腺病毒载体的构建
miR-1腺病毒载体的构建及表达分析
南 昌大 学 学报 （ 医学 版 ）２ １ ０ ０年第 ５ Ｏ卷第 ８期
Ｊｕ ｎｌ ｆ ｎｈ ｎ ｉｅｓ ｙ Ｍｅ ｉ ｌ ｃ ｎｅ ０ ０ Ｖｏ． ０Ｎｏ ８ ｏ ｒ ａ ｏ ｃ ａｇＵｎｖ ｒｉ （ ｄｃ ｉ ｃ）２ １ ， １５ ． Ｎａ ｔ ａＳ ｅ
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腺病毒与基因传递载体的构建与应用
腺病毒与基因传递载体的构建与应用腺病毒（Adenovirus）是一种以双链DNA为基础的病毒，主要感染哺乳动物，包括人类。
由于具有较高的感染率和传播速度，在临床治疗和基因治疗等领域，被用作基因载体。
这篇文章将会介绍腺病毒作为基因传递载体的构建和应用。
一、腺病毒作为基因传递载体的构建腺病毒是一个十分复杂的病毒，其基因组由约36 kb的双链DNA组成。
它的基因组被分为两个方向，一个方向编码早期基因（E1A、E1B、E2、E3和E4），另一个方向编码晚期基因（L1-L5）。
早期基因编码的转录产物参与了病毒DNA的复制和转录，晚期基因主要编码病毒颗粒结构和组装所需的蛋白质。
基于这个理论框架，可以利用腺病毒基因组进行基因传递。
首先，必须构建一个适当的腺病毒载体（Adenoviral vector），其基本构造是一个缺少大部分基因组的腺病毒。
在此基础上，将感兴趣的DNA片段插入到腺病毒基因组里。
这需要掌握两种方法：重组技术和确认策略。
以重组技术为例，首先要得到一个带有感兴趣DNA片段的载体核酸。
这个DNA完整地包含了带有专门的重组序列的保护酶切位点，使其能够在目标腺病毒基因组上的互补位点诱导重组。
在这个操作后，形成了一个新的腺病毒基因组，其中包括感兴趣的DNA片段。
然后，改造后的基因组可以转染到腺病毒感染容器中，进行繁殖和扩增。
这一步骤可以提高已经构建的腺病毒载体的数量。
其次，需要构建一种辅助病毒（Adenoviral helper）来帮助前述的重组病毒形成成熟的病毒颗粒。
在这个方法中，辅助病毒中没有任何有价值的基因，因此它不能复制自己。
相反，它确保引入的重组病毒可以在感染容器中成功地产生新的病毒颗粒。
通过这样的步骤，可以构建出一种有效的载体，并用于下一步的实验设计。
二、腺病毒作为基因传递载体的应用腺病毒作为基因传递载体可以应用于基因治疗、疫苗研究、基因注入和细胞治疗等领域。
下面分别介绍一下相关应用的基本技术。
腺病毒载体的构建和应用
腺病毒载体的构建和应用随着生物工程技术的不断发展，越来越多的生物医学研究领域开始趋向于基因治疗和基因编辑等方向。
这些技术的实现需要一种特殊的工具——腺病毒载体。
腺病毒（Adenovirus）是一种不包含RNA病毒的DNA病毒，其表面包裹着许多蛋白质，使其具有较好的基因导入能力。
这使得腺病毒成为一种常用的基因载体，被广泛应用于细胞遗传学、基因治疗等领域。
腺病毒的构成腺病毒包含一个大小为36 kb的线性双链DNA，这条DNA上编码了丰富的基因信息，其中大约包含40个基因左右。
腺病毒分为革兰氏正染色体和非冠状病毒两种类型，目前在研究中应用最多的是非冠状病毒型腺病毒。
腺病毒载体构建的两种方法目前有两种主要的构建腺病毒载体的方法，分别是端到端的法和质粒基因重组的法。
端到端的法端到端的法在构建腺病毒载体时需要把目标基因全长克隆进腺病毒的基因组中。
这种方法在基因克隆、重组和转染等方面比较复杂，对实验人员的操作技能要求较高。
同时，这种方法的构建产物相对来说比较容易受到细胞内DNA修饰和限制性酶的影响。
质粒基因重组的法对比之下，质粒基因重组的法相对来说较为容易，需要构建的重组质粒包括表示目标基因的转录单元以及与腺病毒DNA重组所需的旁路序列等。
通过将质粒DNA转染至腺病毒蛋白质、酶和基因表达产物等组分共同构成的细胞核中，将质粒DNA与腺病毒DNA进行重组，从而构建出目标腺病毒载体。
质粒基因重组法不仅可以有效克服端到端法受到限制性酶和DNA修饰的影响，而且富于设计灵活度，从而满足更多的实验需求。
腺病毒载体的应用腺病毒载体广泛应用于人类和动物细胞体内的基因传递、基因治疗和基因工程方面。
通过腺病毒载体可进行基因敲除、基因转录和基因转译等一系列基因编辑操作。
基因敲除基因敲除是研究腺病毒载体理解生命过程和信号转导途径的重要手段之一。
通过基因敲除的方法可以对特定基因进行敲除，从而寻找与该基因相关联的复杂的生物学催化剂。
目前腺病毒载体敲除方法尤其得到广泛应用，对于生命科学研究者来说具有重要的意义。
重组腺病毒载体的构建【精品推荐】
腺病毒载体的特点
n 主要以Ad5型病毒为框架构建 n 具有携带外源基因和转移外源基因的双
重功能 n 可插入长达5kb的外源基因 n 通过受体介导的细胞内吞作用进行基因
