荧光显微镜检测细胞凋亡
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡的检测方法一、细胞凋亡概念：细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主的程序性死亡。
细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关,近年来一直是生物医学领域各专业的研究热点。
选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键。
二、细胞凋亡的检测方法：1. 磷酯酰丝氨酸(PS)外翻法(Annexin V 法)在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸 (PS) 从质膜内侧转移到外侧，暴露在细胞外环境中。
荧光基团或荧光蛋白标记的膜联蛋白V 可与暴露在质膜外侧的PS 结合，用于识别凋亡细胞。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
应用实例：以FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 为例子2. Caspase-3活性的检测:半胱氨酸蛋白酶caspase 家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。
其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。
Caspase-3正常以酶原（32KDa ）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KDa ）和两个小亚基（12KDa）组成，图1. 使用10 μM 喜树碱处理Jurkat 细胞4 小时作为阳性实验组（右图），同时设置未处理组做阴性对照（左图）。
使用FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 对以上两组细胞进行相应的实验处理，流式细胞仪进行观察。
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在维持机体内稳态、发育和疾病发生中起着重要作用。
因此，准确、可靠地检测细胞凋亡是细胞生物学和生物医学研究中的重要课题。
本文将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法，希望能为相关研究提供一些参考。
首先，细胞凋亡的形态学特征是细胞体积缩小、细胞核浓缩、细胞膜破裂和细胞内出现凋亡小体等。
因此，通过显微镜观察细胞形态变化是最直观的方法之一。
在实验中，可以使用荧光染料（如荧光素酶、荧光素酶底物等）标记细胞核和细胞膜，然后观察细胞形态的改变。
这种方法简单直观，但不够精确，需要结合其他方法进行验证。
其次，细胞凋亡过程中，细胞内的DNA发生断裂和片段化，产生特征性的DNA ladder。
因此，DNA ladder检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。
实验中，可以通过DNA提取、电泳等技术，检测细胞内DNA的片段化情况。
这种方法对于凋亡细胞的检测比较准确，但需要较多的细胞样本和专业的实验操作技术。
另外，细胞凋亡过程中，细胞膜上的磷脂会外翻，暴露磷脂酰丝氨酸（PS）在细胞表面。
因此，PS外露检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。
实验中，可以使用PS结合蛋白标记或荧光染料标记PS，然后通过流式细胞术或显微镜观察PS的表达情况。
这种方法对于凋亡细胞的检测比较灵敏，但需要较为昂贵的试剂和设备。
最后，细胞凋亡过程中，细胞内的一些蛋白酶活性会发生改变，如半胱氨酸蛋白酶（caspase）的活化。
因此，caspase活性检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。
实验中，可以使用荧光染料标记caspase活性底物，然后通过荧光显微镜或流式细胞仪检测caspase的活化情况。
这种方法可以直接反映细胞内凋亡信号通路的活性，但需要较为复杂的实验操作和数据分析。
综上所述，细胞凋亡的检测方法多种多样，各有优缺点。
在实际研究中，可以根据具体的研究目的和条件选择合适的方法进行细胞凋亡检测。
希望本文介绍的方法能够为相关研究提供一些帮助，推动细胞凋亡机制的深入研究，为疾病的防治提供新的思路和方法。
细胞凋亡的几种检测方法
细胞凋亡的几种检测方法Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法（1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
（2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
2、 DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。
但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。
核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。
