食品中沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

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加环引物LAMP法快速检测沙门氏菌方法的研究

引言
沙门氏菌属（ａｏｅａＳｌｎｌ）ｍｌ是肠杆菌科的一类革兰氏阴性肠道杆菌，是一种重要的人兽共患病病原茵，可引起
伤寒、肠炎等多种疾病．肉、蛋、奶等畜产品中含有多种营养成分，适合沙门氏菌的生长，是该菌的主要传播媒介．在我国细菌性食物中毒中，７．０有０８％是由沙门氏菌引起的，而在引起沙门氏茵中毒的食品中，肉、蛋、奶等
氏菌的ｉａ因为靶基因，选择ＰＲ的特异性引物，并基于该基因设计出ＬＭＰ反应的引物；究对ＬＰ体系的ｎ基ｖＣＡ该研ＭＡ反应温度、ＮＴｄＰ浓度和镁离子浓度等扩增条件也进行了优化，并检测了ＰＲ和ＬＰ的引物特异性，比较了ＰＲ法、ＣＭＡＣＬＰ法和加环引物的ＬＰ法的灵敏度．结果表明：ＰＲ法检测的灵敏度为２２ｘ０ｃ／，未加环引物的ＬＭＰＭＡＭＡ普通Ｃ．８ｌｆｍｌｕＡ
Hale Waihona Puke 物（Ｆ和Ｌ）有助于该法提高扩增效率．ＬＢ，虽然环引物和内引物都作用于环结构上，但是环引物所杂交的ＬＭＰＡ形成的环结构是内引物杂交的环结构以外位置，它们的扩增机制并不相同．目Ｊ前，对环引物在进行ＬＭＰＡ反应
中所起的作用的研究较少．本次试验在ＬＭＡＰ反应中加入环引物，并分别与普通ＬＭ和ＰＲ进行比较，ＡＰＣ研究加入环引物对ＬＭ法检测沙门氏菌检测的影响，ＡＰ从而建立一套高效的快速检测沙门氏菌的方法．
１材料与方法
１材料与试剂．１
ＬＭＰ反应试剂：ｓＤＡｐｙｒｅａｅｒｇｅｔ自ＮｗＥｇｎｉｌ公司；ＡＢｔＮｏｍｅｓｌｇａｍｎ购ｌａｒｆｅｎｌｄｏｂａＢａ甜菜碱（ｅｉ）自北Ｂｔｎ￣ａｅｌ

肠炎沙门菌LAMP检测方法的建立

肠炎沙门菌LAMP检测方法的建立邓显文;谢芝勋;谢丽基;谢志勤;刘加波;庞耀珊;彭宜;范晴【摘要】为建立一种能快速检测肠炎沙门菌(SE)的方法,本研究根据基因库中SE种特异性基因(sdfⅠ)的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了SE的LAMP可视化检测方法.该方法的敏感性可达100 fg DNA,高于常规PCR方法100倍；全部反应可在1h内完成；可通过肉眼观察颜色直接判定结果；对其他常见病原体的检测结果均为阴性.结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于SE感染的快速检测.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)005【总页数】4页(P27-30)【关键词】肠炎沙门菌;环介导等温扩增;检测【作者】邓显文;谢芝勋;谢丽基;谢志勤;刘加波;庞耀珊;彭宜;范晴【作者单位】广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001【正文语种】中文【中图分类】S852.612肠炎沙门菌是目前引起人类食物中毒的主要病原之一，其感染主要是因食用了被肠炎沙门菌污染的动物性食品，尤其是家禽的肉蛋食品，近年来，肠炎沙门菌食物中毒和动物感染肠炎沙门菌十分严重，已引起养殖业和公共卫生界的高度重视［1－4］。

目前应用PCR技术对SE的检测已有报道［5－9］，PCR检测方法虽然快速、敏感性较高，但是需要使用昂贵的仪器和试剂等，环介导等温扩增（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型核酸扩增技术，该技术具有简捷、成本低廉和结果可视化等优点，目前在一些病原微生物的检测中被广泛应用［10－11］。

