲｅｕｔｓｏｄｔａＡＭＰａｄＰｒＳｌｎｌｅｅｔｎｈｄｈｇｅｏｉｖａｅｎＣＲｍｅｈｄ．ｓｌｈｗｅｈｔＬｓｎＣＲｆａｍｏｅｌｄｔｃｉａｉｈｒｐｓｔｅｒｔｓｏａｏｉ

3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立

3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立摘要建立了3类食品中沙门氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。

选取invA基因作为靶序列设计1对引物,在沙门氏菌中能扩增出198 bp的预期片段,而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的沙门氏菌种特异性。

通过对沙门氏菌标准菌种纯培养液PCR方法灵敏性的检测,发现纯培养的检测极限为72个细菌。

用该方法对3类共计56份食品样品进行检测,检测结果与传统分离鉴定方法完全相符,表明该方法适用于食品中沙门氏菌的快速检测。

关键词食品;沙门氏菌;PCR快速检测方法;建立沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。

该菌广泛分布于自然界,目前全世界已经发现2 523个血清型,我国发现的血清型近300个。

许多血清型的沙门氏菌都能产生毒素,以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最为常见[1]。

常见的肉类食品和奶蛋类食品都会被沙门氏菌污染,在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2位[2-3]。

有资料显示,我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的[4]。

另外,每年出口的食品由于沙门氏菌污染而造成退货或索赔,以及食品加工厂由于沙门氏菌污染,经常导致重大的经济损失。

因此,对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性。

为有效地预防和控制疾病的发生,同时满足食品出口业日益发展的需要,建立快速、敏感而又特异的检测沙门氏菌的方法是非常必要的。

随着分子细菌学研究的开展,人们对细菌的毒素、侵袭素与毒力岛等毒力因子的认识不断深入,使细菌检测从表型特征鉴定逐渐向遗传特征的鉴定,而PCR技术是近年来发展起来的一种体外扩增特异性DNA片段的技术,具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点[5-7],因而从20世纪90年代以来开始尝试利用该技术来检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌。

PCR检测方法的特异性与灵敏度主要取决于相应检测靶点的选择,本研究选取invA基因作为靶序列设计1对引物,成功地建立了沙门氏菌的PCR快速检测方法。

沙门菌invA基因LAMP快速检测法的建立和初步应用

[作者简介]　王敏雅(1980-),女,学士,技师,主要从事微生物检验工作。

【论著】沙门菌inv A基因LAMP快速检测法的建立和初步应用王敏雅1,徐明汉2,潘宏伟3,王志刚4(11浙江省台州市路桥区疾病预防控制中心,浙江台州　318050;21浙江省温州医学院,浙江温州　325035;31浙江省台州医院,浙江临海　317000;41浙江省疾病预防控制中心,杭州　310009)[摘要]　目的:建立适合基层检验部门使用的快速检测沙门菌LAMP法。

方法:在65℃普通恒温水浴中、60m in扩增沙门菌inv A基因片段,目测或电泳快速检测沙门菌。

分别对环介导等温扩增(LAMP)反应影响较大的温度、Betaine浓度等进行优化,并对实验室保存的28种沙门菌不同血清型共34株和其他9种肠杆菌科细菌进行检测;对部分沙门菌进行污染血清直接LAMP模拟检测。

结果:28种不同血清型的沙门菌LAMP检测都呈阳性,其它9种肠杆菌科细菌均为阴性;血清模拟实验与菌株直接DNA提取LAMP检测结果一致。

结论:LAMP法能够快速、特异地检测沙门菌,且不需要昂贵的仪器,适合基层检验部门使用。

[关键词]　沙门菌;LAM P法;inv A基因;快速测定[中图分类号]　R37812+2 [文献标识码]　A [文章编号]　1004-8685(2008)10-1971-04Est ablishm en t and preli m i n ary appli ca ti on of LA M P i n vA gene a ss ay for rap i d detecti on of Sa l m onellaW ang M in2ya1,Xu M ing2han2,Pan Hong2w ei3,W ang Zhi2gang4(11Luqiao Center for D isease Contr ol and Preventi on,Taizhou318050,China;21W enzhou Medical College,W enzhou325035, China;31Taizhou Hos p ital of Zhejiang Pr ovince,L inhai317000,China;41Zhejiang Center f or D isease Contr ol and Preventi on, Hangzhou310009,China)[Abstract]　O bjecti ve:To establish a method of l oop-mediated is other mal a mp lificati on(LAM P)for the rap id detecti on of Sal m onella in basic clinical and ep ide m il ogicl laborat ory1M ethods:Op ti m izing the te mperature and Betaine concentrati on which are sensitive for the LAMP1Esti m ating by eyeball or electr ophoresis the a mp lificati on characteristics of the sal m onella inv A gene seg ment in ther mostatic water-bath under65℃and60m in1The34strains of28ser otypes of Sal m onella and9other kinds of en2 terbacteria were tested1Some hu man seru m s experi m entally infected by Sal m onella were directly a mp lified by LAMP method1Results:A ll LA MP reacti ons of28ser oty pes of sal m onella were positive,and others are negative1The results of the infected seru m directly a mp lified by LAMP were consisted with the results of co mmon strain test1Conclusi on:This LAMP-based assay is rap id and s pecific,and no ex pensive apparatus is needed1Theref ore,it is es pecially suitable f or basic clinical and ep ide m il ogicl lab1 [Key words]　Sal m onella;LAM P Test;inv A gene;Quick deter m inati on 沙门菌是引起伤寒和食物中毒等疾病的主要致病菌,在美国每年大约有80～400万人因沙门菌而染上疾病,数百人死亡[1,2],在世界各地的食物中毒中,沙门菌引起的中毒病例占首位或第二位[3]。

