第七章 核酸提取与鉴定
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取核酸（DNA 或 RNA）的基本原理和方法。
2、学习使用各种试剂和仪器进行核酸提取的操作步骤。
3、了解核酸鉴定的常用方法及其原理。
4、培养实验操作技能和科学研究的严谨态度。
二、实验原理核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是生物体遗传信息的携带者。
核酸提取的基本原理是利用细胞裂解液将细胞破碎，使核酸释放出来，然后通过一系列的物理和化学方法将核酸与其他细胞成分分离，最后得到纯度较高的核酸样品。
DNA 提取常用的方法有酚氯仿抽提法、盐析法等。
酚氯仿抽提法是利用酚和氯仿的混合液去除蛋白质，然后通过乙醇沉淀得到 DNA。
盐析法是利用高浓度的盐使蛋白质变性沉淀，从而分离出 DNA。
RNA 提取常用的方法有异硫氰酸胍法、Trizol 法等。
Trizol 法是基于异硫氰酸胍和酚的作用，能够有效地裂解细胞并抑制 RNA 酶的活性，从而提取出完整的 RNA。
核酸鉴定的方法主要有紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法等。
紫外分光光度法通过测定核酸在 260nm 和 280nm 处的吸光度值（A260 和 A280）来评估核酸的纯度和浓度。
A260/A280 的比值在 18 20 之间表示 DNA 纯度较高，在 19 21 之间表示 RNA 纯度较高。
琼脂糖凝胶电泳法则是根据核酸分子在电场中的迁移率不同来分离和鉴定核酸，DNA 分子在琼脂糖凝胶中迁移距离与分子量大小成反比，RNA 通常会呈现出 28S、18S 和 5S 三条带。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉等）或培养的细胞。
大肠杆菌菌液。
2、实验试剂细胞裂解液（含蛋白酶 K）。
酚氯仿混合液（酚：氯仿＝ 1:1）。
无水乙醇、75%乙醇。
3M 醋酸钠（pH 52）。
Trizol 试剂。
异丙醇。
RNA 酶抑制剂。
琼脂糖。
50×TAE 电泳缓冲液。
核酸染料（如 EB 或 GelRed）。
实验九动物组织中核酸的提取和鉴定
实验七动物组织中核酸的提取和鉴定【原理】动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。
核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。
先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。
核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。
有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。
此三类化合物可用下列方法鉴定之。
1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。
还原成兰色的钼兰。
常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。
H3PO4＋12H2MoO4→H3PO4·12MoO3 + 12H2OH3PO4·12MoO3H3PO4·6MoO3·3Mo2O52、嘌呤碱：能与苦味酸作用形成针状结晶3、戊糖：(1)核糖：经与强酸(盐酸与硫酸)共热生成糠醛，后者可与3;5二羟甲基苯缩合成绿色化合物。
(2)脱氧核糖：在强酸中加热，可生成ω—羟基γ—酮基戊醛，后者再与二苯胺作用生成一蓝色化合物。
上述二反应如下【操作】(一)核酸提取l、用酚提取法：（1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。
（2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。
（3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。
（4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。
2、用三氯醋酸提取法（1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。
核酸提取鉴定实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的和要求1. 学习并掌握肝组织中DNA的提取原理和方法。
2. 熟悉DNA分离纯化的原理和技术。
3. 掌握DNA定量技术，评估提取DNA的浓度和纯度。
4. 通过实验验证DNA提取和鉴定方法的可行性。
二、实验基本原理肝组织中的DNA主要以核蛋白的形式存在，通过特定的化学和物理方法可以将其从细胞中分离出来。
实验中，我们采用氯化钠溶液和SDS等试剂来溶解和分离核蛋白，随后利用氯仿和异戊醇将蛋白质沉淀，最终通过冷乙醇沉淀DNA。
DNA的纯度可以通过紫外分光光度法进行检测，通过测定260nm和280nm处的吸光度比值（A260/A280）来评估DNA的纯度。