转移 n 安全性，复制缺陷（E1区缺陷）
腺病毒载体的特点
n 保留了E3区的腺病毒－－可逃逸宿主免 疫应答，可用于体内基因治疗
重组腺病毒的鉴定
n 病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
n 取上清提取重组病毒DNA n 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
n 24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 n 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 n 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
病毒滴度测定
n 观察细胞病变情况，取100%出现CPE的 稀释度计算病毒滴度： 105细胞×稀释度×10个病毒/细胞 pfu/ml=
重组病毒的扩增
n 293细胞大规模培养：悬浮培养，单层培 养
n 用收集的病变细胞培养上清或冻融上清 感染293细胞
n 反复培养、感染 收集大量的病变细胞 及病毒上清
n 不整合到宿主基因组 n 增殖和非增殖细胞均可感染
构建腺病毒载体的要素
n 腺病毒基因组质粒 n 穿梭质粒 n 目的基因片段 n 包装细胞
AdMax™ system
穿梭质粒
pDC315
腺病毒载体的包装胞细
n HEK293细胞－－E1区缺陷互补的细胞系 悬浮HEK293细胞，易大规模培养，可用 于腺病毒大规模制备。但不易长期保持 稳定。 单层培养HEK293细胞，稳定，用于 重组腺病毒载体构建、蚀斑挑选。也可 用于腺病毒扩增。
MGMT基因重组腺病毒载体的构建
［ ］ ＷａｇＢ Ｊｃｎ Ｍ， ｉ ， ｔ １ Ｍ ａｉｇ ｆ ｍ ｒ ｎｃ ｔ ２ ｎ ， ａｏ ｉ Ｌ Ｊ ｅ ａ． Ｒ ｉ ｇ ｂ ｏｉ ｓ ｍ ｍ ｎ ｏｅ ｙ ｅ ｃｌ ｂ ｌ ｙｓｐ ｒ ｒ ａｎｔ ｏ ｘ ｅ［ ］ Ｚ ｏ ｇｕ ｉ ｅｓｌ ｅ ｄｂ ｕ ｅ ａ ｍ ｇ ｅ ｃｉ ｎｏ ｉ Ｊ ． ｈ ｎｈ ａ ｌ ａ ｅ ｐａ ｉ ｒ ｄ Ｙ
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４ 参 考 文 献
腺病毒疫苗制作流程
腺病毒疫苗制作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开题报告
CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开
题报告
一、研究背景和意义：
癌症是世界公认的重大疾病之一，在其中恶性黑色素瘤的死亡率也非常高。
通过疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症的方法已经成为重要的研究方向，包括恶性黑色素瘤。
而MAGE-A3和CRT是在恶性黑色素瘤中表达的抗原，且它们的表达在癌细胞和正常细胞中有明显的差异。
因而它们被认为是恶性黑色素瘤的潜在免疫治疗靶点。
二、研究内容和方案
本研究通过将MAGE-A3和CRT基因插入到腺病毒载体中，构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体，并在细胞水平表达融合蛋白。
具体步骤如下：
1. 通过RT-PCR方法从恶性黑色素瘤组织中提取MAGE-A3和CRT 基因。
2. 将MAGE-A3和CRT基因克隆到腺病毒载体中，形成CRT/MAGE-A3重组载体。
3. 利用PCR进行扩增，通过酶切和测序进行CRT/MAGE-A3重组载体的鉴定。
4. 将CRT/MAGE-A3重组载体转染到恶性黑色素瘤细胞株中，通过Western Blotting方法检测融合蛋白CRT/MAGE-A3的表达和纯度。
三、研究预期结果
1. 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体。
2. 观察到CRT/MAGE-A3的表达并在细胞中得到验证。
3. 为下一步开展体内实验打下坚实基础，为疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症奠定理论基础。
四、研究意义
本研究有望为恶性黑色素瘤的免疫治疗提供新的方法和思路，也有望开展潜在的抗癌疫苗研究。
同时还有望在癌症免疫治疗的新技术方面提供一定的探索，为癌症的预防和治疗提供新的思路和方法。
腺病毒载体构建的基本原理与应用
腺病毒载体构建的基本原理与应用1. 简介腺病毒（Adenovirus）是一类非常常见的病毒，它可引起呼吸道、眼部和肠道感染等问题。
在基因工程领域，腺病毒被广泛应用作为基因传递载体。
