电镜与样品制备技术支持
电镜与样品制备技术支持
电镜样品取材方法
1动物及人体组织的取材
动物组织的取材，应在麻醉（1%戊巴比妥钠按5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污锋利的（双面）刀片将材料切成大约1㎜宽，2～3㎜长的小块，从中挑选损伤小的小条，再将其切成１㎜3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有冷的新鲜固定液的有盖青霉素小瓶里，放入冰箱冷藏室低温固定（０～４℃）。
2体外培养细胞的取材
生长在培养瓶中的体外培养细胞取材时，先倒出培养液，接着到入适量的戊二醛固定液，在冰浴上放置３～５min，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将含有细胞的固定液转移到离心管中，普通离心机低速离心（2000转/分钟）15min，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换上新鲜固定液继续固定。
3 植物组织的取材
植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不象动物细胞那样迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透。因此，植物材料的取材宜切成薄片状，经适当固定后再切成小方块。
电镜样品取材的基本要求
⑴快取材的动作要迅速，最好在材料离体后１min内就进入固定液；解剖器械要锋利，避免牵拉和挤压，尽量减少取材中的机械损伤。
⑵准取材要准确。①器官要准确②部位要准确：如脑垂体的前叶和后叶要分清，其结构和功能各不相同。
⑶冷取材过程应尽量在低温下进行（０～４℃），以降低酶的活性，减少细胞内结构的损失。
⑷小所取材料体积要小，一般不超过１㎜3。因为固定剂的渗透力较弱，若组织块太大，块的内部将得不到良好的固定。
电镜制样中常用固定剂的配制方法
⑴缓冲液的配制
Ａ、磷酸缓冲液（0.2M）的配制方法如下：
甲液：Na2HPO4.12H2O 71.64g
加蒸馏水溶解成1000ml
乙液：NaH2PO4.2H2O 31.21g
加蒸馏水溶解成1000ml
按下表混合甲、乙两液即得所需PH的磷酸缓冲液
表1：0.2M的磷酸缓冲液的配制（50ml）
PH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4
甲液（ml）13.3 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5
乙液（ml）36.7 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5
磷酸盐缓冲液对细胞无毒性作用，常用于配制戊二醛固定液，并适于作灌注固定。本缓冲液
的缺点是固定时容易产生沉淀，并容易生长细菌，不能长期储存。
B、二甲胂酸盐缓冲液（0.2M）
甲液：二甲胂酸钠4.28g
加蒸馏水至100ml
乙液：0.2N盐酸
按表2混合甲、乙两液后，将总体积稀释成200ml即可获得不同PH的缓冲液
表2：二甲胂酸钠缓冲液的配制
PH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4
甲液（ml）50 50 50 50 50 50
乙液（ml）18.3 13.3 9.3 6.3 4.2 2.7
本缓冲液比较稳定，不易生长细菌，可长期保存，与低浓度的钙质（1-3mM）不发生沉淀反应。缺点是胂有毒性、有臭味，配制时应在通风橱中进行。
⑵常用固定液的配制
A、0.1M磷酸缓冲戊二醛固定液（市售戊二醛多为25%的水溶液）
表3：0.1M磷酸缓冲戊二醛的配制
戊二醛最终浓度（%）1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0
0.2M磷酸缓冲液（ml）50 50 50 50 50 50 50
25%戊二醛水溶液（ml）4 6 8 10 12 16 20
双蒸水加至（ml）100 100 100 100 100 100 100
B、0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液
表4：0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液的配制
戊二醛最终浓度（%）1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
0.2M二甲胂酸钠缓冲液（ml）50 50 50 50 50
25%戊二醛水溶液（ml） 4 6 8 10 12
双蒸水加至（ml）100 100 100 100 100
C、多聚甲醛-戊二醛固定液
取2克多聚甲醛粉末溶于25毫升蒸馏水，65℃下不断搅拌，加1-3滴1N氢氧化钠，使溶液透明，冷却后加5毫升5%戊二醛，加二甲胂酸缓冲液或磷酸缓冲液（0.2M，pH7.2-7.6）使总体积到50毫升，并加25毫克无水氯化钙。混合液的pH为7.2。本液对微管有良好的保存作用。
透射电镜的成像原理
目前，主流的透射电镜镜筒是电子枪室和由6～8级成像透镜以及观察室等组成。阴极灯丝在灯丝加热电流作用下发射电子束，该电子束在阳极加速高压的加速下向下高速运动，经过第一聚光镜和第二聚光镜的会聚作用使电子束聚焦在样品上，透过样品的电子束再经过物镜、第一中间镜、第二中间镜和投影镜四级放大后在荧光屏上成像。电镜总的放大倍数是这四级放大透镜各级放大倍数的乘机，因此透射电镜有着更高的放大范围（200×～1000000×）。
透射电镜的一般操作流程
接通电镜工作电源后，电镜开始通过机械泵抽前级和镜筒真空，当镜筒真空达到一定要求时，再由扩散泵抽镜筒的高真空，当高真空能达到加高压的要求时，面板上高真空指示灯点亮，表明此时可以加高压了，接通高压并调整高压到合适的高压值，稍等一会待高压稳定后，再增加灯丝电流，使荧光屏中心产生一个明亮的光斑，随后依次接通各级透镜的工作电流，调
整电镜的工作状态，调整好后再加入样品进行观察，并对感兴趣的部位拍照记录。电镜使用完毕，应依次关闭高压、灯丝加热电流、关闭各级透镜工作电流以及取出样品。待冷却水再工作10～15min后，关闭电镜和冷却水。
电镜在生物医学领域中的应用
17世纪光学显微镜的发明，促进了细胞学的发展，20世纪电子显微镜的发明，揭开了病毒和细胞亚显微结构的奥妙。在20世纪60年代以来，电镜广泛应用于工农业生产、材料学、考古学、生物学、组织学、病毒学、病理学和分子生物学等众多研究领域中。但电镜技术从应用的广度、研究的深度等方面看，没有哪一个领域可与生物医学相媲美。
1 在细胞学方面：由于超薄切片技术的出现和发展，人类利用电镜对细胞进行了更深入的研究，观察到了过去无法看清楚的细胞超微结构。例如，用电镜观察到了生物膜的三层结构以及细胞内的各种细胞器的形态学结构等。
2 电镜在发现和识别病毒方面起到了重要作用：许多病毒，尤其是肿瘤病毒就是用电镜发现的。电镜也为病毒的分类提供了最直观的依据，例如去年肆虐全球的SARS病毒就是首先在电镜下观察到并确认是病毒而不是支原体的。
3 在临床病理诊断方面：生物体发生疾病都会导致细胞发生形态和功能上的改变，通过对病变区细胞的电镜观察就可以为疾病诊断提供有力依据。例如目前电镜在肾活检、肿瘤诊治中发挥了重要作用。
4 电镜技术与生命科学中新兴起的技术相结合，促进了新技术的应用。例如电镜技术与免疫学技术相结合产生了免疫电镜技术，它可以对细胞表面及细胞内部的抗原进行定位，可以了解抗体合成过程中免疫球蛋白的分布情况等。
透射电镜在生物医学研究中的主要技术
1 常规超薄切片技术
一般的透射电镜电子束的穿透能力较弱，大多数标本无法直接在电镜下观察，必须切成厚度为50~70nm的超薄片，这种制作超薄片的技术称为超薄切片技术。在透射电镜的生物医学样品制备方法中，超薄切片技术是最基本最常用的制备技术，其他一些样品制备技术，如细胞化学技术，免疫电镜技术及电镜放射自显影技术都离不开超薄切片的制作。利用透射电镜观察超薄切片，可以了解细胞的精细结构。
2 负染色技术
负染色技术也叫阴性反差染色，它是由Hall等首先采用的一种染色技术，与超薄切片法相比，该技术具有分辨率高、简单易行和快速方便等优点。因此在生物学研究中广泛应用。这种方法可以显示大分子、细菌、病毒、原生动物、分离的细胞器及蛋白质晶体等样品的形状、大小和表面结构特征。尤其是在病毒学领域，有关病毒的分类及病毒亚单位结构的显示、病毒与抗体的相互作用等的研究中，负染色更是不可缺少的实验技术。
3 金属投影与复型技术
金属投影技术是利用真空喷镀仪对样品进行投影的一种技术，Williams首先用这种技术用于增加电镜图象的反差。该技术还可用来测量颗粒及大分子的大小。复型技术主要用于样品表面结构的研究。某些坚硬的材料，如牙齿、骨骼、金属等，它们是不透明的，并且很难制成超薄切片，对于这些材料可用一种电子透明的薄膜将其表面结构复制下来，即成复型。通过对该复型样品的观察，就可以了解原有样品的天然断面或人工断面的结构特征。
4 冷冻切片技术和冷冻蚀刻复型技术
冷冻切片技术是使样品迅速冷却，然后用冷冻切片机进行冷冻切片，它省去了普通超薄切片中繁杂的化学固定与包埋操作。该技术在细胞化学研究中有着特殊用途。冷冻蚀刻复型技术是一种冷冻断裂与复型相结合的样品制备技术，该技术在生物学中的广泛应用不仅验证了超薄切片所展示的细胞超微结构，而且还揭示了某些前所未见的新结构，尤其是在显示生物膜的结构方面，该技术有着独特作用。
5 电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术又称超微结构细胞化学技术，它是从光镜组织化学的基础上发展起来的一种超微结构技术，它的任务是研究细胞内各种成分在超微结构水平上的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞的化学和生化功能。其中最主要的是蛋白质（尤其是酶的细胞内定位），其次是核酸、脂肪、碳水化合物及无机离子的定位。该技术有利的促进了形态学和生物化学的结合，使生命科学的研究进入了新的水平。