三、实验材料与试剂1. 新鲜肝组织样本2. 0.14mol/L氯化钠溶液3. 柠檬酸钠4. SDS5. 氯仿6. 异戊醇7. 冷乙醇8. 100%乙醇9. 无水乙醇10. 硫酸11. 紫外分光光度计12. 1.5mL离心管13. 离心机14. 移液器15. 研钵16. 玻璃棒四、实验器材与仪器1. 研钵2. 玻璃棒3. 移液器4. 离心机5. 紫外分光光度计6. 电子天平7. 恒温水浴锅五、操作方法和实验步骤1. 肝组织匀浆制备：将新鲜肝组织样本剪碎，用研钵和玻璃棒研磨成匀浆。
2. DNA提取：- 将肝匀浆加入0.14mol/L氯化钠溶液和柠檬酸钠，混匀后加入SDS，室温下放置10分钟。
- 加入氯仿和异戊醇，剧烈振荡，室温下放置10分钟。
- 12,000g离心10分钟，小心吸取上层水相。
- 向水相中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温下放置10分钟。
- 12,000g离心10分钟，弃去上清液，用100%乙醇洗涤DNA沉淀。
- 12,000g离心5分钟，弃去上清液，空气干燥DNA沉淀。
- 将DNA沉淀溶解于适量TE缓冲液中。
3. DNA定量：- 使用紫外分光光度计测定DNA溶液在260nm和280nm处的吸光度。
- 计算A260/A280比值，评估DNA纯度。
生物化学课内实践教学(3篇)
第1篇一、前言生物化学作为一门研究生物体内化学反应及其调控规律的学科，在生命科学领域具有极其重要的地位。
为了让学生更好地理解和掌握生物化学的理论知识，提高学生的实验技能和科学素养，我们开展了生物化学课内实践教学活动。
本文将对本次实践教学进行总结和分析。
二、实践内容1. 蛋白质鉴定实验（1）实验目的：掌握蛋白质的鉴定方法，了解蛋白质在生物体内的作用。
（2）实验原理：蛋白质具有特定的氨基酸序列，通过特定的化学反应，可以产生具有特定颜色的化合物，从而实现对蛋白质的鉴定。
（3）实验步骤：①制备蛋白质样品；②加入双缩脲试剂，观察颜色变化；③加入Folin-酚试剂，观察颜色变化；④计算蛋白质含量。
2. 酶活性测定实验（1）实验目的：掌握酶活性测定的方法，了解酶在生物体内的作用。
（2）实验原理：酶活性是指酶催化特定反应的能力，通过测定酶催化反应的速度，可以评估酶的活性。
（3）实验步骤：①制备酶反应体系；②测定酶催化反应的速度；③计算酶活性。
3. 核酸提取实验（1）实验目的：掌握核酸提取的方法，了解核酸在生物体内的作用。
（2）实验原理：核酸是生物体内的重要遗传物质，通过特定的方法可以将核酸从细胞中提取出来。
（3）实验步骤：①破碎细胞；②提取核酸；③检测核酸。
4. 脂质分离实验（1）实验目的：掌握脂质分离的方法，了解脂质在生物体内的作用。
（2）实验原理：脂质具有不同的极性，可以通过特定的方法将其分离。
（3）实验步骤：①制备脂质样品；②加入氯仿，观察分层现象；③分离脂质。
三、实践总结1. 通过本次实践教学，我们掌握了蛋白质、酶、核酸和脂质的鉴定、提取和分离方法，提高了我们的实验技能。
2. 在实验过程中，我们学会了如何设计实验方案、操作实验仪器和记录实验数据，为今后的科研工作打下了基础。
3. 通过实验，我们深入了解了生物体内化学反应及其调控规律，增强了我们对生物化学理论知识的理解。
四、实践反思1. 实验过程中，我们发现部分同学对实验原理掌握不牢固，导致实验结果不准确。
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告
实验报告：核酸的提取与鉴定
I. 实验目的：
通过实验学习核酸提取和鉴定的步骤，掌握核酸提取实验技能，初步了解PCR技术及其在分子生物学中的应用。
II. 实验原理：
DNA分子在水性条件下具有极强的极性，由此，在化学性质上只要是极性且亲水性的溶剂都能迅速膨胀和破裂DNA分子的双链
结构，并溶解其中的碱基、核苷酸、脱氧糖等。
利用这一原理，
我们可以用溶液来提取含有核酸的样品，然后通过紫外吸光度计
检测该提取物中核酸的含量。
此外，PCR技术是一种被广泛运用
于DNA扩增的技术，其主要原理是通过DNA聚合酶扩增DNA
的特定片段。
III. 实验步骤及结果：
1. 核酸提取：将实验样品加入细胞破解液并混匀，离心后取上
清液，加入等体积的异丙醇，轻轻振荡混合并离心15分钟，然后
弃上清液，加入70%无水乙醇并离心，倒掉液体后用氧气吹干。
最终的核酸提取物的溶解液浑浊且无法肉眼辨认样品。
2. 核酸鉴定：将已经提取的样品分别用紫外吸光度计测量其光密度，结果表明与对照的D.W相比，样品中的核酸具有极高的光密度值，证明核酸提取步骤成功，核酸鉴定实验成功。
IV. 结论：
通过本次实验，我们成功地提取了样品中的核酸，并对提取后的核酸进行了鉴定，证明提取物中含有大量的核酸，表明核酸提取和鉴定实验成功，也为分子生物学的研究提供了基础。
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
核酸的分离纯化及鉴定
Slution I
50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris· Cl(PH8)
10 mmol/L EDTA(PH8)
Slution2
0.2 mol/L NaOH(用时用10 mol/L储存液稀释) 1％ SDS
Slution3
5 mol/L乙酸钾 冰乙酸 水
置冰箱15 min，离心取水相。 重复一次。 再用等体积的氯仿—异戊醇（24：1）抽提1—2次。 离心取水相。
加入等体积的乙醚抽提1—2次。