食品中沙门氏菌的快速检验方法

86·FOOD INDUSTRY分析检测　陈文财惠州市食品药品检验所食品中沙门氏菌的快速检验方法泛用于遗传病诊断和微生物检验中。

（我个人认为沙门不会用）荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检验法基于沙门氏菌ｆｉｍＹ基因序列，进行引物和探针的设计，利用基因重组技术对检测的定量标准品进行构建，可借助荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ法对沙门氏菌进行检测。

该方法操作简单、检验快速、适用范围广，在临床诊断、商品检验、食品卫生监管等领域均有运用。

多重ＰＣＲ快速检验法多重ＰＣＲ快速检验法基于质粒毒力基因ｓｐｖＣ、１６Ｓ　ｒＲＮＡ、ｆｉｍＡ、致病基因ｉｎｖＢ序列设计引物，多重ＰＣＲ检测沙门氏菌株基因组ＤＮＡ，以此实现对沙门氏菌的快速检验。

多重ＰＣＲ快速检验法可对沙门氏菌的多种毒力因子进行鉴定，是沙门氏菌株检验和鉴定的新方法。

变性高效液相色谱检测法　变性高效液相色谱结合多重ＰＣＲ反应技术可对食品中的沙门氏菌进行快速检测。

该方法以ｆｉｍＹ基因为靶基因，选择引物可实现对多重ＰＣＲ体系的优化，由此可对沙门氏菌进行快速鉴别。

该方法的特异性、灵敏性较高，其扩增产物为２８４ｂｐ，可对沙门氏菌进行快速检验，并能进一步验证多重ＰＣＲ的特异性。

沙门氏菌是食物常见的病原菌，具有传播媒介多、途径繁复等特点，容易污染食品而危害人体健康。

另外，沙门氏菌是多种有紧密联系细菌的泛指，包括导致伤寒、胃肠及引起食物中毒的众多细菌。

文中提到的几种快速检验法与传统检验法相比，具有操作简单、特异性强、灵敏度高等特点。

但这些方法也存在各自缺陷，试纸快速检验法检验纯菌时，若目菌＞１０３ｃｆｕ／ｍｌ时，纸片菌斑密集，可导致假阴性反应的发生。

ＰＣＲ检验的特异型取决于所选扩增的靶序列，若为保守的特异片段，所选引物就会显示出特异型。

ＬＡＭＰ技术的产物复杂多样，引物设计要求较高，目标单链ＤＮＡ的分离困难，无法对扩增产物的序列进行分析；其在同一温度条件下采用多条引物扩增非特异性条带，可能会出现假阳性结果。

LAMP在食品卫生沙门菌检验中的应用价值

LAMP在食品卫生沙门菌检验中的应用价值分离培养法是国内食品沙门菌检测的常用方法, 其操作流程繁琐, 且需耗费大量的时间。

同时, 针对免疫学方法, 其敏感度不高, 针对聚合酶连反应法, 其需特殊仪器和设备, 导致检测受到限制[1]。

环介导等温扩增技术, 即LAMP,其属于新型等温核酸扩增方法, 操作方式简单、敏感度高等是其主要优点〔2〕。

因此, 为研究LAMP在食品卫生沙门菌检验中的应用价值, 本研究以84件食品样本为对象, 采用2种不同的检测方法, 取得了一定成效, 现将相关报道如下。

1 一般资料与方法1.1一般资料选取2015年3~12月收集的食品样本84件, 其中, 包括20件生鲜肉、巧件熟肉制品、18件生水产品、17件非发酵豆制品、4件冷冻生肉、4件生食类蔬菜和6件鲜榨果汁。

以肠炎沙门菌为参考菌株。

1.2方法1.2.1食品样本前增菌以《食品微生物学检验沙门氏菌检验》为依据, 分别选取25g食品标本, 将其添加至225mlBPw无菌质袋内, 利用拍击式均质器, 进行1~2min的拍打, 基于37°c下, 8~18h为培养时间。

针对冷冻产品, 应以低于45°C为基础条件, 解冻时间不得超过15min.1.2.2LAMP检测方法分别取食品标本前增菌液lml,基于10000r/min指标下, 进行2min的离心, 除去上清液后, 借助核酸通用提取试剂盒, 提取核酸。

与此同时, 取μl上清液, 用于制作待检模板DNA.以食品微生物学检验沙门氏菌检验冲指导, 设计引物, 并检测食品标本增菌液DNA,且以标准的反应体系为指标。

以65°C为条件, 进行60min的水浴, 基于80°C灭活酶前提下, 促使反应体系得以终止。

待结束反应后, 通过肉眼检测, 若表现出混浊现象, 则为阳性, 若不存在混浊现象, 则为阴性。

1.2.3分离培养鉴定基于《食品微生物学检验沙门氏菌检验》指导下, 在轻轻晃动经培养过的食品标本前增菌液后, 以1ml为标准, 将其放置于10mlTTB增菌液中, 以42°C为标准, 18~24h为培养时间。

沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

ｄｏｉ：１０．１１７５１／ＩＳＳＮ．１００２－１２８０．２０１９．０８．０４沙门氏菌ＬＡＭＰ快速检测方法的建立郭澍强，贺生芳，郝俊虎∗，谈静慧，杨旭光，李婧（宁夏检验检疫局检验检疫综合技术中心，银川７５０００２）［收稿日期］２０１９－０３－１８㊀［文献标识码］Ａ㊀［文章编号］１００２－１２８０（２０１９）０８－００２３－０７㊀［中图分类号］Ｓ８５２．６１［摘㊀要］㊀为实现沙门氏菌的快速检测，根据沙门氏菌特异性ｉｎｖＥ㊁ｈｉｌＡ㊁ｉｎｖＡ㊁ｈｕｔ基因编码区序列，分别设计合成４套引物，通过对引物筛选和反应条件优化，建立了以ｉｎｖＡ特异性基因设计合成为引物的沙门氏菌环介导等温扩增检测方法㊂本方法对沙门氏菌定性检测灵敏度可达到１０１ＣＦＵ／ｍＬ（细菌浓度），其灵敏度比普通ＰＣＲ高１０倍且反应结果易于观察㊂以６种沙门氏菌和８种非沙门氏菌细菌ＤＮＡ为模板进行ＬＡＭＰ扩增检测，并无交叉反应㊂结果显示，设计的ＬＡＭＰ引物组和建立的沙门氏菌的ＬＡＭＰ检测方法具有特异性好㊁灵敏度高㊁快速㊁费用低廉等优点，可应用于动物和食品样品中肠道沙门氏菌６个亚种的快速检测㊂［关键词］㊀沙门氏菌；ＬＡＭＰ；ｉｎｖＡ基因；引物；检测方法作者简介：郭澍强，硕士，从事动物检疫及临床兽医诊断技术研究㊂通讯作者：郝俊虎㊂Ｅ－ｍａｉｌ：６７６９８９７５２＠ｑｑ．ｃｏｍＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＲａｐｉｄＬＡＭＰＴｅｓｔＭｅｔｈｏｄｆｏｒＳａｍｏｎｅｌｌａＧＵＯＳｈｕ－ｑｉａｎｇ，ＨＥＳｈｅｎｇ－ｆａｎｇ，ＨＡＯＪｕｎ－ｈｕ∗，ＴＡＮＪｉｎｇ－ｈｕｉ，ＹＡＮＧＸｕ－ｇｕａｎｇ，ＬＩＪｉｎｇ（ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒｏｆＮｉｎｇｘｉａＥｎｔｒｙ－ｅｘｉｔＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎａｎｄＱｕａｒａｎｔｉｎｅＢｕｒｅａｕ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ７５０００２，Ｃｈｉｎａ）㊀㊀Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＨＡＯＪｕｎ－ｈｕ，Ｅ－ｍａｉｌ：６７６９８９７５２＠ｑｑ．ｃｏｍＡｂｓｔｒａｃｔ：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａ，ｆｏｕｒｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｉｎｖＥ，ｈｉｌＡ，ｉｎｖＡａｎｄｈｕｔｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａ．Ｂｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｏｎｅＳａｌｍｏｎｅｌｌａｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｕｓｉｎｇｉｎｖＡｐｒｉｍｅｒｓ．ＴｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｃｏｕｌｄｒｅａｃｈ１０１ＣＦＵ／ｍＬ，ａｎｄｉｔｓｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｗａｓ１０ｔｉｍｅｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｏｒｄｉｎａｒｙＰＣＲ，ａｎｄｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｉｓｅａｓｙｔｏｏｂｓｅｒｖｅ．ＬＡＭＰａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｗｈｅｎ６Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａａｎｄ８ｎｏｎ－ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｂａｃｔｅｒｉａｌＤＮＡｓｗａｓｕｓｅｄａｓｔｅｍｐｌａｔｅｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＬＡＭＰｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｈａｓｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｒａｐｉｄｉｔｙａｎｄｌｏｗｃｏｓｔ，ｗｈｉｃｈｃａｎｂｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｉｘｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｉｎａｎｉｍａｌａｎｄｆｏｏｄｓａｍｐｌｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓａｍｏｎｅｌｌａ；ＬＡＭＰ；ｉｎｖＡｇｅｎｅ；ｐｒｉｍｅｒ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ㊀㊀沙门氏菌是肠杆菌科中的一个重要菌属［１］，可引起鸡白痢㊁禽伤寒㊁犊牛腹泻㊁奶牛乳房炎等多种动物疾病［２－４］㊂同时，沙门氏菌也是一种重要的食源性致病菌，据统计，目前世界上８５％的食物中毒是由沙门氏菌引起的［５］㊂目前，对沙门氏菌的传统检测方法需要较长的实验周期，试剂多且杂［６］，在快速㊁特异检测方面具有一定的局限性㊂而其它各种检测方法敏感㊁快速，却需昂贵庞大的仪器设备㊁复杂繁琐的电泳过程等，进而使检测在受到条件限制的检验工作中，很难得到普遍应用［７］㊂环介导等温扩增（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）是Ｎｏｔｏｍｉ等人在２０００年发明的一种新的恒温核酸扩增技术㊂ＬＡＭＰ技术可实现在恒温条件下（一般在６０６５ħ）快速连续扩增，具有实验过程快速㊁简便，仪器设备简单㊁便携，检测结果特异性强㊁灵敏度高的优点㊂ＬＡＭＰ扩增结果观察方式多，凝胶成像系统观察结果㊁肉眼观察颜色变化及试纸条技术，也可使用实时荧光法和实时浊度法，通过实时荧光ＰＣＲ仪或实时浊度仪对扩增结果进行实时观察［８］㊂针对我国目前严峻的食品安全问题和复杂的口岸卫生监控形势，本文开展了沙门氏菌ＬＡＭＰ快速检测方法的研究，以实现对沙门氏菌的快速检测㊂１㊀材料与方法１．