6 免疫电镜技术
免疫电镜技术是通过特殊的标记方法使抗体与电子致密的标记物相结合，然后利用电镜在超微微结构水平上鉴定抗原-抗体的结合反应。在免疫学领域中，这是一种非常有用的实验技术。
7 电镜放射自显影技术
电镜放射自显影技术是一种利用放射性同位素作为标记物对细胞化学物质进行超显微结构的定位、定性或定量研究的技术。这种技术不仅用于对重要的代谢物质进行定位、定性或定量，而且还用于显示抗原-抗体的结合，激素或药物与受体的结合，显示病毒的感染与复制部位等。因此这是一种非常有用的现代生物学技术。
体金标记免疫电镜
包埋前胶体金标记免疫电镜
胶体金探针（>3nm）即使在使用穿透剂的情况下也不易穿透细胞，因此常常用于细胞表面抗原的标记。20世纪90年代，国外成功制备了1nm金标记的探针，这种探针容易穿透组织和细胞，已成功应用于标记细胞内抗原。包埋前免疫标记时，在标本未作固定或轻微固定后进行免疫标记，标记后再用2％戊二醛+2％多聚甲醛固定以获得较好的超微结构保存。这种方法特别适用于标记对固定剂敏感的抗原。在标记细胞膜表面成分时，应注意免疫标记可能会引起细胞膜成分的重分布，抗体与未固定或轻微固定的细胞膜成分的结合可能会引起这些分子的聚集、成帽或内吞。通常用含低浓度戊二醛的固定液作短暂固定，能有效防止膜分子的重分布。单独用多聚甲醛固定或在4℃做免疫标记不足以防止质膜分子向周边扩散。
细胞表面抗原标记（间接法）
?细胞用PBS洗两次，用0.5％戊二醛+2％多聚甲醛在室温下固定0.5～lh。可根据抗原对固定剂的敏感度选择恰当的固定液，对某些抗原可完全不用戊二醛，用4％多聚甲醛固定1～4h。
?用PBS漂洗3～5次，每次20 min。
?用0.1 mol/L甘氨酸漂洗细胞5min，灭活自由醛基。这一步骤对用戊二醛固定的细胞尤为重要，因为戊二醛含有两个醛基，在固定时其中的一个醛基可能与细胞成分结合，而留下一个自由的醛基，若这个自由的醛基不被阻断，则能与阻断液中的蛋白或抗体结合，从而增加非特异性背景染色。
?用含1％BSA的无钙镁Dulbecco's PBS漂洗细胞15min，以阻断对一抗的非特异性结合。阻断液可以是2％～10％BSA，也可以是卵蛋白（OVA）、正常血清或IgG片段。
?室温下用适当稀释的第一抗体孵育细胞1～2h，用无钙镁Dulbecco's PBS漂洗细胞5次，每次5min，以除去未结合的一抗。如果非特异性染色背景很高，可在漂洗液中加入0.1mol/L EDTA。
?室温下用适当稀释的胶体金探针（可以选择二抗-胶体金、蛋白A-胶体金或蛋白G-胶体金）孵育细胞30min。
?用无钙镁Dulbecco's PBS漂洗细胞5次，每次5 min。
?室温下用2％戊二醛+2％多聚甲醛（用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液配制，pH7.4）再次固定细胞1 h。
?用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗，1％锇酸后固定，常规脱水包埋，超薄切片铀铅染色后透射电镜下观察。也可按常规扫描样品制备方法处理，在扫描电镜下观察细胞表面的胶体金标记情况，由于扫描电镜分辨率的限制，应选用40nm以上的胶体金或采用银加强染色法。?对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG、无关抗体代替一抗。
细胞表面抗原标记（直接法）
?按间接法前4步操作。
?室温下用适当稀释的第一抗体-胶体金复合物孵育细胞lh。?按间接法步骤7～10操作。纳金（超微金）-银加强法标记细胞内抗原（0chs等，1994年）
?将单个盖玻片放人直径为35mm的皮氏培养皿中，加入3ml培养液。
?培养2～3d后，用PBS洗单层细胞，然后用3％的甲醛（由对甲醛新配制而成）室温下固定30min，用PBS（pH7.4）缓冲液改变戊二醛的含量（0.01％～0.5％）。
?用来检验每种抗原的戊二醛浓度并不相同，但戊二醛浓度越高，固定效果越好。应有一份不加戊二醛的样本作为阳性对照，因为大多数抗原都能被戊二醛固定。固定时溶液的pH值应与细胞生长时的pH值一样。
?用PBS洗细胞三次，每次10min，用35mmol／L的甘氨酸或1mg／ml的NaBH4/PBS液猝灭三次，每次5min。
?室温下用0.2％的TritonX-100/PBS液渗透细胞5min。
?用PBS洗细胞3次，每次5min。
?室温下用1％的正常羊血清(NGS)/PBS液（NGS/PBS）封闭细胞30min。
?用在1％NGS/PBS稀释下的一抗孵育细胞，室温下1h或4℃过夜。
?PBS洗细胞3次，每次5min。
?用1％的NGS/PBS封闭细胞30min。
?用与抗人、抗鼠或抗兔Fab共价相连的1.4nm超微金颗粒在1％，NGS/PBS中稀释成1/100，室温下摇动培育细胞1h。
?PBS洗细胞3次，每次5min。
?用l％的戊二醛/PBS固定细胞30min。
?用PBS洗3次，每次5min。
?用双蒸水洗3次，每次5min。
?室温下避光用HQ银[根据厂商说明（Nanophobes）]进行银增强，3～4min，时间越长，银包被的金颗粒就越大。
?水洗3次，每次5min，终止银反应。
?用1％的OsO4的二甲胂酸盐缓冲液，pH7.3，固定样本30min。
?用水洗样本3次，每次5min。
?用乙醇脱水，Epon 812包埋。
?检查由柠檬酸铅和醋酸铀染色的或未染色的薄切片。
?金颗粒标记可以通过EM底片进行定量分析，分析结果可表示为“金颗粒数/μm2”。
包埋后胶体金标记免疫电镜
包埋后免疫胶体金标记是应用最广泛的免疫电镜技术，标本经固定、包埋、切片后在超薄切片上进行免疫标记。包埋后免疫胶体金标记也可分为直接法和间接法两种：
直接法是用与胶体金交联的第一抗体直接进行标记；间接法是用不带标记物的第一抗体先与组织反应，然后用胶体金标记的第二抗体或第三抗体、蛋白A或蛋白G等特异性结合第一抗体，因此只要制备一种胶体金探针就能用于许多抗原的标记，方法更为简便，且敏感性比直接法高。蛋白A和蛋白G的胶体金探针是包埋后免疫胶体金标记中应用最广的第二试剂，它们对不同种抗体的亲和力，可根据一抗的种类选择合适的胶体金探针。抗体-胶体金探针也较常用，但其稳定性不如蛋白A-胶体金探针。此外，胶体金标记的亲和素（avidin）、凝集素（1ectins）以及酶也曾被应用于包埋后标记。
标准方法
?标本用固定液在室温或4℃下固定1～6 h。
?标本用PBS漂洗3次，每次10 min。
?用0.1 mol/L甘氨酸漂洗标本20～30min，封闭残留的自由醛基。
?用PBS漂洗标本3次，每次10 min。
?低温脱水：4℃，30％乙醇脱水10min；4℃，50％乙醇脱水30min；-20℃，70％乙醇脱水1h；-35℃，90％乙醇脱水1h；-35℃，100％乙醇脱水1h。
?低温渗透：-35℃，以1：1和1：2的无水乙醇：低温包埋剂（LRWhite，LR Gold，Lowicryl）各渗透1h；纯低温包埋剂渗透1h；纯低温包埋剂渗透过夜。
?包埋、聚合：明胶胶囊作包埋模具，紫外灯聚合箱内，用365nm紫外灯进行光聚合，在-35℃下聚合1～2天，转入室温再聚合2～3天。
?超薄切片：切片的厚度较一般的略为厚一点（切片的光干涉色呈淡金黄色），将切片捞在镍网上。
?蚀刻（此步可省略）：用于蚀刻的溶液有三种：饱和过碘酸钠水溶液、1％H2O2、乙醇盐，目的是暴露切片内部的抗原、使试剂能穿透标本，但此步处理常会使超微结构受到破坏，且会影响抗原性。若非必要，一般不作蚀刻。蚀刻的作法是，在parafilm或蜡片上滴一滴用于蚀刻的液体，然后将带有切片的镍网轻轻漂浮在液滴上（有切片的一面向下）。蚀刻后直至免疫标记完成，镍网应始终保持湿润状态，否则易出现难以清洗的非特异性反应。
?用去离子双蒸水漂洗切片3～5次。
?切片用1％BSA或5％正常血清（无钙镁Dulbecco's PBS或TBS配制）孵育15～30min以阻
断对第一抗体的非特异性结合。Brorson SH建议用5％BSA孵育1h以去除非特异性标记，BSA 的浓度过高或孵育时间过长可能会使标记率下降。
?用适当稀释的第一抗体室温孵育l～2h。一抗用含0.1％BSA的无钙镁Dulbecco's PBS或TBS 稀释。
?用无钙镁Dulbecco's PBS或TBS漂洗切片6次。
?室温下用适当稀释的胶体金探针（可以选择二抗-胶体金、SPA-胶体金或蛋白G-胶体金）孵育30～60min。
?漂洗同上步骤。
?用去离子双蒸水冲洗切片。
?用醋酸铀和硝酸铅染色后在透射电镜下观察。
?对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG、无关抗体代替一抗。
链霉亲和素-胶体金法
生物素-亲和素（biotin-avidin）检测系统已被广泛应用于免疫细胞化学和分子生物学。该系统利用生物素与亲和素之间的高度亲和力（解离常数：10-15）而建立的。亲和素会与许多组织非特异性结合，这主要是由于它是一种糖基化的蛋白，而且具有很高的等电点（pI=10）。由于亲和素的非特异性结合问题，目前亲和素已基本被链霉亲和素(streptavidin)所代替。链霉亲和素具有同亲和素类似的特性，但没有糖基化，几乎没有非特异性结合。链霉亲和素-胶体金检测系统常在包埋后免疫细胞化学中应用，这个系统常常由不作标记的一抗、生物素化的二抗和链霉亲和素-胶体金组成，也可不用二抗，直接使用生物素化的一抗和链霉亲和素-胶体金。该系统所需的试剂都已商品化，可以从试剂公司购买得到。
?按以上标准方法中的前12步操作。
?室温下，用适当稀释的二抗-生物素孵育切片30min。
?用无钙镁Dulbecco's PBS或TBS冲洗切片5次。
?室温下用适当稀释的链霉亲和素-胶体金探针孵育30min。
?用无钙镁Dulbecco's PBS或TBS冲洗切片5次。