用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。
简述细胞凋亡的检测方法
简述细胞凋亡的检测方法
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细胞凋亡检测方法简述如下：
①形态学检测：利用光学显微镜、荧光显微镜乃至透射电子显微镜观察细胞形态变化，如细胞收缩、核染色质浓缩等。
②Annexin V标记：利用Annexin V与磷脂酰丝氨酸特异性结合的特性，荧光标记的Annexin V可检测早期凋亡细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸，结合PI可区分早晚期凋亡与坏死细胞。
③TUNEL染色法：检测细胞DNA断裂情况，通过标记末端脱氧核苷酸转移酶介导的DNA缺口，荧光显微镜下观察凋亡细胞的DNA片段化。
④Hoechst染色：使用荧光染料如Hoechst 33342染色细胞核，观察凋亡细胞核形态的改变，如浓缩、碎裂。
⑤DNA Ladder电泳：提取细胞DNA进行凝胶电泳，凋亡细胞DNA呈现特征性的梯状条带，反映DNA在核小体间的特定位置断裂。
AOEB双荧光染色法检测细胞凋亡
AOEB双荧光染⾊法检测细胞凋亡悬浮细胞AO/EB双染步骤
1.调整细胞密度为106/ml，将细胞种⾄6孔板，每孔2ml细胞；
2.向每孔加⼊相应浓度药物，培养⾄不同时间点；
3. 1000转/min离⼼10min收集细胞，PBS洗涤1次；
4. PBS重悬细胞，使悬浮细胞浓度达106/L左右；
5.取100µl受检细胞悬液，各加5µl AO和EB；
6.取上述染⾊液⼀滴，滴在洁净玻⽚上，加盖玻⽚后⽴即置荧光显微镜下观察。
注：
1. AO/EB染料配制：精确称取AO(Fluka产品)、EB(Fluka产品 )各1mg，分别溶于10ml pH7.2 PBS中，使之配
成100µg/ml的储备液， 4℃保存，⽤前等量混合；
2.可以省略上述步骤3、4，以避免离⼼造成细胞物理性损伤，直接取细胞悬液加AO/EB孵育观察；
3. AO/EB有毒，可致癌，注意保护；
4.上述⽅法只适⽤于悬浮细胞，如果是贴壁细胞，可以考虑爬⽚，或者在培养板中直接染⾊，或者⽤胰酶消化后，按悬浮
细胞⽅法操作；
5. AO/EB虽然可以初步计算凋亡率，但是过于主观，最好采⽤Annexin V FITC/PI双标法进⾏定量；
6. Annexin V FITC/PI双标法对于早期凋亡⽐较敏感，因此可以先通过AO/EB形态学⽅法，摸索药物⼲预后开始出现凋亡的
时间，以确定合适的药物⼲预时间，进⾏Annexin V标记。
细胞凋亡的形态学检测1
荧光显微镜下检测细胞凋亡作者：2010级生物技术许春燕摘要：细胞凋亡是生命科学目前的一个研究热点．检测细胞凋亡的方法和技术取得了很大的进步．从早期细胞内某些基因转录表达的变化、代谢生理的变化，到晚期细胞形态的确诊、细胞内代谢物质的转变，从定性、定量到原位定性定量等，都发展了相对成熟的检测技术．相比于其他检测方法，荧光染色法检测细胞凋亡具有经济、快速、敏感等特点。
关键词：细胞凋亡荧光显微镜观察法正文：下面是荧光显微镜下检测细胞凋亡的四种方法：1、吖啶橙染色法用吖啶橙溴化乙锭混合染色法。
吖啶橙对DNA有特异的亲和力。
结果判定。
荧光显微镜下，可见到活细胞核染色质呈现均匀分布的黄绿色荧光，胞质呈橘黄色或者橘红色荧光，出现凋亡细胞时，核染色质的黄绿色荧光浓聚在核膜内侧，凋亡细胞核的特征性形态可被清晰地辨认。
坏死细胞的细胞质内黄绿色或者橘黄色荧光减弱，有的甚至消失。
具体方法如下：（1）．制备活细胞悬液，浓度约为107/ml。
（2）．取95μl的细胞悬液，加5μl的吖啶橙贮存液混匀。
（3）．吸一滴混合液点洁净玻片上，直接用盖玻片封片。
（4）．荧光显微镜选用激发滤片BG 12或BV等，阻断滤片用515nm 或。
对体外培养的活细胞经荧光素处理后，可在荧光显微镜下直接观察细胞形态的改变．结果；用吖啶橙染色后正常细胞核DNA呈黄色或黄绿色的均匀荧光，细胞质和核仁的RNA呈桔黄或桔红色荧光；凋亡细胞的细胞核或细胞质内有致密浓染的黄绿色荧光，甚至有黄绿色碎片；坏死细胞的细胞质内的荧光较弱或无。
2、Hoechst33258染色法Hoechst33258能够穿过完整的细胞膜，所以可以用来染活细胞，在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。
在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。
具体方法如下：（1）．原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。
（2）．细胞固定液4℃固定5min。
（3）．蒸馏水稍洗后，点加Hoechst33258染色液，10min。
细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法
细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。
二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，3) Telemerase Detection (端粒酶检测)3、生化检测：1）典型的生化特征：DNA 片段化2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。