１㊀材料１．１．１㊀实验菌株及抗原㊀沙门氏菌实验用标准菌株购自中国工业微生物保存中心和北京路桥技术股份有限公司，试验用凝集抗原购自中国兽医药品监察所，详情见表１㊂表１㊀菌种及抗原Ｔａｂ１㊀Ｓｔｒａｉｎｓａｎｄａｎｔｉｇｅｎｓ菌株名称编号来源鼠伤寒沙门氏菌ＡＴＣＣ１４０２８北京陆桥甲型副伤寒沙门氏菌ＡＴＣＣ５００８４北京陆桥乙型副伤寒沙门氏菌ＡＴＣＣ５００９４北京陆桥鸡白痢及禽伤寒沙门氏菌凝集抗原２０１８．０５中国兽医药品监察所肠炎沙门氏菌ＡＴＣＣ５０３３５北京陆桥金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ６５３８北京陆桥痢疾志贺氏菌ＣＩＣＣ１０９８３工业微生物菌种保藏中心阪崎肠杆菌ＣＩＣＣ２１５６０工业微生物菌种保藏中心霍乱弧菌ＣＩＣＣ２３７９４工业微生物菌种保藏中心致病性大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ１０３７２工业微生物菌种保藏中心布氏杆菌试管凝集抗原２０１８．０６中国兽医药品监察所肠出血性大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ２１５３０工业微生物菌种保藏中心单增李斯特菌ＡＴＣＣ１９１１５北京陆桥炭疽沉淀抗原２０１８．０９中国兽医药品监察所１．１．２㊀主要试剂和设备㊀上海生工细菌基因组ＤＮＡ快速抽提试剂盒（产品批号：Ｂ５１８２２５），荣研生物科技（中国）有限公司２ˑ反应缓冲液ＲＭ㊁ＢｓｔＤＮＡ聚合酶（产品批号：５Ｚ００６），天根２ˑＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（产品批号：Ｐ４２１８），ＤＬ１０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（产品编号：３５９１Ａ），ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＶｅｒｉｔｉ９６－ＷｅｌｌＰＣＲ扩增仪，日本荣研ＬＴ－１６ａｌｐｈａ恒温扩增基因检测系统，Ｂｉｏ－ｒａｄＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ＋凝胶成像系统，北京市六一仪器厂ＤＹＹ－１２型电泳仪，ＨｅａｌＦｏｒｃｅ生物安全柜㊂１．２㊀方法１．２．１㊀引物的设计合成㊀按照ＬＡＭＰ引物设计原则，根据ＧｅｎＢａｎｋ数据库中的沙门氏菌特异基因组序列，进行多序列比对，寻找一段高度保守区作为扩增对象，然后通过分子生物学软件ＬＡＭＰＤｅｓｉｇｎｅｒ５设计４组引物㊂引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，采用ＨＰＬＣ纯化方式㊂合成后的引物用超纯水稀释成１００ｐｍｏｌ／Ｌ溶液，－２０ħ保存备用㊂各引物序列见表２㊂表２㊀沙门氏菌的ＬＡＭＰ检测用引物Ｔａｂ２㊀ＰｒｉｍｅｒｓｆｏｒＬＡＭＰＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａ基因引物序列（５ᶄ－３ᶄ）ｉｎｖＡＦ３ＧＡＡＣＧＴＧＴＣＧＣＧＧＡＡＧＴＣＢ３ＣＧＧＣＡＡＴＡＧＣＧＴＣＡＣＣＴＴＦＩＰＣＣＧＧＣＣＴＴＣＡＡＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＡＴＴＴＴＧＣＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＧＧＢＩＰＧＡＡＣＧＧＣＧＡＡＧＣＧＴＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＴＣＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡｈｉｌＡＦ３ＣＧＡＡＡＡＴＡＡＣＧＣＴＧＧＧＣＡＧＡＢ３ＡＴＣＧＣＣＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡＣＧＦＩＰＧＣＣＣＧＧＣＧＴＡＧＡＴＡＡＴＡＣＧＣＡＧＴＴＴＴＧＴＴＡＣＧＣＣＧＣＣＴＴＴＡＴＴＣＧＴＢＩＰＣＣＧＧＧＧＡＴＣＧＧＧＡＧＴＣＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＧＡＣＣＧＡＣＧＧＧＡＴＧＨｕｔＦ３ＧＣＧＧＡＴＡＴＴＧＣＣＧＴＧＧＡＴＢ３ＴＧＡＧＡＡＡＣＡＡＴＣＣＧＣＧＡＣＧＦＩＰＧＴＴＣＣＣＣＴＴＣＣＧＴＴＡＧＣＧＧＣＴＴＴＴＴＡＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＧＡＴＴＡＣＣＧＢＩＰＣＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＧＣＧＴＧＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＡＣＧＡＣＧＡＡＴＧＡＧＣＡＧＡＣＡｉｎｖＥＦ３ＧＣＧＡＣＣＣＡＧＣＡＴＡＣＴＧＡＴＧＢ３ＧＣＣＴＴＣＧＧＴＡＡＡＧＣＣＴＣＡＴＣＦＩＰＧＡＣＡＴＴＴＣＧＴＣＣＧＴＣＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＢＩＰＧＧＣＧＣＴＧＧＣＣＧＡＡＴＴＴＣＧＴＡＴＴＴＴＡＧＣＡＣＧＣＧＴＴＣＡＡＡＡＣＴＧＴ１．２．