?醋酸铀、枸缘酸铅染色后在透射电镜下观察结果。
?对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG、无关抗体代替一抗。
双重或多重免疫标记法
由于在制备过程中胶体金颗粒的直径可以控制，因此就可以利用不同大小的胶体金颗粒做双重免疫标记甚至三重免疫标记。做双重免疫标记时，一般选择5nm和15nm胶体金，在透射电镜下很容易区分这两种胶体金。做三重免疫标记时，则选择5nm、10 nm和15nm胶体金。应使用经蔗糖梯度离心纯化得到的大小均一的胶体金探针。双重或多重免疫标记有多种方法，如直接法、间接法、双面双重标记法等。间接法必须在第一种抗原被标记完成后用甲醛蒸气阻断可能存在的游离的第一抗体结合位点，阻断的时间必须控制好，时间太短则会造成交叉免疫反应，太长则会影响后一种抗原的标记率。双面双重标记法在操作时必须非常小心，不能弄混标记面，且不能将抗体沾到另一面，否则会影响结果的准确性。鉴于以上原因，推荐采用直接法进行双重标记，标记效果好，对阳性结果容易做出正确的判断和分析。直接法是将针对两种或三种抗原的抗体分别与不同直径的胶体金结合，然后直接进行免疫标记。免疫标记时先将切片与一种抗体-胶体金孵育，用TBS漂洗后再与另一种抗体-胶体金孵育，
其他步骤同包埋后免疫胶体金单标记法。
酶标记免疫电镜
组织抗原的包埋前免疫酶标记
?固定：免疫电镜通常采用4％多聚甲醛和低浓度的戊二醛（0.1％～0.5％）混合液灌注固定。PBS充分洗涤。
?预切片：用振动切片机将样品切成40～60μm的厚片。
?正常山羊血清（1：20）室温30 min。
?加入适当稀释的第一抗体，置冰箱（4℃）内24h。PBS充分洗涤。
?正常山羊血清（1：20）室温30 min。
?加入稀释好的HRP标记的第二抗体。室温1h。PBS充分洗涤。
?2.5％戊二醛后固定15～30min。PBS充分洗涤。
?0.75mg/ml的DAB溶液，室温避光反应15min。
?加等量DAB溶液，内含0.02％H2O2（加入后最终浓度为0.01％），室温避光反应15～20min。PBS充分洗涤。
?在解剖显微镜下观察免疫反应阳性部位并取下。
?用1％锇酸（pH 7.4）后固定0.5～1h。PBS充分洗涤。
?梯度乙醇或丙酮脱水。
?环氧树脂包埋。
?超薄切片，铀、铅染色或单染或不染。?电镜观察。
组织抗原的包埋后免疫酶标记
?新鲜组织经固定后（勿用OsO4后固定），低温下进行梯度乙醇脱水，用低温包埋剂进行包埋、光聚合，超薄切片（用镍网捞片）。
?正常山羊血清（1：20，用pH 7.6的0.02mol/L TBS稀释）室温孵育5～15 min。
?加入适当稀释的第一抗体（兔抗血清）（用含1％正常山羊血清的0.02mol/LTBS）4℃孵育过夜，然后用TBS漂洗。
?山羊抗免IgG（稀释液同一抗）室温30～60min，然后用TBS洗涤。
?兔PAP复合物（稀释液同一抗）室温30min后用TBS洗涤。
?DAB－4HCl/$H_2O$（0.0125％/0.0025％）室温15min后用TBS洗。
?1％OsO4固定10～15min。水洗后用醋酸铀单染或不染。
?电镜观察。
对照实验：
?吸收实验：将足量的抗原如P物质加入抗P物质的抗血清内，离心取其上清液，用这样的血清代替一抗，结果应为阴性。
?替换试验：用正常血清为第一抗体，结果为阴性。
冷冻超薄切片免疫电镜
在包埋前免疫标记中要用化学的或物理的方法增加膜的通透性，在包埋后免疫标记条件下，
又需经化学剂脱水、包埋剂渗透聚合后再进行免疫标记，这样处理都可能对蛋白质的抗原性带来危害。采用免疫冷冻超薄切片技术可以避免这些缺点，显示上述方法所不能显示的抗原。冷冻超薄切片是用冰冻的、经过固定但未经包埋的组织切成的，在免疫标记后再将切片加以包埋，以防止切片干燥收缩引起的结构改变。该方法进行的顺序是固定、蔗糖浸泡、切片、切片收集、免疫标记和重金属染色。
在切冷冻超薄切片之前，最好先用冷冻半薄切片做免疫荧光标记以确定阳性部位。由于戊二醛能发射荧光，故凡经戊二醛固定的标本，在免疫标记前需用NaBH4阻断此作用。
冷冻超薄切片免疫标记的主要步骤。为叙述方便，抗原、抗体、蛋白质A和金颗粒分别用AG、AB、PA和g来表示。
单标记
最先进行的"阻断"或"检验"步骤是为了减弱非特异标记。一般来说，在冷冻切片中降低非特异性标记比塑料切片中容易。各种不同的蛋白质如牛血清白蛋白或明胶，已经成功地用于这个目的。最近，l％～5％的小牛或山羊血清或鱼皮明胶也被广泛应用。这里描述的免疫标记步骤使用的试剂是0.5％BSA。通常，所有的免疫标记和重金属染色步骤均在石蜡封口膜（Parafilm）上进行。
?将载网浮在0.5～l ml含0.0lmol/L甘氨酸和0.5％BSA的PBS溶液（简称PBS-BSA）中5～10min。
?将5～10μl含有第一抗体的PBS-BSA溶液滴放在Parafilm上，用抗表面张力镊子把每个载网从PBS-BSA溶液移到抗体溶液上，孵育10～30min。
?用镊子将每个载网夹到少量的PBS液滴上清洗至少1min。放置3个较大的液滴，用金属丝环将载网移至较大的液滴上，每隔3min或更长时间将载网移入其中。如果研究的对象是膜结构，则用PBS-BSA来代替PBS。
?重复以上3步骤，用第二抗体或附着3～20nm金颗粒的蛋白质A进行第二步免疫标记。?用1％的GA将载网上的切片固定10min，以加强结构的完整性和抗体或蛋白质A与切片的交联。?将网在水中清洗4次，每次2min，用于染色包埋。
平行双标记
从本质上说，它是平行地进行两个单标记，同时标记两个抗原。将由两种不同动物对两个抗原产生的两个抗体混合（如兔抗X抗体和豚鼠抗Y抗体）。按前面所述对该混合液进行第一步标记。交叉吸收两种动物IgG的抗体。将这些有标记的抗体混合，然后平行地对这两个第一抗体进行第二步标记。
GA阻断的系列多重标记
尽管上面描述的系列双标记在很多情况下进行得很好，但由于在一些情况下，蛋白质A与IgG的Fc和Fab区都发生反应，以及胶体金标记的蛋白质A与抗体的解离，会显示错误标记。Slot等（1991）利用抗体即IgG对GA敏感而某些抗原不敏感这一优点克服了这个困难。在完成第一个单标记后，用GA固定切片；这样AB1和PA都不再与下一阶段的AB2或PA
发生反应。重复此流程，即AB→PA：g→GA固定→淬灭残余的GA，这样就能成功地进行非常好的三重标记。
在这个流程中，对GA敏感的和不敏感的抗原进行标记时，对GA敏感的抗原首先标记。应该仔细分析信噪比。现在系列双标记和系列多重标记是唯一对来源于同一种动物的抗体进行双标记的可行的方法。如果抗原对GA敏感但对FA不敏感，可以用FA代替GA。
电镜原位杂交
电镜原位核酸杂交技术的原理和操作步骤与光镜原位杂交技术基本一致。杂交反应可在组织包埋前或包埋后进行，也可用在冷冻超薄切片上进行。
电镜原位杂交的准备
100×Denhardt溶液的配制：聚乙烯吡咯酮（PVP）10g，牛血清清蛋白（BSA）10g，聚蔗糖400（Ficol 400）10g，加H2O至500ml，过滤除菌，-20℃保存。
DEPC（二乙基焦碳酸酯）溶液的配制：取DEPC 1m1加入1,000m1双蒸水中，经振摇后，室温静置数小时，然后高压灭菌。
放标本的实验容器可用DEPC处理或高温180℃干烤2h。DEPC可灭活各种蛋白质，是RNA 酶的抑制剂。
包埋前原位杂交
将已完成杂交操作的标本，按照常规电镜制样方法进行包埋、超薄切片、染色、电镜观察。其操作流程为：样品→固定（多聚甲醛-戊二醛混合液）→振动切片→原位杂交→示踪标记（胶体金或酶标）→锇酸固定→脱水→包埋→超薄切片→铀铅染色→电镜观察。
包埋后原位杂交
按照包埋后免疫标记电镜技术的制样方法，取材、固定、包埋、超薄切片，然后再进行原位杂交，其操作流程为：样品→多聚甲醛（或多聚甲醛-戊二醛）固定→低温脱水→低温包埋→超薄切片→镍网捞片→原位杂交→示踪标记（胶体金或酶标）→铀铅染色→电镜观察。
不包埋原位杂交
就是将细胞悬液、染色体和冷冻切片等样品，不进行包埋、涂片或切片即直接进行原位杂交。其操作流程为：活细胞悬液、染色体、冷冻切片→固定→原位杂交→胶体金标记→电镜观察
抗体的制备，标本的处理，免疫标记，对照实验、结果的观察和解析。
抗体的制备
特异性高、亲和力强的高效价抗体是获得理想的免疫标记结果的首要条件要。抗体可购买或自己制备。大分子完全抗原，可直接免疫动物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠来获得抗体。半抗原，用偶联剂使半抗原与大分子物质结合成复合物，再去免疫动物产生抗体，大分子物质称
为载体蛋白，以甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白或血蓝蛋白最为常用。偶联剂为戊二醛或碳二酰亚胺等。目前细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体最为理想。
标本的处理
为了既能将抗原准确定位甚至定量，又能观察到近似于生活状态下的细胞超微结构，必须选择合适的固定剂，慎重处理样品。
取材
单细胞：培养细胞或血细胞应随用随取。悬浮培养细胞可先离心（800 rpm，5 min），用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗1次后进行固定。贴壁细胞则可先将其培养在玻片上，用PBS轻轻冲洗后立即固定，也可用胰酶将细胞消化下来，按悬浮培养细胞的制备方法制备。
组织：取组织块时做到越快越好，最好在没有停止血流前就取材。若观察的对象为肺、大脑、脊髓或内分泌器官等比较柔软的组织，应先做灌注固定，再用锐利的刀片将其切成约2 mm ×2 mm×l mm大小的组织块，切时要避免挤压与牵拉，然后投入到固定液中继续固定。
固定
固定剂常会对抗原的活性产生不同程度影响，为了保存细胞的超微结构和抗原的活性，应通过预试验，确定固定剂的种类、浓度、温度、pH及固定时间和方式，可用已知效价的抗原进行试验，选择合适的固定方法。
常用的免疫电镜标本固定液