通过对腺病毒进行适当的改造，可以将外源基因有效地传递到目标细胞中，并实现基因的高表达。
本文将介绍腺病毒载体构建的基本原理以及其在实际应用中的主要用途。
2. 腺病毒载体构建的基本原理腺病毒载体构建的基本原理主要包括以下几个步骤：2.1 选择适当的腺病毒亚型腺病毒有多个亚型，其中最常用的是腺病毒2（Ad2）和腺病毒5（Ad5）。
选择适当的腺病毒亚型取决于目标细胞的特点以及需要传递的基因。
2.2 构建质粒载体构建质粒载体是腺病毒载体构建的第一步。
质粒载体通常由多个部分组成，包括腺病毒的核心序列、外源基因表达的启动子和终止子等。
通过合成或PCR扩增等方法，可以将这些部分组装到一起构建质粒载体。
2.3 建立包装细胞系在构建过程中，需要建立一个能够产生包装腺病毒的细胞系。
这些细胞系通常包括两种类型的细胞：一种是质粒携带者，将质粒转染进细胞内；另一种是包装细胞，它们能够提供所需的腺病毒包装蛋白和其他辅助蛋白。
2.4 转染质粒载体将质粒载体转染到包装细胞系中，使其进入细胞内。
转染的方法可以采用常规的化学方法，如钙磷共沉淀法或使用商业化学试剂。
2.5 腺病毒产生与包装质粒载体进入到包装细胞中后，通过转染和转座等过程，腺病毒基因组会产生复制和转录。
最终，腺病毒包装蛋白和基因组会组装成腺病毒颗粒，从而完成腺病毒载体的构建。
3. 腺病毒载体的应用腺病毒载体在基因治疗、疫苗开发、基因功能研究等方面具有广泛的应用。
以下是腺病毒载体的主要应用领域的列点介绍：•基因治疗：腺病毒载体可以用于治疗多种遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜疾病等。
通过将治疗基因成功地传递到患者细胞中，可以恢复或增强正常基因的功能，从而治疗相关疾病。
•疫苗开发：腺病毒载体在疫苗开发中具有重要的作用。
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第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1腺病毒载体的构建由第三章结果可知，基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达水平较低，但是GH 可以诱导SOCS2稳定高表达。
SOCS2高表达的同时，GH诱导的脂肪细胞分化因子和脂质代谢基因表达发生了变化。
为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过一种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续高表达。
细胞导入外源基因是目前常用的方法，但是保证外源基因的高效表达需要合适的表达系统。
目前常用的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。
质粒载体可以导入外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把目标基因导入靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。
逆转录病毒可以把目标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。
蔓病毒本身对脂肪细胞的感染率又比较低。
而腺病毒滴度高，适合外源基因大量表达，并且可插入较大的目的片段，对细胞类型限制较小，可感染非分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。
另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作比较简单(Luo JY et al. 2007)。
本章克隆SOCS2基因，采用pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体，为SOCS2在脂肪细胞中高效表达，研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。
4.1材料4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株脂肪组织取自6周龄昆白小鼠，小鼠购自第四军医大；E.coli DH5α菌株由本实验室保存；pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒，E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌肉发育实验室赠送；人胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中心。