２㊀最优引物的筛选㊀将生工生物工程（上海）股份有限公司合成的４组引物（ｉｎｖＡ引物组㊁ｈｉｌＡ引物组㊁ｈｕｔ引物组㊁ｉｎｖＥ引物组）以沙门氏菌ＤＮＡ为模板，吸取２０μＬ反应缓冲液和１μＬＢｓｔＤＮＡ聚合酶制备预混溶液，每个反应管添加２０μＬ预混溶液，再添加５μＬ试样溶液或对照溶液，待上机，后续试验溶液配制同等，在荣研ＬＴ－１６ａｌｐｈａ恒温扩增基因检测系统上同时进行ＬＡＭＰ反应，并设空白对照，反应温度为６５ħ，反应时间为６０ｍｉｎ㊂日本荣研ＬＴ－１６ａｌｐｈａ恒温扩增基因检测系统有Ｌｅｆｔ和Ｒｉｇｈｔ两个反应槽，各反应槽有８个反应孔，其中Ｌｅｆｔ反应槽的反应孔编号为ＮＯ．１－８，Ｒｉｇｈｔ反应槽的反应孔编号为ＮＯ．９－１６，反应结束后观察扩增曲线并读取Ｔｔ（浊度上升开始时间）值和Ｄｆ（浊度上升值）值㊂１．２．３㊀ＬＡＭＰ反应条件的优化１．２．３．１㊀反应温度的优化㊀以１．２．２筛选的最优引物组作为反应温度优化的扩增引物，以沙门氏菌ＤＮＡ为模板，９５ħ酶失活２ｍｉｎ，做６组对照，分别将反应混合物放在６０ħ㊁６１ħ㊁６２ħ㊁６３ħ㊁６４ħ㊁６５ħ反应条件下进行ＬＡＭＰ反应，并设空白对照，反应结束后观察扩增曲线并读取Ｔｔ值和Ｄｆ值㊂１．２．３．２㊀反应时间的优化㊀以１．２．２筛选的最优引物组作为扩增引物，以沙门氏菌ＤＮＡ为模板，以１．２．３．１筛选的最优温度设为反应温度，９５ħ酶失活２ｍｉｎ，做４组对照，分别将反应混合物放在３０ｍｉｎ㊁４０ｍｉｎ㊁５０ｍｉｎ㊁６０ｍｉｎ反应条件下进行ＬＡＭＰ反应，并设空白对照，反应结束后观察扩增曲线并读取Ｔｔ值和Ｄｆ值㊂１．２．４㊀特异性试验㊀为了验证设计引物对沙门氏菌检测的特异性，用１．２．２反应体系和１．２．３优化后条件，以７株非沙门氏菌细菌和４株阳性对照沙门氏菌培养物提取的ＤＮＡ㊁鸡白痢及禽伤寒沙门氏菌凝集抗原ＤＮＡ㊁布氏杆菌试管凝集抗原ＤＮＡ㊁炭疽沉淀抗原ＤＮＡ为模板进行ＬＡＭＰ扩增检测，并设置空白对照，ＮＯ．２－８（ａ）依次为甲型副伤寒沙门氏菌㊁乙型副伤寒沙门氏菌㊁鼠伤寒沙门氏菌㊁鸡白痢及副伤寒沙门氏菌凝集抗原㊁肠炎沙门氏菌㊁金黄色葡萄球菌㊁痢疾志贺菌，ＮＯ．１０－１６（ｂ）依次为阪崎杆菌㊁霍乱弧菌㊁肠出血行大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７㊁致病性大肠埃希氏菌㊁布氏杆菌试管凝集抗原㊁单增李斯特菌㊁炭疽沉淀抗原，Ｌｅｆｔ反应槽的ＮＯ．１和Ｒｉｇｈｔ反应槽的ＮＯ．９均为空白对照，反应结束后观察各反应孔有无扩增曲线的出现㊂１．２．５灵敏度试验㊀３７ħ培养后的菌液，用生理盐水１０倍倍比稀释至１０－１０㊂取菌落数在３０３００之间的平板作平板计数，用该浓度级的３个平板菌落均数推算细菌浓度：菌落均数ˑ稀释倍数ˑ１０；经平板计数，沙门氏菌原菌液浓度为５ˑ１０８ＣＦＵ／ｍＬ，１０倍倍比稀释后，对系列稀释的菌液进行ＬＡＭＰ与ＰＣＲ检测，ＬＡＭＰ反应条件同上，ＰＣＲ反应条件为：９５ħ预变性５ｍｉｎ；９５ħ变性４０ｓ，５５ħ退火３０ｓ，７２ħ延伸３０ｓ，进行３０个循环；７２ħ延伸５ｍｉｎ，４ħ保存反应产物，反应结束后，取反应产物进行凝胶电泳检测，预计ＰＣＲ产物长度为１９４ｂｐ，ＬＡＭＰ反应结束后观察各反应孔有无扩增曲线的出现㊂２㊀结果与分析２．１㊀最优引物的筛选㊀反应结束后，通过观察扩增曲线并读取Ｔｔ值和Ｄｆ值㊂结果显示，ｉｎｖＡ引物组和ｈｕｔ引物组有扩增曲线，ｉｎｖＡ引物组Ｔｔ值最早，且Ｄｆ最高（图１），说明ｉｎｖＡ引物组为最优引物组㊂ｉｎｖＡ引物组Ｔｔ值和Ｄｆ值的具体数值见表３㊂ＮＯ．１－５分别为空白对照㊁ｉｎｖＥ引物组㊁ｈｉｌＡ引物组㊁ｈｕｔ引物组和ｉｎｖＡ引物组ＮＯ．１－５ｗｅｒｅｔｈｅｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｉｎｖＥｐｒｉｍｅｒｇｒｏｕｐ，ｈｉｌＡｐｒｉｍｅｒｇｒｏｕｐ，ｈｕｔｐｒｉｍｅｒｇｒｏｕｐａｎｄｉｎｖＡｐｒｉｍｅｒｇｒｏｕｐ图１㊀筛选最优引物组扩增曲线图Ｆｉｇ１㊀Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐｒｉｍｅｒｇｒｏｕｐ表３㊀ＬＡＭＰ引物筛选试验Ｔｔ值和Ｄｆ值Ｔａｂ３㊀ＴｔａｎｄＤｆｖａｌｕｅｓｏｆＬＡＭＰｐｒｉｍｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｅｓｔＮＯ扩增组Ｔｔ值／ｍｉｎＤｆ值１空白对照－－－－２ｉｎｖＥ引物组－－－－３ｈｉｌＡ引物组－－－－４Ｈｕｔ引物组２８ʒ０９２０２５５ｉｎｖＡ引物组２５ʒ５４２０９７２．２㊀ＬＡＭＰ反应条件的优化２．２．１㊀反应温度的优化㊀反应结束后，通过观察扩增曲线并读取Ｔｔ值和Ｄｆ值㊂结果显示，当反应温度为６４ħ时，引物组Ｔｔ值最早，且Ｄｆ最高，扩增效果最好，说明最优反应温度为６４ħ㊂各反应组Ｔｔ值和曲Ｄｆ值具体数值见表４㊂表４㊀ＬＡＭＰ反应温度优化试验的Ｔｔ值和Ｄｆ值Ｔａｂ４㊀ＴｔａｎｄＤｆｖａｌｕｅｓｏｆＬＡＭＰｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄＮｏ反应温度／ħＴｔ值／ｍｉｎＤｆ值１６０３２ʒ３２１４５６２６１２９ʒ０６１８３８３６２２９ʒ１８１８４９４６３２６ʒ５３２０１１５６４２５ʒ１４２１３５６６５２６ʒ４１１９９３２．２．２㊀反应时间的优化㊀反应结束后，通过观察扩增曲线并读取Ｔｔ值和Ｄｆ值㊂结果显示，当反应时间为４０ｍｉｎ时，引物组Ｔｔ值最早，且Ｄｆ最高，扩增效果最好，用时最短，因此，引物组ｉｎｖＡ扩增反应的最佳时间为４０ｍｉｎ㊂各反应组Ｔｔ值和Ｄｆ值具体数值见表５㊂２．３㊀特异性试验㊀从图２可以看出，ａ中ＮＯ．２－６反应孔有扩增曲线，其余反应孔均无扩增曲线，说明只有以沙门氏菌纯培养物㊁鸡白痢及副伤寒沙门氏菌凝集抗原提取的ＤＮＡ模板有扩增曲线出现，其他反应孔均无扩增曲线出现㊂因此，引物组表５㊀ＬＡＭＰ反应时间优化试验的Ｔｔ值和Ｄｆ值Ｔａｂ５㊀ＴｔａｎｄＤｆｖａｌｕｅｓｉｎｏｐｔｉｍａｌＬＡＭＰｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ序号反应时间／ｍｉｎＴｍ值／ｍｉｎＤｆ值１３０２４０２６ʒ４３２０５１３５０２７ʒ０６２０４４４６０２７ʒ１５１４０８ｉｎｖＡ引物组对沙门氏菌具有特异性，可用于对肠道沙门氏菌６个亚种的特异性检测㊂ＮＯ．