加环引物LAMP法快速检测沙门氏菌方法的研究

加环引物LAMP法快速检测沙门氏菌方法的研究李雪;唐善虎;郝小倩;岑璐伽【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(038)001【摘要】探讨了加环引物对LAMP的影响,并与普通PCR法进行了比较,建立一套快速检测沙门氏菌的新方法.以沙门氏茵的inva基因为靶基因,选择PCR的特异性引物,并基于该基因设计出LAMP反应的引物；该研究对LAMP体系的反应温度、dNTP浓度和镁离子浓度等扩增条件也进行了优化,并检测了PCR和LAMP的引物特异性,比较了PCR法、LAMP法和加环引物的LAMP法的灵敏度.结果表明:普通PCR法检测的灵敏度为2.28×103cfu/ml,未加环引物的LAMP法的灵敏度为2.28×101cfu/ml,加环引物的LAMP法的灵敏度为2.28×100cfu/ml.通过三种方法的比较可知:LAMP法检测沙门氏菌比PCR法更加快速、灵敏,而加环引物可进一步提高LAMP的扩增效率.本研究为快速检测沙门氏菌方法的构建奠定了基础,并认为LAMP在检测微生物方面有着广泛的发展前景.【总页数】5页(P64-68)【作者】李雪;唐善虎;郝小倩;岑璐伽【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041【正文语种】中文【中图分类】TS201.3【相关文献】1.PMA-LAMP法对克氏螯虾样品中沙门氏菌的快速检测 [J], 张毅;胡定金;付云洁;魏辉2.加环引物LAMP法快速检测布鲁氏杆菌方法的研究 [J], 郭恋;蒙晓雷;李秀梅;李颖;杨爱华;王健春;赵静3.使用环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测鸡蛋中的沙门氏菌 [J], 李雪;唐善虎;郝小倩;岑璐伽4.沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立 [J], 郭澍强;贺生芳;郝俊虎;谈静慧;杨旭光;李婧5.牛奶中活沙门氏菌BCAC-EMA-Rti-LAMP快速检测方法的研究 [J], 张天添; 陈鹄; 吴国平; 舒梅; 林丽萍; 钟婵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

使用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测鸡蛋中的沙门氏菌

主要是由于外部原因引起的，了减少沙门氏菌污染，为建议企业做好蛋壳的消毒工作，强生产、存、加储运输和销售过程的管理。关键词：鸡蛋内容物；蛋壳；ＡＰ；Ｃ国标法ＬＭＰＲ；
中图分类号：３８３ｇｈｌｈｒｆｒ，ｅｔｒａａｓｓｏａｍｏｅｌｎｅｇｓｒｃｓｗｒｈｉａｓｒａｍｏｅｌｏｈｇｓｅ１ａ．ＴｅｅｏｅｘｅｎｌｃｕｅｒＳｌｎｌｏｇｕａｅｅｅｔｅｍａｎｃｕｅｆａｆｏ
试验结果表明：ＡＬＭＰ和ＰＲ的沙门氏菌检出率均高于国标法，ＬＭＣ而ＡＰ法敏感性、特异性和符合率也均高于ＰＲ法，Ｃ因此，ＡＬＭＰ是一种快速、敏感和高度特异性的沙门氏菌检测方法，得推广。本研究中还发现，蛋值在鸡内容物检出沙门氏菌的鸡蛋样品中，大约有７％的鸡蛋在蛋壳上都能检出沙门氏菌。因此，门氏菌污染鸡蛋０沙
ＲａｉｔｃｉｎｏｌｎｌｎＥｇｓＵｓｎｏｐｐｄＤｅｅｔｆＳａｍｏｅｌｉｇｉｇＬｏ－ｍｅｉｔｄＩｏｈｒｌｏａｄａｅｓｔｅｍａ
Ａｍｐｉｃｔｎ（ＡＭ）ｌｉａｉＬＰｆｏ
Ｌｕ，ＡＮｈｎｈＨＯＸａ— ｉ，ＥｕｊＩｅＴＧＳａ－ｕ，ＡｉｑａＣＮＬ —ｉＸｏｎａ
ＬＡＭＰａｄＰｔｏｓＲｅｕｔｓｏｄｔａＡＭＰａｄＰｒＳｌｎｌｅｅｔｎｈｄｈｇｅｏｉｖａｅｎＣＲｍｅｈｄ．ｓｌｈｗｅｈｔＬｓｎＣＲｆａｍｏｅｌｄｔｃｉａｉｈｒｐｓｔｅｒｔｓｏａｏｉ