向水相加两倍体积95％冷乙醇。 －20℃过夜或－70℃半小时。 离心15000 rpm, 20 min, 沉淀DNA。 75％的乙醇洗涤一次，室温或真空干燥。
104-106 或者更大。DNA分子量1.6×106-2.2×109 。 性状和溶解度：DNA多为白色纤维状固体。RNA为白色 粉末。都微溶于水，他们的钠盐在水中溶解度较大， 都溶于2-甲氧乙醇，但不溶于一般有机溶剂（如：乙 醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯醋酸等）。 吸收光谱：具有共扼双键的嘌呤和嘧啶，故皆具有独 特的紫外吸收光谱。核酸在240-260nm的紫外波段有 强烈的吸收峰。最大吸收值在260nm附近。通过 OD260/OD280 的比值可判断样品的纯度。 纯DNA的OD260/OD280 =1.8， 纯RNA的OD260/OD280 =2.0。 核酸中若含杂蛋白或苯酚则比值明显降低。
（二）DNA的分离纯化 ——质粒DNA提取
质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1 kb到200
kb。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分 子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传 因子。 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依 赖于宿主编码的蛋白和酶。 质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒和严紧型质粒 大多数基因工程使用松弛型质粒。 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩 增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因 工程中具有极广泛的应用价值。
核酸_提取实验报告
一、实验目的1. 学习核酸提取的基本原理和操作方法；2. 掌握动物组织细胞中核酸的提取和鉴定方法；3. 熟悉实验操作技巧，提高实验操作能力。
二、实验原理核酸是一类生物大分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），它们在生物体的遗传、代谢和调控等过程中发挥着重要作用。
本实验通过提取动物组织细胞中的核酸，对其进行鉴定，以了解核酸的基本性质和功能。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠；2. 实验试剂：盐酸胍、氯化钠、柠檬酸钠、乙醇、异丙醇、二苯胺、3，5-二羟甲苯等；3. 实验仪器：离心机、匀浆器、电炉、水浴锅、显微镜等。
四、实验步骤1. 实验动物处死，取肝组织；2. 将肝组织剪碎，加入适量匀浆液，用匀浆器进行匀浆；3. 将匀浆液加入盐酸胍，使pH值降至6.0；4. 加入适量的氯化钠和柠檬酸钠，使溶液的离子强度达到0.14mol/L；5. 将溶液转移至离心管中，在4℃、5000g条件下离心10分钟；6. 取上清液，加入等体积的异丙醇，混匀；7. 将混合液转移至另一离心管中，在4℃、10000g条件下离心10分钟；8. 弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，在4℃、10000g条件下离心5分钟；9. 弃上清液，将沉淀干燥；10. 将干燥的沉淀溶解于适量的水中，加入二苯胺试剂，观察颜色变化；11. 加入3，5-二羟甲苯试剂，观察颜色变化；12. 根据颜色变化，判断核酸的类型。
五、实验结果1. 在二苯胺试剂的作用下，溶液呈蓝色，表明提取的核酸中含有DNA；2. 在3，5-二羟甲苯试剂的作用下，溶液呈绿色，表明提取的核酸中含有RNA。
六、实验分析1. 实验结果表明，通过本实验方法可以成功提取动物组织细胞中的核酸，并进行鉴定；2. 实验过程中，注意控制实验条件，如pH值、离子强度等，以保证核酸的提取效果；3. 实验结果与理论相符，验证了核酸提取方法的可行性。
七、实验总结1. 本实验成功提取了动物组织细胞中的核酸，并对其进行了鉴定；2. 通过实验，掌握了核酸提取的基本原理和操作方法，提高了实验操作能力；3. 本实验为后续研究核酸的功能和应用奠定了基础。
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RNA酶的蛋白抑制剂(RNAsin)等。
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23
（1）提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备
• 塑料制品：使用灭菌的一次性用品。或用0.1％ DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具 因可被氯仿腐蚀，故不能使用氯仿处理）。
• 玻璃用品：使用前于180℃的高温下干烤6h以上， 或在220℃下干烤3h以上。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇沉淀即可使核酸分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入
冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
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13
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
基因组DNA不复性与蛋白质形成絮状沉淀。 • 离心后，质粒DNA留在上清液中。
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19
煮沸裂解法（偶尔用）
• 通过加热，使细菌裂解、蛋白质和DNA变性。 • 降低温度，质粒DNA复性留于上清液，基因组DNA复性很慢
与蛋白质形成沉淀，可通过离心除去。
梯度离心法（极少用）
• 基因组DNA断裂，吸附大量EB，密度大；质粒DNA密度小。 • 利用氯化铯梯度离心，分离基因组DNA和质粒DNA。
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20
4、质粒DNA的纯化
• 离心分离后，吸取含有质粒DNA的上清液。 • 用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白质。 • 用乙醇或异戊醇沉淀质粒DNA（与基因组DNA方法同）。
核酸溶液 蛋白质
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苯酚氯仿
21
四、RNA的提取
（一）总RNA的提取
所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：
①样品细胞或组织的有效破碎；
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30
5、试剂盒快速提取法
• 裂解液含胍盐，抑制RNA酶，使蛋白质和DNA同时 变性；
• 氯仿等抽提去除蛋白质和DNA； • 乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA； • 此法操作简便快速。
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31
Trizol一步提取总RNA：
TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂， 可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白， 核酸物质解聚得到释放。 苯酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制 RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、β巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
rRNA、5s rRNA的三条带，其中28s rRNA的亮度
应为18s rRNA的两倍，5. s rRNA 较弱。
39
六、电泳
根据电泳支持介质分为
琼脂糖凝胶电泳： 多用于鉴定较大核酸片段（0.1~60 kb） 聚丙烯酰胺凝胶电泳： 用于鉴定较小的核酸片段（50~1000 bp）
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40
琼脂糖凝胶电泳
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6
3、微生物培养物样品
离心获取菌体细胞， 加缓冲液洗涤， 加缓冲液悬浮菌体细胞。
4、微生物混合样品
用缓冲液悬浮菌体，低速离心，沉淀杂质。 高速离心获取菌体细胞。 用缓冲液洗涤菌体细胞。 加缓冲液悬浮菌体细胞。
.
7
（二）提取用具预处理
1、DNA提取用具的处理
要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无 DNA酶处理。
苯酚氯仿
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11
3.沉淀DNA
有机溶剂沉淀DNA：2倍体积无水乙醇（或1倍体积的异戊醇）
再用75%乙醇清洗多次。
4.重新溶解DNA
将DNA溶于水或TE溶液。
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12
基因组DNA－CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷 基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， 并与核酸形成复合物。
6）取上清0. 5ml（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点也 不要吸到中间层的物质）放入另一个1.5ml的EP管中；
7）加入等体积的异丙醇（0.5ml），涡旋混匀；
.
33
8）室温，静置10分钟（该条件由Trizol试剂盒提供；其他提供的
条件用-20℃、1小时，目的为了更好分层）
9）离心机4℃、14000转/分，离心10分钟
.
17
2、收获细菌和溶菌
• 离心收集细菌细胞。
• 细菌裂解方法： 机械法 化学试剂法 （SDS） 溶菌酶－化学试剂联合法（最常用）
.