２－８（ａ）依次为甲型副伤寒沙门氏菌㊁乙型副伤寒沙门氏菌㊁鼠伤寒沙门氏菌㊁鸡白痢及副伤寒沙门氏菌凝集抗原㊁肠炎沙门氏菌㊁金黄色葡萄球菌㊁痢疾志贺菌；ＮＯ．１０－１６（ｂ）依次为阪崎杆菌㊁霍乱弧菌㊁肠出血行大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７㊁致病性大肠埃希氏菌㊁布氏杆菌试管凝集抗原㊁单增李斯特菌㊁炭疽沉淀抗原；ＮＯ．１和ＮＯ．９均为空白对照ＮＯ．２－８（ａ）ｗｅｒｅＰａｒａｔｙｐｈｏｉｄｓａｌｍｏｎｅｌｌａａ，Ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄｓａｌｍｏｎｅｌｌａｂ，Ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄｓａｌｍｏｎｅｌｌａｍｕｒｉｎｅ，ＰｕｌｌｏｒｕｍｇａｌｌｉｎａｅａｎｄＰａｒａｔｙｐｈｏｉｄｓａｌｍｏｎｅｌｌａａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔｉｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ＮＯ．１０－１６（ｂ）ｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｌｙＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｓａｋａｚａｋｉｉ，Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ，Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７，ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＥ．ｃｏｌｉ，Ｂｒｕｃｅｌｌａｉｎｖｉｔｒｏａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ，Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄＡｎｔｈｒａｘｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ，ＮＯ．１ａｎｄＮＯ．９ｗｅｒｅｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｓ图２㊀特异性实验的扩增曲线图Ｆｉｇ２㊀Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ２．４㊀灵敏度试验㊀ＬＡＭＰ检测扩增曲线结果见表６，ＬＡＰＭ灵敏度试验检测结果见图３，ＰＣＲ检测结果见图４㊂结果表明，ＰＣＲ法检测限为１０２ＣＦＵ／ｍＬ，ＬＡＭＰ检测限为１０，其检测灵敏度是ＰＣＲ方法的１０倍，说明ＬＡＭＰ检测方法的灵敏度优于ＰＣＲ法㊂表６㊀灵敏度试验的ＬＡＭＰ检测结果Ｔａｂ６㊀ＬＡＭＰｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔＮｏ反应组／（ＣＦＵ㊃ｍＬ－１）Ｔｔ值／ｍｉｎＤｆ值１空白对照２１０７２４ʒ１３２１３４３１０６２４ʒ０７２１３２４１０５２４ʒ１２２３０９５１０４２４ʒ２８２３２４６１０３２４ʒ５０２２３６７１０２２４ʒ５１２２００８１０１２３ʒ３３２２３９９１０－１图３㊀ＬＡＰＭ灵敏度试验检测结果电泳图Ｆｉｇ３㊀ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＬＡＰＭｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ１－８分别为１０７１０１ＣＦＵ／ｍＬ菌液和空白对照图４㊀灵敏度试验ＰＣＲ检测电泳图Ｆｉｇ４㊀ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ３㊀讨论与结论沙门氏菌病为人兽共患病，沙门氏菌即可引起多种动物感染，同时作为一种重要的食源性致病菌也可引起人类多种疾病㊂沙门氏菌在人类和动物上引起的疾病主要临床症状表现为败血症和肠炎引起的腹泻，其临床表现与其它细菌㊁病毒引起的疾病症状非常相似，难以鉴别㊂随着人们对食品安全问题的重视程度日渐增高和基层兽医㊁一线口岸对快速检测㊁快速通关的要求，传统检测沙门氏菌耗时长㊁过程复杂，难以满足快速检测的要求㊂所以，有必要建立一种能快速㊁准确㊁简便㊁费用低廉的检测沙门氏菌的方法㊂而ＬＡＭＰ技术在特异性㊁灵敏度㊁反应时间㊁反应设备等方面占据明显优势，已被应用于细菌㊁病毒等的检测㊂ＬＡＭＰ技术优点突出，不需要模板热变性㊁长时间温度循环㊁繁琐的电泳等过程，效率高，观察结果方便多样，非常适合基层和口岸一线工作人员大规模样品的快速检测㊂相关研究表明，沙门氏菌ｉｎｖＡ基因具有属特异性，常被用作检测沙门氏菌的靶向基因［９］㊂本实验通过对沙门氏菌ｉｎｖＡ特异性基因设计内外侧４条引物，通过对反应条件的优化，建立了肠道沙门氏菌６个亚种的ＬＡＭＰ快速检测方法，方法灵敏度可达到１０１ＣＦＵ／ｍＬ（细菌浓度），其灵敏度比普通ＰＣＲ高１０倍且反应结果易于观察㊂ＬＡＭＰ扩增产物进行凝胶电泳分析容易发生气溶胶污染，添加指示剂增加试验复杂程度，且观察容易出现误判㊂本试验利用ＬＡＭＰ等温实时浊度仪，通过测定扩增基因时出现的副产物焦磷酸镁的混浊度来判断是否存在目标基因㊂本方法通过仪器读取浊度吸光值，观察有无扩增曲线直接定性判定沙门氏菌检测阴阳性，方法操作方便快捷，灵敏度高，特异性强，恒温条件下实现快速检测，同时也避免了气溶胶对实验室的污染，特别适用于基层兽医㊁食品及口岸一线部门检测使用，对动物沙门氏菌及食品安全进行快速筛查具有重要意义㊂参考文献：［１］㊀ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｉｇａｎｉｚａｔｉｏｎＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇＣｅｎｔｒｅｆｏｒＲｅｆｅｒｅｎｃｅａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＳａｌｍｏｎｅｌｌａ．ＡｎｔｉｇｅｎｉｃｆｏｒｍｕｌａｅｏｆｔｈｅＳａｌｍｏｎｅｌｌａｓｅｒｏｖａｒｓ．９ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ．Ｐａｒｉｓ：ＩｎｓｔｉｔｕｔｅＰａｓｔｅｕｒ，２００７：６［Ｍ／ＯＬ］．［２０１９－０３－１５］．ｈｔｔｐｓ：ʊｗｗｗ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｓａｎｔｅ／ｃｌｒｅ／ｃａｄｒｅｃｎｒ／ｓａｌｍｏｍｓ－ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．［２］㊀ＯｇｉｌｖｉｅＴＨ．ＴｈｅｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍｆｒｏｍｔｈｅｍａｍｍａｒｙｇｌａｎｄｏｆａｄａｉｒｙｃｏｗ［Ｊ］．ＴｈｅＣａｎａｄｉａｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＪｏｕｒｎａｌ，１９８６，２７（９）：３２９．［３］㊀王燕，刘会杰，马弘财，等．西藏拉萨市鸡源沙门氏菌分子生物学鉴定与血清分型［Ｊ］．中国动物检疫，２０１９，３６（２）：６３－６７．ＷａｎｇＹ，ＬｉｕＨＪ，ＭａＨＣ，ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇｏｆｃｈｉｃｋｅｎＳａｌｍｏｎｅｌｌａｉｎＬｈａｓａＣｉｔｙｏｆＴｉｂｅｔ［Ｊ］．ＣｈｉｎａＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎ，２０１９，３６（２）：６３－６７．［４］㊀ＣｈｏＹＩ，ＨａｎＪＩ，ＷａｎｇＣ，ｅｔａｌ．Ｃａｓｅｃｏｎｔｒｏｌｓｔｕｄｙｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏ⁃ｌｏｇｉｃａｌｅｔｉｏｌｏｇｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃａｌｆｄｉａｒｒｈｅａ［Ｊ］．ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１６６（３／４）：３７５－３８５．［５］㊀ＯｆｆｉｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｄｅｓＥｐｉｚｏｏｔｉｅｓ．Ｍａｎｕａｌｏｆｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｔｅｓｔｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓｆｏｒｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌａｎｉｍａｌｓ．Ｐａｒｉｓ：ＯｆｆｉｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｄｅｓＥｐｉｚｏｏｔｉｅｓ，２０１６：１－３［Ｍ／ＯＬ］．［２０１９－０３－１５］．ｈｔｔｐ：ʊｗｗｗ．ｏｉｅ．ｉｎｔ／ｆｉｌｅａｄｍｉｎ／Ｈｏｍｅ／ｅｎｇ／Ｈｅａｌｔｈ＿ｓｔａｎｄａｒｄｓ．［６］㊀国家食品药品监督管理总局，国家卫生和计划生育委员会．ＧＢ４７８９．４－２０１６食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２０１６－１２－２３．ＣｈｉｎａＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＮａｔｉｏｎａｌＨｅａｌｔｈａｎｄＦａｍｉｌｙＰｌａｎｎｉｎｇＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｆＰＲＣ．ＧＢ４７８９．４－２０１６Ｎａｔｉｏｎａｌｆｏｏｄｓａｆｅｔｙｓｔａｎｄａｒｄ－ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ［Ｓ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＳｔａｎｄａｒｄｓＰｒｅｓｓｏｆＣｈｉｎａ，２０１６－１２－２３．［７］㊀赵春阳，江强世，刘畅，等．沙门氏菌检测方法研究进展［Ｊ］．中国奶牛，２０１８（１０）：２７－３１．ＺｈａｏＣＹ，ＪｉａｎｇＱＳ，ＬｉｕＣ，ｅｔａｌ．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａ［Ｊ］．ＣｈｉｎａＤａｉｒｙＣａｔｔｌｅ，２０１８（１０）：２７－３１．［８］㊀刘业兵，王强．恒温扩增技术在动物疫病病原检测中应用现状及展望［Ｊ］．中国兽药杂志，２０１０，４４（１０）：９－１３．ＬｉｕＹＢ，ＷａｎｇＱ．Ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｕｓａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｓｏｆｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｓｏｆａｎｉｍａｌｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＤｒｕｇ，２０１０，４４（１０）：９－１３．［９］㊀高志强，汪琳，张灿，等．沙门氏菌ＬＡＭＰ可视化检测方法的建立［Ｊ］．中国动物检疫，２０１９，３６（２）：６８－７２．ＧａｏＺＱ，ＷａｎｇＬ，ＺｈａｎｇＣ，ｅｔａｌ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｖｉｓｕａｌＬＡＭＰｔｅｓｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒＳａｍｏｎｅｌｌａ［Ｊ］．ＣｈｉｎａＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎ，２０１９，３６（２）：６８－７２．（编辑：李文平）。