多聚甲醛-戊二醛固定液（简称PG）：1％多聚甲醛对组织细胞的抗原性影响不大，若加入超过0.1％戊二醛，抗原性就会迅速减弱；当戊二醛的浓度低到0.01％～0.05％时，对抗原性的影响便不显著，而细胞超微结构的保存也可获得很大改善。所以推荐用1％多聚甲醛加0.01％～0.05％戊二醛作为免疫电镜标本的固定剂，固定时间为4～5 h。对有些抗原性较强的标本，也可采用4％多聚甲醛加0.05％～0.5％戊二醛进行固定。某些抗原对戊二醛极其敏感，固定液只能用2～4%多聚甲醛，而不能加戊二醛。不充分的固定会造成抗原提取或移位，同时醛类等交联固定剂会改变蛋白质分子的结构而影响其抗原性，所以在不明显影响抗原性的前提下，选择合适的固定浓度和时间，尽可能强一些为好。
过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛混合固定液（简称PLP）：PLP液含0.01 mol/L过碘酸钠、0.075mol/L 赖氨酸、2％多聚甲醛及0.037mol/L磷酸缓冲液。其机制是借助过碘酸盐氧化抗原，一般为糖蛋白的糖类部分，使其羟基变为醛基，这样赖氨酸的双价氨基就能与醛基结合从而把抗原交联起来。由于大多数组织抗原含蛋白质与糖类，抗原决定簇位于蛋白部分，该固定剂有选择性地固定糖类，这样既稳定了抗原，又不影响抗原决定簇与抗体的结合。加入低浓度的多聚甲醛则能稳定蛋白与脂类。因为赖氨酸价格较贵，此固定液不如PG 固定液经济。
苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液（简称PAPG）：PAPG液含4％多聚甲醛、15％（V/V）苦味酸、0.5％戊二醛、pH为7.3。苦味酸穿透迅速，可在不影响抗原活性的前提下固定蛋白质，
改善对膜和胞质的保存。特别是不能采用高浓度的戊二醛与锇酸做后固定时（如包埋后的免疫标记），在前固定液中加入苦味酸对超微结构的保存有很大帮助。
固定方法与时间
灌注固定：这是固定效果最好的方式，能使超微结构得到很好的保存。以大鼠为例，麻醉后，用注射针头经左心室向主动脉灌注固定液，静脉压为120mm Hg柱，在5～15 min内每200g 体重灌注150 ml固定液。
浸没固定：将手术或灌注后切成的标本块浸没在固定液中固定，浸没固定时间常为2～5h，游离细胞固定0.5～1h。
包埋
包埋剂类型：环氧树脂包埋剂和低温包埋剂。
包埋前免疫标记：即对已固定的样品先进行免疫标记，然后进行包埋、超薄切片并观察结果，一般选用环氧树脂包埋剂。环氧树脂本质是疏水性的，在包埋前样品必须先进行完全脱水，然后在温箱中进行热聚合。热聚合会使大多数抗原变性，因此该包埋剂不适用于包埋后免疫标记。
包埋后免疫标记：指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再进行免疫化学标记的方法，此方法多用低温包埋剂，如Lowicryl系列包埋剂、LR White包埋剂和LRGold包埋剂。这三种包埋剂均能在低温下（-35℃～-80℃）用紫外光（波长315～360nm）进行聚合，避免了高温对抗原性的负面影响，提高了阳性标记率，而且对胶体金的非特异性吸附少，对温度敏感的抗原应选择使用低温包埋剂。
免疫标记
根据免疫标记与标本包埋之间的不同关系，可分为包埋前免疫标记、包埋后免疫标记和不用包埋的冷冻超薄切片免疫标记。根据具体的标本、抗原的部位及性质并结合实验室的具体条件选择恰当的方法。这三种免疫标记方法，都包括非特异性位点的封闭、抗体与抗原特异性结合的免疫反应、反应部位的示踪显示等基本步骤。
包埋前免疫标记
优点一是切片在免疫标记前不经锇酸固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程，抗原活性不会受到上述过程的影响，而且抗原暴露充分，标记的阳性率高，非特异性反应少。二是免疫标记后还可进行半薄切片，在免疫反应阳性部位做定位超薄切片，进一步提高电镜的检出率。三是免疫标记完毕后，用戊二醛与锇酸再次固定组织，可使抗原抗体的结合更加牢固，并有利于膜结构的保存。
包埋前免疫标记主要用于细胞膜表面抗原的免疫定位，以及用于某些易被脱水剂和树脂成分溶解和变性的抗原的检测。包埋前免疫标记细胞内抗原受到标记抗体的穿透性限制，为了提
高对细胞内抗原的标记率可以采取以下措施：
厚切片
厚切片进行包埋前免疫标记，需将固定后的组织厚切片（单细胞团不需厚切片），以利于标记抗体的穿透。厚切片的方法有以下几种：
冰冻切片：用恒冷箱冰冻切片机将固定后的组织块切成8μm左右的厚片。将切下的厚片放入盛有PBS的小玻璃瓶内备用。也有的将厚片直接贴在载玻片上进行免疫标记，这样做虽然操作比较方便，但因抗体只能与厚片的一面接触，所以会在一定程度上影响标记的阳性率。
震动切片：震动切片可以切出20μm～30μm的厚片，免疫电镜用只需20μm～80μm的切片。震动切片的优点是可以避免冰冻对组织带来的损害，但它切出来的切片过厚，即使在使用穿透剂的条件下，免疫试剂也仅能穿透切片表面8μm～9μm，而更深层的组织就不易被标记。
增加细胞膜的通透性
用0.01％Saponin或0.1％Triton X-100等活性剂处理5～8min，以增加细胞膜的通透性。但这些化学物质会对超微结构产生一定程度的破坏，所以应根据不同的组织或细胞，严格控制活性剂的应用浓度与时间。也可用冻融的方法增加细胞膜通透性，标本先进行防冰晶处理（厚片在含15％甘油、20％蔗糖的PBS中振摇沉底），在液氮中速冻0.5～1min后用PBS迅速回温。
选用相对分子质量较小的标记物
辣根过氧化物酶与IgG的Fab片段交联物，分子质量较小，约100kD，较易进入细胞内。也可用IgG Fab-lnm金作为标记物，标记后经银加强染色的纳金包埋前标记法。由于该标记物较易穿透到组织和细胞内，且定位比酶标抗体精确，因此被广泛用于膜受体的精确定位。
包埋后免疫标记
包埋后免疫标记具有超微结构保存较好、方法简便可靠、阳性结果重复性高的优点，可对同一组织块的连续切片做各种对照免疫标记，能十分准确地解释免疫标记结果，而且还能在同一张切片上进行多重免疫标记，尤其适合于颗粒性标记物（胶体金标记）的免疫化学定位标记，是目前应用最广的免疫电镜技术。但是该方法也有明显的缺点，抗原在脱水、浸透及树脂包埋过程中可能被破坏，且抗原被树脂遮盖不易与抗体接触，使免疫标记的阳性率下降。尤其是后固定剂锇酸对抗原的破坏较严重，因此常常避免使用。为了得到精细的超微结构并提高阳性标记率，必须注意以下几个方面：
通过预实验确定合适的固定液，在保存抗原活性的前提下，也能得到较好的超微结构。固定液一般不用四氧化锇，因其会使抗原活性明显降低。
选用低温包埋剂。
免疫电镜用载网要选用镍网或金网，而不用铜网，因铜网会与某些化学物质产生反应而影响标记结果。
冷冻超薄切片免疫标记
冷冻超薄切片免疫电镜技术的特点是组织不经脱水包埋直接冷冻，在冷冻状态下进行超薄切片，然后进行免疫标记。该项技术克服了上述两种方法的缺点，能更理想地保存一些生物大分子的活性，极大地提高了免疫标记的敏感性，但在冷冻过程中超微结构会受到冰晶的破坏。1996 年，LiouW等改良了冷冻超薄切片技术，用甲基纤维素和醋酸铀混合液（含1.5％～2％甲基纤维素，0.3％～3％醋酸铀的水溶液）代替传统的蔗糖溶液作为将冷冻切片从冷冻槽中转移到镍网上的溶液，得到了保存良好的超微结构，使该项技术更加完美，应用也越来越广泛。但该项技术必须有特殊的冷冻超薄切片机，且技术难度较高。
对照实验
为了证实免疫标记结果的特异性，必须同时进行对照实验。在抗体的特异性无问题的前提下，对照实验有以下几种：
用未经免疫的同种动物正常血清代替第一抗体，结果应为阴性。不加一抗，结果应为阴性。用不含有靶抗原的标本进行免疫标记，结果应为阴性。对肯定含有靶抗原的标本进行免疫标记，结果应为阳性。
结果的观察和解析
在电镜下观察免疫标记的结果，通过标记物（胶体金、铁蛋白或酶底物）显示免疫反应部位以定位抗原的存在位置，注意区分特异性标记和背景的非特异性标记，进行正确的结果分析。
扫描电子显微镜生物样品制备与观察-细胞生物学实验报告
扫描电子显微镜生物样品制备与观察-细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告扫描电子显微镜生物样品制备与观察 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员：
【实验目的】 1、了解扫描电镜的基本结构与工作原理 2、了解扫描电镜的基本使用方法 3、了解临界点干燥仪的工作原理了解扫描电镜生物样品制备的基本过程 【实验原理】 扫描电镜主要用于观察样品表面几何形貌。一般扫描电镜生物样品制备过程包括取材、固定、脱水、干燥以及导电处理等步骤。取材时应尽量保护待观察的样品表面（如细胞表面、组织或器官的上皮表面等），并且避免样品表面在清洗过程中的人为损伤。一般生物样品需经干燥后才能在扫描电镜下观察。由于表面张力的作用，含水量大的生物样品在自然干燥过程中，其表面形貌将发生严重变形。 为了观察生物样品真实的表面形貌，通常采用临界点干燥法对样品进行干燥处理。当气液两
相处于临界点时，气体、液体密度相等，表面张力为零。因此，对生物样品进行临界点干燥，可以较好地保护其表面形貌。水的临界温度和压力分别为374.1℃和218.3大气压，显然，此条件下生物样品将受到严重损坏。由于CO2的临界温度和压力较低，为31.4℃和72.9大气压，故通常选择CO2作为生物样品临界点干燥的工作介质。固定、脱水后的样品需经过乙酸异戊酯处理，然后利用临界点干燥仪对样品进行干燥。 由于生物样品导电性低，未经过导电处理的样品在扫描电镜下观察时会产生荷电现象，从而影响观察和照相记录。为了减少荷电效应，对生物样品表面要进行导电处理，通常使用离子溅射仪在样品表面喷镀金属导电薄层。喷镀的金属包括：金（Au），铂（Pt）及其合金等，喷镀导电薄层厚度在10nm左右为宜。对于花粉粒等含水量较少的生物样品，可以经过自然干燥后在扫描电镜下观察。入射电子术与固体样品原子之间的相互作用 1、入射电子术与固体样品原子之间的相互作用。 具有一定的能量的电子入射固体厚样品后收到样品原子的散射，产生二次电子、背散射电