4.1.2 主要试剂限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋白Marker购自Fermentas公司；内切酶PmeI和PacI购自NEB公司；pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购自Takara公司；穿梭质粒小提试剂盒购自Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Bioflux公司；λ/Hin dIII Marker购自天根公司；OptiMem优化培养液购自Gibico公司；脂质体Lipofectamine TM 2000购自Invitrogen公司。
载体测序和引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成，其余材料和试剂来源同3.1。
4.2 试验方法4.2.1 SOCS2基因克隆4.2.1.1组织中总RNA提取根据Takara RNAiso Plus试剂说明提取组织中总RNA：4.2.1.2 cDNA第一链合成同3.2.6提取的总RNA反转录为总cDNA，表3-1为反应体系和操作流程：表3-1 cDNA第一链合成体系及操作过程Table 3-1 RevertAid TM First Strand cDNA Sythesis system and operation protocol反转录合成cDNA第一链总RNA 1.5 μLPrimer：Oligo（dT）18 primer 1 μLDEPC处理水9.5 μL轻微震荡混匀，65℃孵育5min，冰上冷却2min；瞬时离心收集反应液，置于冰上，按顺序加入以下试剂：5×反应缓冲液 4 μLRiboLock TM 核糖核酸酶抑制剂（20 u/μL） 1 μL10 Mm dNTPs混合物 2 μLRevertAid TM M-MuLV反转录酶（200 u/μL） 1 μL瞬时离心收集反应液，25℃孵育5min，42℃孵育60min；70℃ 5min终止反应，反应产物直接用于PCR或-20℃存放备用。
4.2.1.3 SOCS2基因编码区（CDS）的扩增依照扩增CDS全长的引物设计原则，根据Genbank公布的SOCS2基因序列(NM_007706.3)，用Primer Premier5.0软件设计SOCS2扩增引物，表4-1中SOCS2-F和SOCS2-R为SOCS2基因的扩增引物。
表4-1 SOCS2 CDS区扩增引物Table 4-1 Primers of SOCS2 CDS sequencePrimer names Primer sequence (5'-3')SOCS2-F：CGTGTTGACTCATCTCCCSOCS2-R CA TAGCTGCATTCGGAGASOCS2-F-BglⅡGCAGATCTATGACCCTGCGGTGCCTGGSOCS2-R-Flag-XhoⅠGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCT TGTAATCTACCTGGAA TTTA TATTCTT4.2.1.4 SOCS2 CDS区的扩增体系和条件用表4-1中的SOCS2-F和SOCS2-R引物，按照表4-2中的扩增体系和条件扩增SOCS2 CDS区。
第四章SOCS2腺病毒载体的构建 3表4-2 SOCS2 CDS区的扩增体系和条件Table4-2 PCR amplification system and10×PCR 缓冲液 1.25 μLdNTP Mixture（各2.5 mM） 2 μL上、下游引物（10μM）各0.5 μLcDNA 1.3 μLddH2O 7.45 μL瞬时离心收集反应液，按一下条件进行反应：预变性（95℃）5min反应一：（20个循环）变性（95℃）40s退货（62℃，每个循环降0.5℃，共20循环）40s延伸（72℃）50s反应二：（20个循环）变性（95℃）40s退火（57℃）40s延伸（72℃）50s反应三：延伸（72℃）8min反应结束后，样品直接用于电泳检测，或暂时存放于4℃，-20℃可存放一周4.2.1.6 SOCS2 CDS区的T载体克隆及鉴定依照Takara pMD TM18-T 克隆载体操作说明，将胶回收的SOCS2CDS全长克隆至pMD TM18-T；A. 克隆反应体系和操作步骤如下表，样品添加及试剂融解均在冰上操作；pMD18-T（50 ng/μL） 1 μL插入的目的片段（0.1-0.3 pmol） 3.5 μLdH2O 0.5 μLSolutionⅠ 5 μLB. 瞬时离心，收集反应液。