原位荧光LAMP技术检测食源性沙门氏菌

2009年第35卷第3期(总第255期)137　原位荧光LAMP 技术检测食源性沙门氏菌3叶宇鑫,李琳,山崎伸二,石磊(华南理工大学轻工与食品学院,广东广州,510640)摘　要　以沙门氏杆菌为研究对象,探讨了将原位荧光L AMP 技术应用于检测沙门氏菌所需要的具体实验方法与数据,并成功将原位荧光L AMP 技术应用于检测人工污染的食品中的沙门氏菌。

实验选取invA 基因作为靶序列设计了2对引物。

结果证明,与传统沙门氏菌检测方法和PCR 方法相比,原位荧光L AMP 无需破碎细胞提DNA ,反应方便易行,耗时少;反应条件恒定温和,能够减少细胞损伤;单基因检测水平证明反应的高灵敏度;良好的基因定位以及清晰的背景条件使反应结果更加直观,易于观察。

关键词　原位荧光L AMP ,沙门氏菌,检测第一作者:硕士研究生(石磊教授为通讯作者)。

　3国家自然科学基金项目(20877028)收稿日期:2008-11-05,改回日期:2008-12-10 食品安全是各国都关注的重大问题,食源性致病菌是影响食品安全的主要原因之一,检测食源性致病菌是食源性疾病预防与控制的关键环节[1]。

沙门氏菌是肠杆菌科中的一个重要菌属,是人和动物的常见病原菌,可引起人类多种疾病,如食物中毒、胃肠炎、菌血症、肠热症等。

据统计,目前世界上85%的食物中毒是由沙门氏菌引起的[2]。

虽然传统的沙门氏菌检测方法本身证明是可靠的,但却很费力、耗时,需要4～7d 才能完成,已不能达到令人满意的效果[3]。

目前,PCR 是应用的比较广泛的快速检测法。

然而,PCR 虽然能扩增各种标本的DNA ,但扩增的DNA 或RNA 产物不能在组织细胞中定位,这是该技术一个局限性。

原位杂交虽然具有良好的定位能力,但由于其敏感性问题,尚不能检测出细胞内的单拷贝基因[6,7]。

原位PCR (In Sit u PCR )结合了原位杂交和PCR 技术,可使扩增的特定DNA 片段在分离细胞和组织切片中定位,从而弥补PCR 和原位杂交的不足。

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