S4800扫描电镜操作说明书
冷场发射扫描电子显微镜S4800操作说明（普通用户） 燕山大学材料学院材料管A104（场发射，钨灯丝） 编写人：李月晴吕益飞 普通用户在熟练操作1个月后，如无不良记录，可申请高级用户培训。 高倍调清晰：局部放大(Red) →聚焦Focus→消像散 一、日常开机 1，开启冷却循环水电源。 2，按下Display开关至，PC自动开机进入用户界面并自动运行PC_SEM程序，以空口令登入。 3，打开信号采集开关，位置打到1，为打开。 4，打开电源插排的开关。 5，打开装有EDS软件的主机电源。 6，记录仪器运行参数(右下角Mainte)，即钨灯丝真空度。如：IP1：0.0×10-8Pa；IP2：0.0×10-8Pa； IP3：9.6×10-7Pa。PeG-1，<1×10-3；PeG-2，<1×10+2。 注意：PeG≤1×10-3Pa时才能加高压测量。记录的参数：①点Flashing时会显示：In2(Ie)Flashing时电流最大值，如32.9μA；②加上高压后会显示，V ext=3.4kV。 二、轰击（点flashing，即在阴极加额外电压） 目的：高温去除针尖表面吸附的气体 1，最好在每天开始观察样品前一时做flashing； 2，选择flashing intensity为2 ； 3，若flashing运行时Ie小于20μA，则反复执行直至Ie值超过20μA且不再增加。 4，若flashing后超过8个小时仍继续使用，重新执行flshing 。 三、加液氮 容积不要超过1L，能维持4~6h。 四、样品制备及装入 样品制备简单，对样品要求较低，只要能放进样品室，都可进行观察。 1，化学上和物理上稳定的干燥固体，表面清洁，在真空中及在电子束轰击下不挥发或变形，无放射性和腐蚀性。 2，样品必须导电，非导电样品，可在表面喷镀金膜。 3，带有磁性的样品，由于物镜有强磁性，制样必须非常小心，防止在强磁场中样品被吸入
透射电镜样品制备方法
透射电镜样品制备方法 由于电子束穿透能力限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。 在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。 一．取材的基本要求 组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞自溶现象。此外还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏，因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。 （1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（争取1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。 （2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm*1mm。也可将组织修成1mm*1mm*2mm大小长条形。因为固定剂的渗 透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的 固定。 （3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。 （4）操作最好在低温（0℃~4℃）下进行，以降低酶的活性，防
止细胞自溶。 （5）取材部位要准确。 二．取材方法 将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片将组织切下并修小，然后用牙签或者镊子将组织块移至盛有冷的固定液的1.5ml离心管中。如果组织块带有较多的血液和组织液，应先用PBS洗几遍，然后切成小块固定。 1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行） 动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一 小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1mm宽，2~3mm长的 小块并从中选出受损伤较小的小条，再将其切成1mm3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的 1.5ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）2-4小时或以 上。 *固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签 送至电镜室。 2.体外培养细胞的取材（在冰浴上进行） 培养在培养瓶中的细胞取材时，先倒出部分培养液，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将细胞悬液转移到离心管中，
扫描电镜实验报告
扫描电镜实验报告 姓名：xxx 专业：xxx 学号：xxxxxxxx 一、实验目的 1. 了解扫描电镜的构造及工作原理； 2.学习扫描电镜的样品制备； 3. 学习扫描电镜的操作； 3. 利用扫描电镜对铝粉的形貌进行观察。 二、实验原理 扫描电镜原理是由电子枪发射并经过聚焦的电子束在样品表面扫描，激发样品产生各种物理信号，经过检测、视频放大和信号处理，在荧光屏上获得能反映样品表面各种特征的扫描图像。扫描电镜由下列五部分组成，主要作用简介如下： 1．电子光学系统。其由电子枪、电磁透镜、光阑、样品室等部件组成。为了获得较高的信号强度和扫描像，由电子枪发射的扫描电子束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。常用的电子枪有三种形式：普通热阴极三极电子枪、六硼化镧阴极电子枪和场发射电子枪。前两种属于热发射电子枪；后一种则属于冷发射电子枪，也叫场发射电子枪，其亮度最高、电子源直径最小，是高分辨本领扫描电镜的理想电子源。电磁透镜的功能是把电子枪的束斑逐级聚焦缩小，因照射到样品上的电子束斑越小，其分辨率就越高。扫描电镜通常有三个磁透镜，前两个是强透镜，缩小束斑，第三个透镜是弱透镜，焦距长，便于在样品室和聚光镜之间装入各种信号探测器。为了降低电子束的发散程度，每级磁透镜都装有光阑；为了消除像散，装有消像散器。样品室中有样品台和信号探测器，样品台还能使样品做平移、倾斜、转动等运动。 2. 扫描系统。扫描系统的作用是提供入射电子束在样品表面上以及阴极射线管电子束在荧光屏上的同步扫描信号。 3. 信号检测、放大系统。样品在入射电子作用下会产生各种物理信号、有二次电子、背散射电子、特征X射线、阴极荧光和透射电子。不同的物理信号要用不同类型的检测系统。它大致可分为三大类，即电子检测器、阴极荧光检测器和X射线检测器。 4. 真空系统。镜筒和样品室处于高真空下，它由机械泵和分子涡轮泵来实现。开机后先由机械泵抽低真空，约20分钟后由分子涡轮泵抽真空，约几分钟后就能达到高真空度。此时才能放试样进行测试，在放试样或更换灯丝时，阀门会将镜筒部分、电子枪室和样品室分别分隔开，这样保持镜筒部分真空不被破坏。 5. 电源系统。其由稳压、稳流及相应的安全保护电路所组成，提供扫描电镜各部分所需要的电源。
透射电镜的样品制备方法详解
透射电镜的样品制备 透射电镜的样品制备是一项较复杂的技术，它对能否得到好的ＴＥＭ像或衍射谱是至关重要的．投射电镜是利用样品对如射电子的散射能力的差异而形成衬度的，这要求制备出对电子束＂透明＂的样品，并要求保持高的分辨率和不失真．电子束穿透固体样品的能力主要取决加速电压，样品的厚度以及物质的原子序数．一般来说，加速电压愈高，原子序数愈低，电子束可穿透的样品厚度就愈大．对于１００～２００ＫＶ的透射电镜，要求样品的厚度为５０～１００ｎｍ，做透射电镜高分辨率，样品厚度要求约１５ｎｍ（越薄越好）． 透射电镜样品可分为：粉末样品，薄膜样品，金属试样的表面复型．不同的样品有不同的制备手段，下面分别介绍各种样品的制备． （１）粉末样品因为透射电镜样品的厚度一般要求在１００ｎｍ以下，如果样品厚于１００ｎｍ，则先要用研钵把样品的尺寸磨到１００ｎｍ以下，然后将粉末样品溶解在无水乙醇中，用超声分散的方法将样品尽量分散，然后用支持网捞起即可． （２）薄膜样品绝大多数的ＴＥＭ样品是薄膜样品，薄膜样品可做静态观察，如金相组织；析出相形态；分布，结构及与基体取向关系，错位类型，分布，密度等；也可以做动态原位观察，如相变，形变，位错运动及其相互作用．制备薄膜样品分四个步骤： ａ将样品切成薄片（厚度１００～２００微米），对韧性材料（如金属），用线锯将样品割成小于２００微米的薄片；对脆性材料（如Ｓｉ，ＧａＡｓ，ＮａＣｌ，ＭｇＯ）可以刀将其解理或用金刚石圆盘锯将其切割，或用超薄切片法直
接切割． ｂ切割成φ３ｍｍ的圆片用超声钻或ｐｕｎｃｈｅｒ将φ３ｍｍ薄圆片从材料薄片上切下来． ｃ预减薄使用凹坑减薄仪可将薄圆片磨至１０μｍ厚．用研磨机磨（或使用砂纸），可磨至几十μｍ． ｄ终减薄对于导电的样品如金属，采用电解抛光减薄，这方法速度快，没有机械损伤，但可能改变样品表面的电子状态，使用的化学试剂可能对身体有害．对非导电的样品如陶瓷，采用离子减薄，用离子轰击样品表面，使样品材料溅射出来，以达到减薄的目的．离子减薄要调整电压，角度，选用适合的参数，选得好，减薄速度快．离子减薄会产生热，使样品温度升至１００～３００度，故最好用液氮冷却样品．样品冷却对不耐高温的材料是非常重要的，否则材料会发生相变，样品冷却还可以减少污染和表面损伤．离子减薄是一种普适的减薄方法，可用于陶瓷，复合物，半导体，合金，界面样品，甚至纤维和粉末样品也可以离子减薄（把他们用树脂拌合后，装入φ３ｍｍ金属管，切片后，再离子减薄）．也可以聚集离子术（ＦＩＢ）对指定区域做离子减薄，但ＦＩＢ很贵．对于软的生物和高分子样品，可用超薄切片方法将样品切成小于１００ｎｍ的薄膜．这种技术的特点是样品不会改变，缺点是会引进形变．（３）金属试样的表面复型即把准备观察的试样的表面形貌（表面显微组织浮凸）用适宜的非晶薄膜复制下来，然后对这个复制膜（叫做复型）进行透射电镜观察与分析．复型适用于金相组织，断口形貌，形变条纹，磨损表面，第二相形态及分布，萃取和结构分析等． 制备复型的材料本身必须是＂无结构＂的，即要求复型材料在高倍成像时也
