·综 述·中医药抗脑缺血神经细胞凋亡的研究进展

第21卷第3期安徽中医学院学报Ｖｏｌ21Ｎｏ32002年6月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＡＮＨＵＩＴＣＭＣＯＬＬＥＧＥＪｕｎ2002·综述·中医药抗脑缺血神经细胞凋亡的研究进展李净导师:王键教授(安徽中医学院,安徽合肥230038)关键词:脑缺血;细胞凋亡;中医药中图分类号:Ｒ743文献标识码:Ａ文章编号:1000-2219(2002)02-0053-04细胞凋亡(ａｐｏｐｔｏｓｉｓ)是近年来生命领域里的热点问题,是由英国科学家ｋｅｒｒ等[1]于1972年首先提出。

它是一种由基因控制的细胞自主性死亡,是真核细胞在生理或病理条件下接受到某种信号的刺激,启动其自身的遗传机制,通过内源性ＤＮＡ内切酶的激动而发生自动化死亡的过程[2]。

目前的研究证实了脑缺血损伤中有细胞凋亡的存在,尤其在再灌注损伤中起重要的作用,抑制细胞凋亡可以减轻脑缺血损伤的程度。

1细胞凋亡与脑缺血细胞凋亡具有以下形态学和生物化学特征:①细胞皱缩,出现凋亡小体;②凋亡细胞和凋亡小体迅速被吞噬细胞吞噬,整个过程无炎症反应;③核染色质浓缩,沿着核膜排列,ＤＮＡ裂解为180～200ｂｐ的片断,其电泳时呈特征性的梯形改变。

目前实验研究发现,在脑缺血急性期,细胞坏死和细胞凋亡并存,细胞坏死主要位于缺血中心区,而细胞凋亡主要出现在缺血半暗带;而在脑缺血迟发性神经细胞死亡中,则以细胞凋亡为主。

ＭａｃＭａｎｕｓ等[3]研究表明在大鼠短暂性全脑缺血后,海马ＣＡ1区及纹状体背侧神经组织ＤＮＡ提取物电泳呈梯形改变,且ＤＮＡ损伤程度和缺血时间呈正比关系。

Ｈｅｒｏｎ等[4]在大鼠一过性前脑缺血模型的研究结果表明,凋亡细胞存在于缺血周边区,轻度缺血及再灌注损伤易触发凋亡细胞,严重的缺血引起能量衰竭导致细胞内钠、钙升高,使细胞溶解。

Ｌｉ等[5]利用大鼠及沙土鼠等复制了一系列局部及前脑缺血再灌注模型,通过免疫组化复染、分子生物学等手段研究了鼠脑缺血再灌注后神经细胞内ＤＮＡ断裂数、Bcl-2蛋白、Ｆａｓ抗原ｍＲＮＡ和即早基因的表达,结果发现在轻度缺血区及重度缺血非病变区神经细胞和非神经细胞诱导早期基因蛋白的表达,也可能诱导Bcl-2的表达。

Ｉｗａｉ等[6]在沙土鼠一过性前脑缺血模型中,采用原位缺口末端标记法发现,缺血再灌注72ｈ后海马ＣＡ1区内侧部分神经细胞出现ＤＮＡ断裂,7ｄ后整个海马ＣＡ1区神经细胞出现ＤＮＡ断裂;而在ＣＡ2及ＣＡ3区尽管缺血再灌注后48ｈ出现明显的神经损伤,但始终未出现ＤＮＡ断裂。

细胞凋亡的机制尚未阐明,可能与脑缺血再灌注损伤产生的自由基、兴奋性氨基酸、Ｃａ2+内流与蛋白质的磷酸化等因素有关,更重要的是与此时细胞内活跃的基因表达有关[7]。

2脑缺血时细胞凋亡的基因调控由于凋亡是一个严格控制、有序的死亡过程,因此,凋亡过程中必须有一系列基因的参与和调控。

这些调控基因包括Bcl-2基因家族,ｐ53、ｉｃｅ基因家族和即早基因(ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙｇｅｎｅ,ＩＥＧ)等。

Bcl-2基因家族有15种之多,Bcl-2和Bcl-xl主要分布在线粒体膜与细胞质中,具有拮抗细胞凋亡的作用;而Bcl-xl、Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ｂａｇ1、Ｂａｋ和Ｂｉｄ则分布于细胞质中,具有促进细胞凋亡的作用[8]。

Bcl-2基因阻止凋亡的可能机制是通过阻止受损ＤＮＡ转录出对凋亡相关基因有激活作用的信号,或阻止这些相关基因的产物发挥作用;Ｂａｘ则功能与Bcl-2相反。

ＢａｘＢａｘ同源二聚体可促进凋亡,ＢａｘBcl-2异源二聚体抑制凋亡。

Bcl-2在脑缺血中抑制凋亡的机制可能有:①通过二聚体的调节来拮抗细胞凋亡;②防止线粒体细胞色素Ｃ的释放;③对Ｃａ2+稳态的调节;④对线粒体渗透性转运进行调节;⑤抑制自由基产物的聚集等。