3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立

3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立摘要建立了3类食品中沙门氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。

选取invA基因作为靶序列设计1对引物,在沙门氏菌中能扩增出198 bp的预期片段,而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的沙门氏菌种特异性。

通过对沙门氏菌标准菌种纯培养液PCR方法灵敏性的检测,发现纯培养的检测极限为72个细菌。

用该方法对3类共计56份食品样品进行检测,检测结果与传统分离鉴定方法完全相符,表明该方法适用于食品中沙门氏菌的快速检测。

关键词食品;沙门氏菌;PCR快速检测方法;建立沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。

该菌广泛分布于自然界,目前全世界已经发现2 523个血清型,我国发现的血清型近300个。

许多血清型的沙门氏菌都能产生毒素,以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最为常见[1]。

常见的肉类食品和奶蛋类食品都会被沙门氏菌污染,在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2位[2-3]。

有资料显示,我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的[4]。

另外,每年出口的食品由于沙门氏菌污染而造成退货或索赔,以及食品加工厂由于沙门氏菌污染,经常导致重大的经济损失。

因此,对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性。

为有效地预防和控制疾病的发生,同时满足食品出口业日益发展的需要,建立快速、敏感而又特异的检测沙门氏菌的方法是非常必要的。

随着分子细菌学研究的开展,人们对细菌的毒素、侵袭素与毒力岛等毒力因子的认识不断深入,使细菌检测从表型特征鉴定逐渐向遗传特征的鉴定,而PCR技术是近年来发展起来的一种体外扩增特异性DNA片段的技术,具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点[5-7],因而从20世纪90年代以来开始尝试利用该技术来检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌。

PCR检测方法的特异性与灵敏度主要取决于相应检测靶点的选择,本研究选取invA基因作为靶序列设计1对引物,成功地建立了沙门氏菌的PCR快速检测方法。

沙门菌invA基因LAMP快速检测法的建立和初步应用

[作者简介]　王敏雅(1980-),女,学士,技师,主要从事微生物检验工作。

【论著】沙门菌inv A基因LAMP快速检测法的建立和初步应用王敏雅1,徐明汉2,潘宏伟3,王志刚4(11浙江省台州市路桥区疾病预防控制中心,浙江台州　318050;21浙江省温州医学院,浙江温州　325035;31浙江省台州医院,浙江临海　317000;41浙江省疾病预防控制中心,杭州　310009)[摘要]　目的:建立适合基层检验部门使用的快速检测沙门菌LAMP法。

方法:在65℃普通恒温水浴中、60m in扩增沙门菌inv A基因片段,目测或电泳快速检测沙门菌。

分别对环介导等温扩增(LAMP)反应影响较大的温度、Betaine浓度等进行优化,并对实验室保存的28种沙门菌不同血清型共34株和其他9种肠杆菌科细菌进行检测;对部分沙门菌进行污染血清直接LAMP模拟检测。

