人噬菌体抗体库的构建及人源性bFGF抗体的筛选

） 抗体的自身免疫病患者外周血淋巴细 胞 为 材 料， 构建人 后逆转录得到 ， 进行 进 一 ， 经 轮筛选 特异结合的抗 中， 将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌 的抗体克隆， 并用 构建的人源噬菌体抗体 库 库 容 为 抗体库， 并能够从中筛选出与
噬菌体抗体库， 并从中筛选抗 扩增重链
收集自身免疫病患者外周 血， 提取淋巴细胞总 轮固相筛选， 获得能结合
因子 免 疫 原 性 的 研 究 ［ ］ 基 础 医 学 与 临 床，
自身免疫性疾病患者血
自身抗 体 的 检 测 ［ ］ 细胞与分子免疫学 北 京： 北京医科
大学出版社，
结合活性， 挑选特异性最好的 本实验室完成了 建的抗体库为人源性
一步的测序鉴定及亲和力分析。 单克隆抗体研制， 重组牛
， ，（ ） ： 患者自身抗体单链噬菌 ［ ］ ［ ］ 康向东， 陈顺 乐， 鲍春德 ，（ ） ： ［ ］ 田学军， 寿成超， 董志伟 抗 ［ ［ 子生物学报， 版社， ］高 ： 磊， 等 人源性抗 ，（ ） ： 抗原的人源 抗体 人源噬菌体抗体库的构建及 抗体的初步筛选分 析 ［ ］ 中国生物化学与分 ，（ ） ： 重组抗体 ［ ］ 北 京： 科学出
嵌合抗体的构建及其在 动物细 胞 中 表 达， 所构 抗体的研制、 以及用该抗 体开展矽肺和 肿 瘤 的 病 理 和 治 疗 研 究 奠 定 了 基 础； 而且， 针对自身 免 疫 疾 病 患 者 淋 巴 细 胞 抗 体 库 的 构 建， 还为进一步 利 用 这 些 抗 体 筛 选 自 身 免 疫 疾 病 相 关基因及其功能研究提供了有效库 源。 这 将有 利 于 自身免疫性疾病研究， 如分析自身抗 原 的 表位 结 构； 通过它了解机 体 免 疫 反 应 状 况， 以便为疫苗设计和 了解发病机制提供依据。 ［参考文献］
落， 获得的抗体库的库容为
的结合活性 （表 ） 。挑选特异性最好的 、 及
） 用于进一步的测序
的结合活性
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）
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"
图
人
"链的 "
扩增
讨论
噬菌体抗 体 库 技 术 是 通 过 重链和轻链 将全套人抗体
区基 因 克 隆 出 来， 并在噬菌体表面表
达、 分泌， 经筛选后获得的特异性抗体。通过噬菌体 展示的方法 已 经 得 到 多 种 不 同 的 抗 体， 如抗 和抗
免 疫 学 杂 志 ［文章编号］ （
第
卷 ）
第
期
年
月
・
・
人噬菌体抗体库的构建及人源性
向军俭， 汤伟佳， 王
［摘 第一链， 经 以辅助噬菌体 获得具有 体克隆，为 ［关键词］ ［中图分类号］ 要］ 目的
抗体的筛选
）
宏， 邓
宁! ， 杨红宇 （暨南大学分子免疫学与抗体工程研究中心，广州
选用含高效价碱性成纤维细胞生长因子 （ 抗体克隆。方法 段和轻链基因， 分别构建到 噬 菌 粒 载 体 噬菌体抗体克隆。结果
。 合成 （表 ）
段基因的引物
（ （ （ （ （ （ " " （ " " " " （ （ （ !） !） !） ） ） （ ） （ !） （
!） !） !） !）
体库活化， 测定克隆形成单位 （ 筛选。按相同方法进行 噬菌体抗体的鉴定及 筛 选 筛选获得的阳性 克 隆， 接种于含 培养液中， 培养至
［ 次免疫应答 的 抗 体 相 当 ］
的特异结合活性。结果显示， 在稀释 度 为 体原始呈现库具有 抗体。 抗体的筛选与鉴定 百分率， 结果显示， 第 第
表
倍 以 上， 说明构建的噬菌 特异性， 能够从中筛选到抗 经过 轮噬菌体展
的大容 ）
示筛选， 计数所获的噬菌体 数 量 （表 ） ， 并计算产出 轮洗脱下 来 的 噬 菌 体 效 价 为 特异性抗体的 轮的 倍， 说明携带有抗
［ ］ 获得高特异性和高亲和力的 抗体 。国 内外 已有构
事免疫 学、 动 物 细 胞 工 程 和 抗 体 工 程 等 方 面 的 研 究。 （ ） ； （ ）
! 通讯作者
建自身免疫疾 病 天 然 抗 体 库 的 研 究 报 道， 并从中筛
・
・
，］
免 疫 学 杂 志
第
卷
［ 选到 高 特 异 性、 高亲和力的抗体
量蛋白 （天为时代） ； 淋巴细胞分离液 （上海 恒 信 化学 试剂有限公 司） ； 质粒提取试剂盒及 试剂盒 （ 索硬化 症 （ ） 。 提取和 ） 、 和 体的自身免疫病病人外周血 液分离淋 巴 细 胞。 按 总 述步骤提 取 总 成第一链 参考文献 ［
表
分别抽取肌萎缩侧 等含有高效价 抗 组 约 ， 用淋巴细胞分离 提取试剂盒说明书所 （ 及 ） 为引物逆转录合 家族特异性引物序 列
稀释板上长 出
第
期
向军俭， 等
人噬菌体抗体库的构建及人源性
抗体的筛选
・
・
分别 经 。在
!