扫描电镜实验报告要求
扫描电镜实验报告要求 第一部分：实验预习报告 一、实验目的、意义 1、了解扫描电镜的基本结构与原理 2、掌握扫描电镜样品的准备与制备方法 3、掌握扫描电镜的基本操作并上机操作拍摄二次电子像 4、了解扫描电镜图片的分析与描述方法 二、实验基本原理与方法 1、扫描电镜的基本结构构造 2、扫描电镜的工作原理 3、扫描电镜成像原理 三、主要仪器设备及耗材 1、JSM-5610 LV扫描电镜 2、JFC-1600离子溅射仪（样品喷涂导电层用） 3、银导电胶、双面胶（制样用） 4、粉末样品、块状样品 四、实验方案与技术路线 1、介绍扫描电镜的基本情况与最新进展（场发射扫描电镜、环境扫描电镜的特点及应用） 2、结合具体仪器介绍扫描电镜的构造与工作原理； 3、重点介绍扫描电镜样品的准备与制备方法，并要求每位同学动手制样，掌握扫描电镜样 品的准备与制备方法； 4、了解扫描电镜的操作过程，掌握二次电子像的观察过程，要求每位同学上机操作，并在 2-4个样品上拍摄2-4张二次电子像图片，要求图片清晰有代表性； 5、仔细观察和分析现场给出的200多张图片，并对某类或某几张自己感兴趣的图片进行描 述（要求总字数150字以上）。 第二部分：实验过程记录 一、实验原始记录 按实验过程进行记录： 1、样品的准备与制备过程 2、仪器操作过程与照片的拍摄过程。 第三部分：结果与分析 一、实验结果与分析 1、现场没描述照片的同学，对“附件二、扫描电镜图片”进行微观形态描述（要求：写清 楚图片或样品名称，不需要打印照片，描述图片张数自己确定，总字数要达到150字以上）； 2、将2-4张自己拍摄的照片打印并粘贴到实验报告上，写上样品名称。 3、总结对扫描电镜实验课的体会。
扫描电镜SEM制样步骤
扫描电镜S E M制样步 骤 -CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
扫描电镜观察制样步骤 固定： 1、用灭菌镊子挑出少量的的样品（碳粒/碳毡）,放入 5ml 的离心管中, 2、加入2.5%戊二醛, 加量为淹没碳粒/碳毡样品为宜,室温固定1小时 3、置于 4℃冰箱中固定12小时。 冲洗： 用 0.2mol pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗 3 次，每次 10 分钟。每次冲洗时先用注射器缓慢吸走上一步骤的冲洗液。Or 离心 脱水： 分别用浓度为30%， 50%，75%，90%, 95%, 100% v/v 的乙醇进行脱水，每次10分钟， 干燥： 将样品放在离心管里，置入干燥器中干燥 12 小时。粘样：用双面胶将样品观察面向上粘贴在扫描电镜铜板上 预处理好的样品放入干净离心管中待检。 SEM上机测样--测定条件参数设置 分子克隆实验指南第三版，1568页： 25度下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制； 先配0.1mol/L K2HPO4，0.1mol/L KH2PO4 配PH7.4，100ml磷酸钾缓冲液需： 0.1mol/L K2HPO4，80.2ml 0.1mol/L KH2PO4，19.8ml 混合即是，不用酸碱调PH。 参考文献： DOI:?10.1021/es902165y Microbial fuel cell?based on Klebsiella pneumoniae biofilm Selecting?anode-respiring bacteria based on?anode?potential: phylogenetic, electrochemical, and?microscopic?characterization A severe reduction in the cytochrome C content of?Geobacter sulfurreducens?eliminates its capacity for extracellular electron transfer 2
扫描电镜生物样品制备步骤
扫描电镜样品制备方法 一、取材 组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。 二、固定 前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。 用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。 后固定：1% 锇酸固定液，固定1-2小时。 用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。 三、脱水 ＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。 ＊整个过程，样品不要暴露于空气。 1.乙醇脱水，每一级10-20分钟： 30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇； 2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上； 此系列操作均在25度环境中进行； 3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。 四、冷冻干燥 ＊需事先预约冷冻干燥时间； 第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。 五、喷金
附件1： 细菌类样品的前处理方法 1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。玻 片过大或者过厚影响观察效果。 2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰 箱固定2小时左右。 3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。离心去PBS，固体沉 淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。 4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的 玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。 将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。 （样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。 5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入 干燥杯开始进行脱水。
电镜切片样品制作步骤知识讲解
A 悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等； 细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降2~3天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。 B贴壁培养的细胞： 在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4℃3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。 C组织取材 样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右； 样品表面在固定前必须清洁：使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。能够明确标识标本的观察面。消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。 如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗； 固定2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4℃固定3h以上，换PBS送检。 附：2.5%戊二醛的配制 Step 1: 0.2M磷酸缓冲液的配制： --------------------- 磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克 磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克 双蒸馏水加至500毫升 pH调至7.4 Step 2: 戊二醛固定液的配制： --------------------- 25% 戊二醛1ml 双蒸馏水4ml 0.2mol/L磷酸缓冲液5ml 戊二醛最终浓度 2.5% pH值7.3-7.4
无机非金属材料扫描电镜的制样流程