18
3、分离质粒DNA 基因组DNA与质粒DNA分离
碱裂解法（最常用）
• 用溶液1（EDTA）悬浮菌体。 • 溶液2（NaOH和SDS）裂解菌体，蛋白质与DNA发生变性。 • 溶液3中和pH，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下 能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋 白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉 淀水相中的DNA。
.
14
DNA提取的一般流程
.
29
4、一步快速热酚抽提法
• 将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂SDS等联合使 用，抑制RNA的降解，裂离；
• 用高温苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和DNA，乙 醇或异丙醇沉淀纯化RNA。
• 此法操作简便快速，可在3小时以内处理大批样品， 对大量或少量组织的细胞RNA提取均甚合适。
真空干燥5分钟）
14）加入50μl DEPC处理水溶解（可以根据管底的白色沉淀判断
RNA量的多少加DEPC处理水）
15）-80℃冰箱保存。
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34
组织匀浆
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35
（二）mRNA的提取
从总RNA中分离mRNA， 用Oligo（dT）层析柱。 mRNA含polyA，在高盐浓度条
件下与Oligo（dT）结合，其 他成分被洗掉，再用低盐浓 度洗脱mRNA。
• 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水 冲洗，乙醇干燥，再用3％H2O2室温浸泡10min，然 后用0.1％DEPC水冲洗，晾干。
.
24
• 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA 提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药 匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。
• 严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃ 处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高 压灭菌15分钟，去除残余DEPC。
2、RNA提取用具的处理
要求无菌，防止二次污染。 RNA易被RNase水解，RNase无处不在且 耐高温，提取条件要求严格。
.
8
二、真核生物基因组DNA的常规提取
裂解细胞，溶出DNA
除去杂质
沉淀、浓缩DNA
重新溶解DNA
.
9
⒈ 破碎细胞，溶解DNA：
用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。
微生物样品提取液：含表面活性剂SDS、溶菌酶等 动物样品提取液：含SDS、蛋白酶K等 植物样品提取液：含CTAB
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36
五、核酸的鉴定
（一）核酸浓度检测
OD260＝1时（比色皿厚度1.0cm） 双链DNA浓度为50 μg/ml， 单链DNA或RNA浓度为40 μg/ml。
DNA(μg/ml) = OD260×50 RNA（μg/ml ） = OD260×40
.
37
（二）核酸纯度检测（紫外吸收法）
• 核酸在260 nm处有吸收峰，蛋白质在280 nm有吸 收峰
10）弃上液(移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，沿
液面吸弃约0.9ml上清；第2步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接触 到沉淀斑区）
11)沿试管内壁轻轻加入1ml 4℃预冷的75%乙醇,注意切勿 冲击到沉淀斑区
12）离心机4℃、10000转/分，离心5分钟
13）弃上液（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过 程中把RNA烤干），60℃恒温箱干燥5分钟（注意：打开管盖；或用
核酸酶可被Ca2+、Mg2+等激活，提取液均含有螯合剂（如EDTA， 柠檬酸等），螯合这些离子。
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10
2、除去杂质（主要是蛋白质）
（SDS，破膜、蛋白质变性沉淀）——苯酚抽 提蛋白质——氯仿抽提、萃取苯酚
经离心后溶液分为三层：上层是核酸溶液、 中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯 仿溶液。
核酸溶液 蛋白质
第七章 核酸提取与鉴定
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1
核酸的提1取与鉴定
概述
第一节 预处理
第二节 DNA的提取
第三节 RNA的提取
第四节 核酸的鉴定
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2
一、概 述
研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA
过程：
裂解：破碎细胞，使细胞中的核酸游离 在裂解体系中
纯化：使核酸与其它杂质彻底分离， 如蛋白质、盐等
总原则：①应保证核酸一级结构的完整性；
• 这种方法能得到高质量的RNA，同时分离出细胞 染色体DNA。
.
28
2、盐酸胍-有机溶剂法
• 利用盐酸胍使蛋白质变性，抑制RNA酶；
3、氯化锂-尿素法
• 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶； • 氯化锂选择性沉淀RNA。 • 其缺点是有时会存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA
会丢失一些小分子RNA。
< 1.8，含蛋白杂质；>. 2.0，RNA出现降解
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（三）核酸完整性检测
• 电泳：带电颗粒在电场的作用下发生迁移。
• 核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电 泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳）， 溴化乙锭染色，紫外灯观察。
• 凝胶上RNA存在处可观察到清晰的条带。完整性