16℃孵育过夜(>12 h)；将连接产物10 μL加入到100 μL DH5α感态中，冰浴30 min；C. 42℃热击45s，迅速冰浴1 min，此过程不可激烈晃动PCR管，否则影响转化效率；D. 加入1 mL LB无抗性培养液，37℃、200 rpm震荡培养1 h；E. 室温、4000 rpm离心5 min，收集菌体；吸弃900 μL培养液上清，用枪头吹打100 μL 余液，重悬菌体；F. 无菌条件下，将100 μL菌液均匀的涂于含Amp的LB固体平板，37℃倒置培养；E. 培养约12 h，无菌条件下，挑取单菌落于含Amp的LB液体培养液中，37℃、250 rpm 震荡培养过夜，提取穿梭质粒进行PCR检测；阳性克隆送至金斯瑞公司测序。
4.2.2 DH5α感受态的制备(CaCl2)无菌条件下，将冻存的DH5α划线接种于无抗性的LB固体平板上，37℃倒置、过夜培养，选取生长良好的单克隆接种于100 mL无抗性的LB液体培养液中，于37℃、250 rpm，震荡培养过夜(约16 h)；A.从中吸取1 mL菌液接种于100 mL无抗性的新鲜培养液，37℃、250～300 rpm培养2～3 h，从2 h开始不断对菌液测ODλ=600值，直至0.4≤ODλ=600≤0.6(0.45为最适OD值)；B.以下步骤必须均需无菌冰上操作，0.1M CaCl2和含15～20%甘油的0.1M CaCl2需要预冷处理；C.取30 mL菌液于50 mL离心管，冰上冷却10 min；D.4℃ 4500 rpm离心5 min收集菌体；加3 mL 0.1M CaCl2溶液，枪头轻轻吹打，使菌体悬浮，冰上放置20 min；E. 4℃ 4500 rpm离心5 min，收集菌体；加3 mL含15～20%甘油的0.1M CaCl2，枪头吹打混匀菌体；每100 μL分装一管，-80 ℃冻存。
4.2.3 质粒转化A. -80℃冻存的感受态，冰上融化或室温融化后立即置于冰上；B. 向100 μL感受态中加入连接产物(含量≤50 ng，体积≤10 μL)，摇匀，冰上静止30 min；C. 42 ℃水浴热激90 s，或37℃水浴5 min，热击后迅速置于冰上，静止5 min；操作过程不要有激烈摇动；C.向离心管中加1 mL 无抗性LB培养基，混匀后，37℃ 250 rpm振荡培养1 h，细菌恢复正常生长，抗性基因开始表达；D.将上述菌液4000 rpm离心5 min，弃去1 mL上清，重悬菌体，菌液均匀涂于含相应抗性的LB固体平板，放置30 min后，37℃倒置培养过夜。
4.2.4 质粒的小量提取挑取最新筛选的含有穿梭质粒的单克隆于含有相应抗性的LB培养基中，37℃300 rpm激烈振荡培养12~16 h，获得的新鲜菌液依照Omega E.Z.N.A.质粒小量提取试剂盒的操作说明提取穿梭质粒，所有步骤均在室温下操作。
第四章SOCS2腺病毒载体的构建 54.2.5 重组穿梭穿梭质粒的构建4.2.5.1 SOCS2 CDS区的PCR扩增和回收以pMDTM18-SOCS2穿梭质粒为模板，表4-1中SOCS2-F-BglⅡ和SOCS2-R-Flag-XhoⅠ分别为上游和下游引物，按表4-2中的反应体系和操作步骤扩增SOCS2，所用引物带有所需要的酶切位点(下划线部分)和Flag标签(斜体部分)。
PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测，切取含目的片段的胶块，按4.2.5步骤回收PCR产物，微量定量仪测定浓度待用。
4.2.5.2 SOCS2基因和pAdTrack-CMV穿梭质粒的的双酶切及回收以微量定量仪测定的浓度为参照，按下列体系对目的DNA进行BglⅡ和XhoⅠ的双酶切，穿梭质粒酶切体系：10×Buffer 2 μLpAdTrack-CMV(0.5～1 μg/μL) 6 μLBglⅡ0.6 μLXhoⅠ0.6 μLdH2O 10.8 μLSOCS2 PCR产物酶切体系：10×Buffer 2 μLSOCS211 μLBglⅡ 1 μLXhoⅠ 1 μLdH2O 15 μL瞬时离心收集反应液，37℃孵育5 h，产物进行1%琼脂糖电泳，将酶切的获得的目的条带切下，按4.2.5步骤回收双酶切的DNA，测定浓度备用。
4.2.5.3 SOCS2基因与pAdTrack-CMV穿梭质粒片段的连接将双酶切后回收产物的质量浓度计算转化为摩尔浓度，目的DNA和穿梭穿梭质粒DNA以10:1的摩尔比混合，T4连接酶连接，连接体系如下：10×Buffer 2.5 μLSOCS2 CDS(约0.3 pmol) 5.5 μLCMV(约0.03 pmol) 0.7 μLT4连接酶(350U/μL) 1 μLdH2O 15.3 μL瞬时离心收集反应液，16℃孵育过夜，取10 μL连接产物按4.2.3步骤将重组穿梭穿梭质粒转化DH5α感受态，于含Kan(100 μg/mL)的固体LB平板，37℃倒置培养过夜。