ｐ53基因控制细胞周期和ＤＮＡ修复,介导细胞凋亡,野生型ｐ53基因对细胞凋亡起促进作用,突变型ｐ53则促进正常细胞转化[9]。

正常ｐ53在细胞生长过程中作为一种“分子警察”监视细胞内ＤＮＡ状态,若ＤＮＡ受损,Ｐ53蛋白水平就增高,则ｐ21基因表达,其蛋白产物聚集于细胞核,通过抑制各种ｃｙｃｌｉｎｃｙｃｌｉｎ依赖性激酶复合体的功能在细胞周期中起到抑制作用,以终止增殖,使受损细胞获得修复ＤＮＡ的时间;若ＤＮＡ受损无法修复,则Ｐ53蛋白持续升高,引起细胞凋亡。

Ｐ53蛋白一般通过三个步骤来造成细胞凋亡:①通过转录诱发氧化还原基因;②通过制造活性氧因子;③氧化破坏线粒体的细胞膜,使细胞死亡。

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(ｃａｓｐａｓｅ)是细胞凋亡的核心所在,各种引起凋亡的因素,如Ｆａｓ死亡因子、ＴＮＦ、Ｐ53等均需要激活ｃａｓｐａｓｅ才能导致凋亡[10]。

ｃａｓｐａｓｅ合成后以酶原和无活性的形式存在,当细胞得到起始凋亡的信号35后,ｃａｓｐａｓｅ通过有序的依次切割而激活级联反应,参与细胞凋亡。

ｃａｓｐａｓｅ切割细胞3种以上的关键底物,切割的结果导致这些底物活化或失活,继而在细胞凋亡过程中发挥作用。

ｃａｓｐａｓｅ的底物主要包括ＤＮＡ修复酶,细胞周期调节蛋白和结构蛋白以及Bcl-2家庭成员。

ＩＥＧ是一类对外界刺激信号传入数分钟内即刻作出反应进行表达的基因,目前研究较多的ｃ-ｆｏｓ和ｃ-ｊｕｎ基因,其相应表达的蛋白在脑缺血后可被迅速诱导达到高峰,它们对细胞内外的各种刺激和ＤＮＡ损伤作出反应,表达增加。

ｃ-ｊｕｎ和ｃ-ｆｏｓ编码蛋白组成异源二聚体,称为ＡＰ1,ＡＰ1是一个重要的转录因子,结合于ＤＮＡ上可诱导细胞凋亡[11]。

Ｈｒａｓ基因超表达可抑制凋亡,负责编码转录因子的即早基因ｃ-ｊｕｎ等参与影响凋亡进程。

3中医药与脑缺血后神经细胞凋亡3.1中药单体抗脑缺血后脑神经细胞凋亡的研究李君庆等[12]利用Ｈｏｅｃｈｓｔ33342和ＰＩ双染色及琼脂糖凝胶电泳技术,观察了不同浓度人参皂苷Ｒｇ1对原代培养的大鼠脑皮质神经细胞凋亡的影响,第16ｄ含有Ｒｇ1的实验组凋亡细胞数较去血清组显著减少,以10μｍｏｌ/Ｌ浓度效果最好,能使凋亡细胞数降至最低。

李莉等[13]观察了中药五味子提取物五味子酚对Ｈ2Ｏ2引起的大鼠脑神经细胞的影响时发现,五味子酚保护组使其ＤＮＡ梯状分布带明显减弱,表明发生凋亡的细胞数减少。

郭瑞友等[14]建立光化学诱导的老龄大鼠局灶性永久性脑皮质缺血模型,用苏木精伊红染色,原位末端标记观察海风藤提取物对脑缺血凋亡的影响,结果显示凋亡细胞数显著减少,并有减少梗死直径的趋势。

孟刚等[15]采用小鼠双侧颈总动脉结扎模型,用ＴＵＮＥＬ法检测神经细胞凋亡,结果发现50～100ｍｇ/ｋｇ的芸香苷可显著减少缺血脑组织神经元的凋亡数目,提示芸香苷对小鼠脑缺血损伤的保护作用与抗凋亡有关。

吕少平等[16]探讨了川芎嗪对脑缺血再灌注时细胞凋亡的影响,对实验大鼠于脑缺血前应用川芎嗪进行干预,然后采用免疫组化法检测脑缺血再灌注不同时间内凋亡相关基因Ｃ-ｆｏｓ及Bcl-2蛋白表达的变化。

川芎嗪组大鼠脑缺血后梗死体积显著减少,脑缺血再灌注时皮质和基底节区Ｃ-ｆｏｓ表达明显下降,而Bcl-2的表达明显增高,提示川芎嗪可抑制脑缺血再灌注时细胞凋亡的发生,具有神经保护作用。