结果:28种不同血清型的沙门菌LAMP检测都呈阳性,其它9种肠杆菌科细菌均为阴性;血清模拟实验与菌株直接DNA提取LAMP检测结果一致。

结论:LAMP法能够快速、特异地检测沙门菌,且不需要昂贵的仪器,适合基层检验部门使用。

[关键词]　沙门菌;LAM P法;inv A基因;快速测定[中图分类号]　R37812+2 [文献标识码]　A [文章编号]　1004-8685(2008)10-1971-04Est ablishm en t and preli m i n ary appli ca ti on of LA M P i n vA gene a ss ay for rap i d detecti on of Sa l m onellaW ang M in2ya1,Xu M ing2han2,Pan Hong2w ei3,W ang Zhi2gang4(11Luqiao Center for D isease Contr ol and Preventi on,Taizhou318050,China;21W enzhou Medical College,W enzhou325035, China;31Taizhou Hos p ital of Zhejiang Pr ovince,L inhai317000,China;41Zhejiang Center f or D isease Contr ol and Preventi on, Hangzhou310009,China)[Abstract]　O bjecti ve:To establish a method of l oop-mediated is other mal a mp lificati on(LAM P)for the rap id detecti on of Sal m onella in basic clinical and ep ide m il ogicl laborat ory1M ethods:Op ti m izing the te mperature and Betaine concentrati on which are sensitive for the LAMP1Esti m ating by eyeball or electr ophoresis the a mp lificati on characteristics of the sal m onella inv A gene seg ment in ther mostatic water-bath under65℃and60m in1The34strains of28ser otypes of Sal m onella and9other kinds of en2 terbacteria were tested1Some hu man seru m s experi m entally infected by Sal m onella were directly a mp lified by LAMP method1Results:A ll LA MP reacti ons of28ser oty pes of sal m onella were positive,and others are negative1The results of the infected seru m directly a mp lified by LAMP were consisted with the results of co mmon strain test1Conclusi on:This LAMP-based assay is rap id and s pecific,and no ex pensive apparatus is needed1Theref ore,it is es pecially suitable f or basic clinical and ep ide m il ogicl lab1 [Key words]　Sal m onella;LAM P Test;inv A gene;Quick deter m inati on 沙门菌是引起伤寒和食物中毒等疾病的主要致病菌,在美国每年大约有80～400万人因沙门菌而染上疾病,数百人死亡[1,2],在世界各地的食物中毒中,沙门菌引起的中毒病例占首位或第二位[3]。

食品中沙门氏菌的快速检验方法

86·FOOD INDUSTRY分析检测　陈文财惠州市食品药品检验所食品中沙门氏菌的快速检验方法泛用于遗传病诊断和微生物检验中。

（我个人认为沙门不会用）荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检验法基于沙门氏菌ｆｉｍＹ基因序列，进行引物和探针的设计，利用基因重组技术对检测的定量标准品进行构建，可借助荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ法对沙门氏菌进行检测。

该方法操作简单、检验快速、适用范围广，在临床诊断、商品检验、食品卫生监管等领域均有运用。

多重ＰＣＲ快速检验法多重ＰＣＲ快速检验法基于质粒毒力基因ｓｐｖＣ、１６Ｓ　ｒＲＮＡ、ｆｉｍＡ、致病基因ｉｎｖＢ序列设计引物，多重ＰＣＲ检测沙门氏菌株基因组ＤＮＡ，以此实现对沙门氏菌的快速检验。