可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。
4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。
通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。
此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。
如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。
上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。
需结合其它的方法来检测细胞凋亡。
)境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。
常见细胞凋亡检测的方法与注意事项
大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆，其实两者是不同的细胞死亡形式，大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来，细胞凋亡检测的方法不少，这里就总结下几种常用的检测方法。
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一、细胞凋亡的形态学检测
根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
参考文献Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
2贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。
3爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
结果：
注意事项
1.整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
2.操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。
三、线粒体膜势能的检测
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实验报告五（2015.5.27）
荧光显微镜检测细胞凋亡（Hoechst 33258 染色）
姓名：王亚斌 班级：生物技术12（1） 学号：2012332860026
实验五：荧光显微镜检测细胞凋亡（Hoechst 33258 染色)
一 实验目的：
1 了解荧光显微镜的构造并且学会使用荧光显微镜；
2 通过荧光显微镜学会分析数据图片。
二 实验原理：
Hoechst 33258，分子式为C25H24N6O ·3HCl ，分子量为533.88, 水溶解度可达10mg/ml 。
Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。
Hoechst 33258为特异性DNA 染料，与 A-T 键结合，这种染料对死细胞或经70%冷乙醇固定的细胞可立即染色。
而活细胞的着色是渐进性的，在10min 内可达饱和。
在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。
三 实验器材：
1ml 移液枪及枪头，荧光显微镜，培养贴壁细胞，PBS 缓冲液，Hoechst 33258 染色液 六孔板，培养箱
四 实验步骤和方法：
1：加入适当量Hoechst 33258 染色液，注意必须充分覆盖住待染色样品。
通常六孔板加1ml/孔，96孔板加100μl/孔。
2：放入37°C 培养箱中培养30min 。
3：小心吸去染色液，用1ml PBS 洗涤2-3次。
4 ：置于荧光显微镜下，选用340nm 的激发光观察：在荧光显微镜下，活细胞呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。
如果见到3个或3个以上的DNA 荧光碎片被认为是凋亡细胞。
五 实验结果
成绩 优秀 良好 中等 及格 不及格
防己诺林碱浓度为0uM 防己诺林碱浓度为2uM
防己诺林碱浓度为2uM防己诺林碱浓度为4uM
防己诺林碱浓度为6uM
防己诺林碱浓度为8uM
防己诺林碱浓度为10uM
在上图可以看出，在防己诺林碱浓度为2um/ml的时候出现了染致密的颗粒块状荧光，也就是说在这个浓度下，细胞开始放生了凋亡，而且，在不断提高防己诺林碱浓度的情况下，视野里的凋亡细胞开始变多了，而且凋亡细胞数目要多于活细胞数目。
六．分析与讨论
在荧光显微镜下，用340nm的激发光观察活细胞呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。
如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞，图中，随着防己诺林碱浓度的升高，凋亡细胞数目逐渐增多，当浓度在10um/ml 的时候，视野中几乎看不到有活细胞的存在，可以说，在这个浓度下，抑制细胞数目增殖的作用是最强的。