无机非金属材料扫描样品的制备流程 样品要求：试样经切割和磨抛处理成适宜扫描电镜观察的大小后还应进行喷金或蒸碳处理，使其导电。 切割设备：沈阳科晶自动化设备有限公司生产适用于无机非金属材料切割的的金刚石线切割机的型号有STX-202A、STX-1202A、STX-202AQ、STX-603、STX-2401、STX-402、STX-2017种。 外圆切割机的型号有：SYJ-400、SYJ-200、SYJ-150、SYJ-160、SYJ-800、SYJ-506 种。可根据材料的大小、切割的具体要求选择合适的切割设备。 耗材：金刚石线切割机用的各类直径的金刚石线、外圆切割机用的各类锯片、切割专用油、切割冷却粉、油石。 切割辅助设备：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的MTI-3040和MTI-250加热平台，设备操作简单，温度≤200℃。 耗材：陶瓷树脂衬垫、石蜡 试样的镶嵌：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的适用于无机非金属材料的冷镶嵌机的型号为CXQ-2500。 耗材：水晶胶、硬性冷镶模、软性冷镶模、弹性样品夹（冷镶嵌） 样品的磨抛：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的手动研磨抛光机型号有UNIPOL-820、UNIPOL-830、UNIPOL-1210三种。自动精密研磨抛光机型号有UNIPOL-810、 UNIPOL-802、UNIPOL-1202、UNIPOL-1502四种。自动压力研磨抛光机型号有 UNIPOL-1000D、UNIPOL-1200S、UNIPOL-1200M、UNIPOL-800M、UNIPOL-1260五种。及 双面研磨抛光机UNIPOL-160D一种。 耗材：砂纸、金刚石磨片、树脂基金刚石磨片、研磨纸、研抛底片、磨料、抛光垫、抛光液、抛光膏、磁力橡胶 样品的清洗：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的超声波清洗机的型号有VGT-1620QTD、VGT-1620TD 两种。等离子清洗设备的型号有PCE-6、PCE-8两种。可根据样品自身的特性选择合适 的清洗方法。 样品表面喷金和蒸碳：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的GSL-1800X-ZF2小型蒸镀仪，VTC-16-3HD 3溅射蒸镀膜仪是电镜实验室喷金和蒸碳常用的最佳设备。 耗材：靶材 样品观察：将已经导电的试样用导电双面胶粘接到载样台上之后就可以用扫描电子显微镜进行观察了。 以上设备和对应耗材沈阳科晶自动化设备有限公司均有销售。
扫描电镜的样品制备
3.1 试样制备技术 试样制备技术在电子显微术中占有重要的地位，它直接关系到电子显微图像的观察效果和对图像的正确解释。如果制备不出适合电镜特定观察条件的试样，即使仪器性能再好也不会得到好的观察效果。 和透射电镜相比，扫描电镜试样制备比较简单。在保持材料原始形状情况下，直接观察和研究试样表面形貌及其它物理效应（特征），是扫描电镜的一个突出优点。扫描电镜的有关制样技术是以透射电镜、光学显微镜及电子探针X射线显微分析制样技术为基础发展起来的，有些方面还兼具透射电镜制样技术，所用设备也基本相同。但因扫描电镜有其本身的特点和观察条件，只简单地引用已有的制样方法是不够的。扫描电镜的特点是： ①观察试样为不同大小的固体（块状、薄膜、颗粒），并可在真空中直接进行观察。 ②试样应具有良好的导电性能，不导电的试样，其表面一般需要蒸涂一层金属导电膜。 ③试样表面一般起伏（凹凸）较大。 ④观察方式不同，制样方法有明显区别。 ⑤试样制备与加速电压、电子束流、扫描速度（方式）等观察条件的选择有密切关系。 上述项目中对试样导电性要求是最重要的条件。在进行扫描电镜观察时，如试样表面不导电或导电性不好，将产生电荷积累和放电，使得入射电子束偏离正常路径，最终造成图像不清晰乃至无法观察和
照相。 3.1.1 块状试样制备 1．导电性材料 导电性材料主要是指金属，一些矿物和半导体材料也具有一定的导电性。这类材料的试样制备最为简单。只要使试样大小不得超过仪器规定（如试样直径最大为φ25mm，最厚不超过20mm等），然后用双面胶带粘在载物盘，再用导电银浆连通试样与载物盘（以确保导电良好），等银浆干了（一般用台灯近距离照射10分钟，如果银浆没干透的话，在蒸金抽真空时将会不断挥发出气体，使得抽真空过程变慢）之后就可放到扫描电镜中直接进行观察。但在制备试样过程中，还应注意： ①为减轻仪器污染和保持良好的真空，试样尺寸要尽可能小些。 ②切取试样时，要避免因受热引起试样的塑性变形，或在观察面生成氧化层。要防止机械损伤或引进水、油污及尘埃等污染物。 ③观察表面，特别是各种断口间隙处存在污染物时，要用无水乙醇、丙酮或超声波清洗法清理干净。这些污染物都是掩盖图像细节，引起试样荷电及图像质量变坏的原因。 ④故障构件断口或电器触点处存在的油污、氧化层及腐蚀产物，不要轻易清除。观察这些物质，往往对分析故障产生的原因是有益的。如确信这些异物是故障后才引入的，一般可用塑料胶带或醋酸纤维素薄膜粘贴几次，再用有机溶剂冲洗即可除去。 ⑤试样表面的氧化层一般难以去除，必要时可通过化学方法或
电镜切片样品制作步骤
扫描电镜样品的准备 A悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等； 细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量 2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降2~3天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。 B贴壁培养的细胞： 在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4℃3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。 SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。 C组织取材 样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右； 样品表面在固定前必须清洁： 使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。能够明确标识标本的观察面。消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。 如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗；固定 2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4℃固定3h以上，换PBS送检。 附： 2.5%戊二醛的配制
Step 1: 0.2M磷酸缓冲液的配制：--------------------- 磷酸二氢钠（NaH2PO 4.H2O） 2.6xx 磷酸氢二钠(Na2HPO 4.12H2O)29xx 双蒸馏水加至500毫升pH调至 7.4 Step 2: 戊二醛固定液的配制： --------------------- 25%戊二醛1ml 双蒸馏水4ml 0.2mol/L磷酸缓冲液5ml 戊二醛最终浓度 2.5% pH值 7.3-
扫描电镜样品制备程序
扫描电镜样品制备程序 一、固定：戊二醛-锇酸双固定法 1．2.5%戊二醛（试剂1）固定4小时（或者过夜） 2．0.1M 磷酸缓冲液（试剂2）清洗3次，每次15-30分钟 3．1%锇酸（试剂3）固定2-4小时 4．0.1M 磷酸缓冲液（试剂2）清洗3次，每次15分钟 二、脱水：乙醇系列 1．30%乙醇15－20分钟 2．50%乙醇15－20分钟 3．70%乙醇15－20分钟 4．80％乙醇15－20分钟 5．90%乙醇15－20分钟 6．95%乙醇15－20分钟 7.100%乙醇两次每次15-20分钟 三、置换： 乙酸异戊酯2次，每次15分钟（或过夜）。 四、干燥： 临界点干燥 五、离子溅射金 六、扫描电镜观察 附注：试剂配置 试剂1：2.5%戊二醛 取0.2M磷酸氢二钠40.5mL（A液），0.2M磷酸二氢钠9.5mL（B液），混合均匀（即0.2M磷酸盐缓冲液pH7.4），加入10mL浓度为25%的戊二醛，用超纯水稀释至100mL。 试剂2：0.1M 磷酸缓冲液（pH 7.4） A液：0.2M磷酸氢二钠 称取3.561g Na2HPO4.2H2O（或者5.365g Na2HPO4.7H2O）; 或7.164g Na2HPO4.12H2O)，溶于100mL双蒸水中。 B液：0.2M磷酸二氢钠 称取2.760g NaH2PO4.H2O（或者3.121g NaH2PO4.2H2O），溶于100mL双蒸水中。 量取A液36.0mL, B液14.0mL，混合均匀后用双蒸水稀释至100mL，得0.1M 磷酸缓冲液（pH 7.4）。 试剂3：1%锇酸 将2%的锇酸溶液与0.1M磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）等体积混合，得1%锇酸。 注意：该操作在通风橱中进行。
扫描电镜实验报告记录
扫描电镜实验报告记录
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HUNAN UNIVERSITY 姓名：扫描电镜实验报告 姓名：高子琪 学号： 201214010604