多重ＰＣＲ快速检验法可对沙门氏菌的多种毒力因子进行鉴定，是沙门氏菌株检验和鉴定的新方法。

变性高效液相色谱检测法　变性高效液相色谱结合多重ＰＣＲ反应技术可对食品中的沙门氏菌进行快速检测。

该方法以ｆｉｍＹ基因为靶基因，选择引物可实现对多重ＰＣＲ体系的优化，由此可对沙门氏菌进行快速鉴别。

该方法的特异性、灵敏性较高，其扩增产物为２８４ｂｐ，可对沙门氏菌进行快速检验，并能进一步验证多重ＰＣＲ的特异性。

沙门氏菌是食物常见的病原菌，具有传播媒介多、途径繁复等特点，容易污染食品而危害人体健康。

另外，沙门氏菌是多种有紧密联系细菌的泛指，包括导致伤寒、胃肠及引起食物中毒的众多细菌。

文中提到的几种快速检验法与传统检验法相比，具有操作简单、特异性强、灵敏度高等特点。

但这些方法也存在各自缺陷，试纸快速检验法检验纯菌时，若目菌＞１０３ｃｆｕ／ｍｌ时，纸片菌斑密集，可导致假阴性反应的发生。

ＰＣＲ检验的特异型取决于所选扩增的靶序列，若为保守的特异片段，所选引物就会显示出特异型。

ＬＡＭＰ技术的产物复杂多样，引物设计要求较高，目标单链ＤＮＡ的分离困难，无法对扩增产物的序列进行分析；其在同一温度条件下采用多条引物扩增非特异性条带，可能会出现假阳性结果。

LAMP在食品卫生沙门菌检验中的应用价值

LAMP在食品卫生沙门菌检验中的应用价值分离培养法是国内食品沙门菌检测的常用方法, 其操作流程繁琐, 且需耗费大量的时间。

同时, 针对免疫学方法, 其敏感度不高, 针对聚合酶连反应法, 其需特殊仪器和设备, 导致检测受到限制[1]。

环介导等温扩增技术, 即LAMP,其属于新型等温核酸扩增方法, 操作方式简单、敏感度高等是其主要优点〔2〕。

因此, 为研究LAMP在食品卫生沙门菌检验中的应用价值, 本研究以84件食品样本为对象, 采用2种不同的检测方法, 取得了一定成效, 现将相关报道如下。

1 一般资料与方法1.1一般资料选取2015年3~12月收集的食品样本84件, 其中, 包括20件生鲜肉、巧件熟肉制品、18件生水产品、17件非发酵豆制品、4件冷冻生肉、4件生食类蔬菜和6件鲜榨果汁。

以肠炎沙门菌为参考菌株。

1.2方法1.2.1食品样本前增菌以《食品微生物学检验沙门氏菌检验》为依据, 分别选取25g食品标本, 将其添加至225mlBPw无菌质袋内, 利用拍击式均质器, 进行1~2min的拍打, 基于37°c下, 8~18h为培养时间。

针对冷冻产品, 应以低于45°C为基础条件, 解冻时间不得超过15min.1.2.2LAMP检测方法分别取食品标本前增菌液lml,基于10000r/min指标下, 进行2min的离心, 除去上清液后, 借助核酸通用提取试剂盒, 提取核酸。

与此同时, 取μl上清液, 用于制作待检模板DNA.以食品微生物学检验沙门氏菌检验冲指导, 设计引物, 并检测食品标本增菌液DNA,且以标准的反应体系为指标。

以65°C为条件, 进行60min的水浴, 基于80°C灭活酶前提下, 促使反应体系得以终止。

待结束反应后, 通过肉眼检测, 若表现出混浊现象, 则为阳性, 若不存在混浊现象, 则为阴性。

1.2.3分离培养鉴定基于《食品微生物学检验沙门氏菌检验》指导下, 在轻轻晃动经培养过的食品标本前增菌液后, 以1ml为标准, 将其放置于10mlTTB增菌液中, 以42°C为标准, 18~24h为培养时间。