王海波[17]等观察大鼠脑缺血再灌注后ｃ-ｆｏｓ基因表达、细胞凋亡及银杏黄酮对它们的影响,用原位杂交与免疫组化方法检测ｃ-ｆｏｓｍＲＮＡ及Ｃ-ｆｏｓ蛋白表达,应用ＴＵＮＥＬ染色方法观察细胞凋亡。

银杏黄酮可明显减轻缺血再灌注脑损伤及细胞凋亡的发生,可明显增强ｃ-ｆｏｓｍＲＮＡ及Ｃ-ｆｏｓ蛋白表达,这可能是其脑保护作用机制之一。

3.2单味药抗脑缺血神经细胞凋亡的研究曹翠丽[18]等观察水蛭水煎醇提取液对脑细胞凋亡的保护作用,采用大鼠大脑中动脉阻断再灌注模型,用流式细胞仪检测脑组织凋亡率,分析每个样品10个细胞,发现水蛭水煎醇提液组脑细胞凋亡率明显低于模型组(Ｐ<0.05),且脑细胞凋亡的发生推迟。

史树贵等[19]以大脑中动脉闭塞(ＭＣＡＯ)法复制大鼠脑缺血再灌注模型,于缺血前30ｍｉｎ和再灌注30ｍｉｎ腹腔注射灯盏花注射液1.5ｍｌ,利用ＴＵＮＥＬ染色法检测细胞凋亡数,观察该药对缺血再灌注不同时相各组缺血中心区及边界区脑细胞凋亡的影响,结果发现各组凋亡数显著减少。

说明了灯盏花制剂具有抗缺血再灌注引起的神经细胞凋亡作用。

张金涛[20]等观察凋亡相关基因白介素1转化酶(ＩＣＥ)、Bcl-2在脑缺血后的表达情况以及丹参对其影响,采用沙土鼠前脑缺血再灌注模型,在沙土鼠脑缺血再灌注后的2ｈ、6ｈ、12ｈ、1ｄ、3ｄ、5ｄ、7ｄ分别处死沙土鼠,将脑组织进行免疫组化染色观察。

结果发现,ＩＣＥ蛋白表达主要在海马ＣＡ1、ＣＡ4及皮质,免疫阳性的细胞呈褐色,第3ｄ达高峰,第5ｄ后减少;丹参组ＩＣＥ的蛋白表达明显减少(Ｐ<0.01)。

Bcl-2蛋白表达主要在大脑皮质、纹状体、丘脑及海马等区域,并于6ｈ达高峰,其后减少;丹参组Bcl-2蛋白表达明显增加,特别是在海马ＣＡ1区及大脑皮质区(Ｐ<0.01)。

说明丹参能下调脑缺血后ＩＣＥ表达,上调脑缺血后的Bcl-2表达而发挥其神经保护作用。

朱健等[21]对衰老鼠脑海马神经细胞凋亡作用的研究中,用ＴＵＮＥＬ法及流式细胞仪观察神经细胞凋亡并用免疫组织化学法检测相关基因表达变化。

结果发现衰老鼠海马神经细胞有典型的凋亡特征,丹参注射液干预组的海马细胞凋亡率明显降低,Bcl-2表达上调,而Ｂａｘ的表达明显降低,说明丹参能调节Bcl-2/Ｂａｘ比值,对衰老鼠脑神经细胞凋亡有明显的抑制作用。

章军建[22]等研究了当归对脑缺血半暗带细胞凋亡的影响,采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,用ＴＵＮＥＬ法和免疫化学染色法分别检测使用当归后缺血半暗带凋亡细胞和凋亡相关基因Bcl-2、Ｂａｘ蛋白表达。

与对照组比较,当归治疗组缺血半暗带的凋亡细胞显著减少(Ｐ<0.01),Bcl-2表达显著增加,Ｂａｘ的表达无显著变化(Ｐ>0.05)。

说明当归可能通过促进Bcl-2在脑缺血后的表达而对半暗带细胞凋亡产生抑制作用。

3.3中药复方抗脑缺血神经细胞凋亡的研究李晓明等[23]以Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉｎ四血管闭塞法,复制全脑缺血模型,观察了益气通络方对大鼠短暂性脑缺血后海马迟发性神经元坏死的保护作用。

结果发现,经ＴＵＮＥＬ染色,光镜下益气通络方组ＣＡ1区凋亡的锥体神经元较模型+9ｇ/Ｌ氯化钠溶液组明显减少,说明益气通络方能显著降低大鼠短暂性脑缺血后海马迟发性神经元死亡,抑制细胞凋亡可能是其临床疗效机制之一。

朱享照等[24]在中风Ⅱ号干预缺血性中风损伤级联反应的实验研究中,用单侧结扎沙土鼠颈总动脉的方法复制局灶性缺血性脑卒中动物模型,用ＴＵＮＥＬ染色法对凋亡细胞进行检测发现,中风Ⅱ号组比模型组和9ｇ/Ｌ氯化钠溶液组能显著减少神经细胞凋亡,12ｈ内减少非常显著。