连 接， 然后转化 ! 双 酶 切， 倍稀释的平 皿 上 长 出 个左右菌 。
经过
轮淘 筛 后， 随机挑取
个 单 克 隆， 超感 法检测其与 个阳性
染制备噬菌体抗体上清液， 用 克隆 （ 鉴定。
表 噬菌体抗体与人重组
超感染， 构建人噬菌体抗体库。经过 特异性的 噬菌体抗体克隆。结论
步鉴定及筛选， 获得具有高亲和力的抗 抗体药物研究奠定基础。
构建了人噬菌体
抗体； 噬菌体展示； 抗体库 ； ［文献标识码］
， ，
［ ］
， ，
，
， ， ）
（
’ ’ ， （ ）
［
］
；
；
碱性成纤维细胞生 长因 子 （ ， ） 是成纤维细胞生长因子家族的重要成 能 促 进 肿 瘤 血 管 的 新 生、
） !
助噬菌体进行活化富集噬菌体。富集 的各个 噬菌体 克隆采用 重组 鼠抗 方 法 进 行 特 异 性 鉴 定， 每孔包被人 ， 加 抗体显色。 # 噬菌体抗体， 标记的
!）
结果
轻重 链 片 段 的 扩 增 物进行 变 段。 扩增。各取 用表 产物 所列 引
# 进行 琼 脂 糖 凝胶电泳 （图 、 图 ） 。扩增 出碱 基 长 度 约 为 的轻链基因片段和重链 抗体库的构建 化产物分别经 电转化 容为 段。 与 "链 纯 将载体
按轻链同 !和 ! 双 酶 切， 样的方法进行连接， 电转化， 细菌扩增。 呈现原始库的特异性鉴定 呈现原始库与人 重组 碳 酸盐 包 被 缓 冲 液 过夜 后 封 闭， 加 孵育 。 参照文献 ［ ］ 将人重 ） 稀释至 封闭后加入 ， 液洗 ） ， 以 轮洗 次， 每次 碳酸氢钠 （ 板； 次， 第 稀释 孔， 置 ， 二抗为羊抗鼠 ， 一抗为鼠抗 夹心 法检测噬菌体 稀释的噬菌体原始库， 的
噬菌体抗 体 库 的 筛 选 用 ， 包被 次 （第 轮洗
初 级 噬 菌 体 抗 体 库， 孵育
。以
， 具体方法按说明书进 行。 引物 设 计 ］ 提供的
扩增人抗体
中 和缓 冲液调 节 至中 # 洗脱液回收噬菌体， 性， 感染对数 生 长 期 的 进 行 富 集。 转 入 三 角瓶 后 补 加 （含 （ 振荡培 养 和 ） 平皿， 滴 。 振荡培养至 进行 噬 菌 体 抗 ） 后进行下一轮 挑取 株经 的 ， 加入辅 轮 轮淘选。 # 和 # 涂 定洗脱下来的噬菌体， 其余的于 加入 ， 加入约 培 养 基， ） ， 取
。 因 此， 本研究
转化感受态 培养基， 比稀释 后 铺 液体培养基 ［含 中， 到"基因库 分别用 噬菌体 的结合， 每孔加
细菌， 电 转化后 迅速 加 入 振荡培养 ， 取 # 经 平 板 检 测 库 容， 余下接入 四环素 （ 。 链 ） ， 倍倍 ］
选用含有高效价 的 抗体， 为
抗体的自身免疫病患者的外 抗体药物研究奠定基础。
［ ］ 。 易地筛选到特异性强的高亲和力抗体
噬菌体得到了较好的富集。
筛选对噬菌体抗体的富集效应
・
・ 在构 建 了 抗
免 疫 学 杂 志
第 ［ ］ ， ，（ ） ： 剑
卷
噬菌体原始呈现库的鸿智， 林 （ ） ： ［ ］ 向军俭， 漆 秋 兰， 邓 清中抗 杂志， ［ ］ 董志伟， 王 ［ ］ ， ，（ ） ： 琰 抗体 工 程 ［ ］ ： ， ， !" #$ 版 宁， 等
础上， 以 行了
作为 靶 抗 原， 对
轮 “吸 附 洗 脱 扩 增” 的 淘 选 富 集。 通 过 测 定 倍 的 富 集， 表明 轮富集后的库中挑取 对 个 的
重组牛碱性成纤维细胞生长 ，
各级库的滴度 和 洗 脱 下 来 的 噬 菌 体 的 产 出 率， 计算 噬菌体抗体 库 得 到 了 约 了淘 选 富 集 作 用。 从 单克隆加 体。以 所构建的噬菌体抗体库表面呈现抗体 的噬 菌 体 起到 超感染 制 备 上 清 液 即 为 噬 菌 体 抗 方法进行初步鉴定， 检测其与 个 阳 性 克隆， 用于 进
而抗
抗体高表 达 的 自 身 免 疫 病 患 者 的 抗 体 基
［基金项目］ 国家自然科学基金 （ （ ） 资助
因， 所构建的抗 体 库 具 有 较 高 的
［作者简介］ 向军俭 （
） ， 男， 江 西 瑞 昌 市 人， 教 授， 硕 士， 主要从
抗体重轻链基因已经特异拼接和重 排， 因而， 建 立的 自身免疫病的人源性抗体库较天然抗 体库更 有利 于
的反应条件为： 性 ， 退火 ， 扩增碱基长度约为 载体质粒分别用
预变性 延伸 轻链
，
， 个循 环。 纯化产物及
的轻链基因片段和
噬菌体抗 体 库 的 构 建
回收后连接， !和 ! 双酶切、 ， 倍倍比 稀 释 铺 平 皿， 其中在 个 菌 落， 从而计算出轻链的库 和 扩增的重链片段 。