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２ＣｌｇｆｅｒａｄｃｅｏｔＣｉａｇｉｌｒｌｎｖｒｉ，Ｇｕｎｚｏ１６２ｈｎ）．ｏｌｅＶｔｉｒＭｅｉｎ，ＳｕｈｈｎＡｒｕｔａＵｉｅｓｅｏｅｎｙｉｃｕｙｔａｇｈｕ５０４，Ｃｉａ
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ｓｉｅｌｏ — ｄａｄｉｔｅｍａａｌｃｔｎ（ＡＭＰｍｅｈｄａｓｙｆｒｈｏ－ｏｎａｏｅａｍｏｅｌｅｃｏｉｖｐｍｅｉｔｏｈｒｌｍｐｉａｉＬｔｏｅｓｉｆｏ）ｔｏｓａｅｆｄｂｒｅｐｔｇｎＳｌｎｌｄｔｔｎｏｔｏｈａｅｉ
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扩增，同时建立沙门氏菌人工污染的食品模型，比较了ＬＭＰ法与活菌计数检测的敏感性．结果表明，该方法仅对Ａ沙门氏菌产生特异性扩增，灵敏度高迭３６～３ｍＬ，食品样品经细菌富集培养后，检测灵敏度高达８５ ‘ ．．所建立的２
检测沙门氏菌方法具有较高的特异性与灵敏性，操作简单、快速，可用于沙门氏茵污染食品的快速检测．关键词：沙门氏菌；侵袭性因子Ａ；环介导等温扩增技术中图分类号：Ｒ１５５５．文献标志码：Ａ文章编号：０９ — １７２１）５０６—５４３２３（０２０．４８０
ａｉｃａｌｏｔｍｉａｅｏｓｃｎｔｕｔｄｔｖｌａｅｔｅｓｎｉｖｔｆＬｔｉｒｆｉｌｃｎａｎｔｄｆｄｗａｏｓｒｃｅｏｅａｕｔｈｅｓｔｉｏＡＭＰａｓｙａｄｂｃｅｉｌｃｌｃｕｔｇｙｏｉｙｓａｎａｔｒａｅｌｏｎｉｎ
ｎｌｅｌ７ｓｒｉｓｏｎｍｏｅ￣ａｄ４ｎｎＳｌｎｌｂｃｅｉｒｅｅｔｄｂＡＭＰ。ａｄｍｅｎｉｈｏｅｏｄ．ｔａｎｆＳｌｎｌｎｏ．ｎｍｏｅ￣ａｔｒａｗｅｅｄｔｃｅｙＬｎａｗｈｌｔｅｍｄｆｅ
（．天津大学化工学院，天津３０７；２华南农业大学动物医学院，广州５０４）１００２．１６２
摘要：食品及其原料中沙门氏茵的快速、现场检测对食品安全控制具有重要意义．根据沙门氏菌ｉｖ基因核苷ｎＡ
酸序列设计一组引物，应用环介导等温扩增技术（ＡＭＰ，分别对７种不同血清型沙门氏茵和４种非沙门氏菌进行Ｌ）
Ｄｅｅｏｍｅｔｆｏ — ｅｉｔｓｔｅｍａｖｌｐｎｏＬｏｐＭｄａｅＩｏｈｒｌＡｍｐｉｃｔｎＡｓａｏｌａｉｓｙｆｒｉｆｏＳａｍｏｅｌｔｃｉｎｉｏｌｎｌＤｅｅｔｏＦｏｄａｎ
勋ｏｅｌａｔｒ１ｔｉｓｓｂｔｄｎｇｔｅｒａｔｎ．ｅｓｉｉｆＡＭＰａｓｙｆｒｕｅｃｌｃｌｒｆａｍｏｎｌｂｃｅｉｒｎｕｍｉｅｅａｉｅｃｉｓＳｎｉｖｔｏａａｓａｔｖｏｔｙＬｓａｒｅｌｕｔｅｏｌ — ｏｐｕＳ
第４５卷
第５期
天
津
大
学
学
报
Ｖｂ＿５ＮＯ５Ｉ４．
Ｍａ２２ｖ０１
２１０２年５月
ＪｕｎｌｆｉｎｉｎｖｒｉｏｒａｏａｊＵｉｅｓｙＴｎｔ
食品中沙门氏菌ＬＭＰ快速检测方法的建立Ａ
黄金海，孙跃辉，陈瑞，庄世文，刘莹，王静思