一.实验目的 1.了解扫描电镜的基本结构与原理； 2.掌握扫描电镜样品的准备与制备方法； 3.掌握扫描电镜的基本操作并上机操作拍摄二次电子像； 4.了解扫描电镜图片的分析与描述方法。 二．实验设备及样品 1.实验仪器：D5000-X衍射仪 基本组成：1）电子光学系统：电子枪、聚光镜、物镜光阑、样品室等 2）偏转系统：扫描信号发生器、扫描放大控制器、扫描偏转线圈 3）信号探测放大系统 4）图象显示和记录系统 5）真空系统 2.样品：块状铝合金 三.实验原理 1.扫描电镜成像原理 从电子枪阴极发出的电子束，经聚光镜及物镜会聚成极细的电子束（0.00025微米-25微米），在扫描线圈的作用下，电子束在样品表面作扫描，激发出二次电子和背散射电子等信号，被二次电子检测器或背散射电子检测器接收处理后在显象管上形成衬度图象。二次电子像和背反射电子反映样品表面微观形貌特征。而利用特征X射线则可以分析样品微区化学成分。 扫描电镜成像原理与闭路电视非常相似，显像管上图像的形成是靠信息的传送完成的。电子束在样品表面逐点逐行扫描，依次记录每个点的二次电子、背散射电子或X射线等信号强度，经放大后调制显像管上对应位置的光点亮度，扫描发生器所产生的同一信号又被用于驱动显像管电子束实现同步扫描，样品表面与显像管上图像保持逐点逐行一一对应的几何关系。因此，扫描电子图像所包含的信息能很好地反映样品的表面形貌。 2.X射线能谱分析原理 X射线能谱定性分析的理论基础是Moseley定律，即各元素的特征X射线频率ν的平方根与原子序数Z成线性关系。同种元素，不论其所处的物理状态或化学状态如何，所发射的特征X射线均应具有相同的能量。
透射电镜常规样品制备流程
透射电镜样品制备流程 由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法： 一．负染色技术 负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。 样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。 操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。 二、超薄切片技术 超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。具体操作步骤、注意事项如下： 1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。⑤泡在前固定液的材料最多可以放2周。 2．漂洗：用1M PBS Buffer Ph 7.2冲洗3次，每次15mins。 3．后固定：加入1％锇酸处理到样品变黑。植物样品一般处理2.5hours，真菌、细菌一般处理2hours，动物样品处理1hours。注意事项：①锇酸剧毒物质，易挥发，操作时要在毒品柜中谨慎使用。②锇酸比较昂贵，需特别节约使用。
电镜样品制备方法中英文(常用_
No.1 扫描电镜样品制备方法 样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：?倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； ?用1%的锇酸溶液固定样品1-2h； ?倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； ?用梯度浓度（包括30%,50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙 醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20 min。 ?用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V/V=1/1）处理样品30min，再用纯醋酸 异戊酯处理样品1-2h。 ?临界点干燥。 ?镀膜，观察。 处理好的样品在Hitachi TM-1000型扫描电镜中观察。 1.Double fixation: The specimen was first fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer (pH7.0) for more than 4hours; washed three times in the phosphate buffer; then postfixed with 1% OsO4 in phosphate buffer (pH7.0) for 1hour and washed three times in the phosphate buffer. 2.Dehydration: The specimen was first dehydrated by a graded series of ethanol (30%,50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%) for about 15 to 20 minutes at each step, transferred to the mixture of alcohol and iso-amyl acetate (v:v=1:1) for about 30 minutes, then transferred to pure iso-amyl acetate for about 1hour. In the end, the specimen was dehydrated in Hitachi Model HCP-2 critical point dryer with liquid CO2. 3.Coating and observation: The dehydrated specimen was coated with gold-palladium and observed in Philips Model TM-1000 SEM. No.2 Negative staining of bacterium The bacterium suspension was stained by 1 to 2%solution of phosphotungstic acid (PTA) in a pH range of 6.5 to 7.0 for 15 to 30 seconds. Then, the bacterium was observed in TEM of Model JEM1230. No.3透射电镜样品制备方法 样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：?倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； ?用1%的锇酸溶液固定样品1-2h； ?倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； ?用梯度浓度（包括30%,50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙 醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇
透射电镜粉末样品制备方法
一、样品要求 1．粉末样品基本要求 （1）单颗粉末尺寸最好小于1μm； （2）无磁性； （3）以无机成分为主，否则会造成电镜严重的污染，高压跳掉，甚至击坏高压枪； 2．块状样品基本要求 （1）需要电解减薄或离子减薄，获得几十纳米的薄区才能观察； （2）如晶粒尺寸小于1μm，也可用破碎等机械方法制成粉末来观察； （3）无磁性； （4）块状样品制备复杂、耗时长、工序多、需要由经验的老师指导或制备；样品的制备好坏直接影响到后面电镜的观察和分析。所以块状样品制备之前，最好与TEM的老师进行沟通和请教，或交由老师制备。 二、送样品前的准备工作 1．目的要明确：（1）做什么内容（如确定纳米棒的生长方向，特定观察分析某个晶面的缺陷，相结构分析，主相与第二相的取向关系，界面晶格匹配等等）；（2）希望能解决什么问题； 2．样品通过X-Ray粉末衍射（XRD）测试、并确定结构后，再决定是否做HRTEM；这样即可节省时间，又能在XRD 的基础上获得更多的微观结构信息。 3．做HRTEM前，请带上XRD数据及其他实验结果，与HRTEM老师进行必要的沟通，以判断能否达到目的；同时HRTEM老师还会根据您的其他实验数据，向您提供好的建议，这样不但能满足您的要求，甚至使测试内容做得更深，提高论文的档次。 三、粉末样品的制备 1．选择高质量的微栅网（直径3mm），这是关系到能否拍摄出高质量高分辨电镜照片的第一步；（注：高质量的微栅网目前本实验室还不能制备，是外购的，价格20元/只；普通碳膜铜网免费提供使用。） 2．用镊子小心取出微栅网，将膜面朝上（在灯光下观察显示有光泽的面，即膜面），轻轻平放在白色滤纸上； 3．取适量的粉末和乙醇分别加入小烧杯，进行超声振荡10~30min，过3~5 min 后，用玻璃毛细管吸取粉末和乙醇的均匀混合液，然后滴2~3滴该混合液体到微
扫描电镜原理、方法及操作
一、分析测试步骤 开机 1、接通循环水（流速～2.0L/min ） 2、打开主电源开关。 3、在主机上插入钥匙，旋至“Start ”位置。 松手后钥匙自动回到“on ”的位置，真空系统开始工作。 4、等待10秒钟，打开计算机运行。 5、点击桌面的开始程序。 6、点击［JEOL ·SEM ］及［JSM-5000主菜单］。 7、约20分钟仪器自动抽高真空，真空度达到后，电子枪自动加高压，进入工作状态。 8、通过计算机可以进行样品台的移动，改变放大倍数、聚焦、象散的调整， 直到获得满意的图像 9、对于满意的图像可以进行拍照、存盘和打印。 10、若需进行能谱分析，要提前1小时加入液氮，并使探测器进入工作状态。 11、打开能谱部分的计算机进行谱收集和相应的分析。 12、需观察背散射电子像时，工作距离调整为15mm ，然后插入背散射电子探测器，用完后 随时拔出。 更换样品 1、点击“HT on ”,出现“HT Ready ”。 2、点击“Sample ”,再点击“Vent ”。 3、50秒后拉出样品台,从样品台架上取出样品台. 4、更换样品后,关上样品室门,再点击“EVAC ”,真空系统开始工作,重复开机10.1.8、。 关机 1、点击［EXIT ］,再点击［OK ］,扫描电镜窗口关闭,回到视窗桌面上. 2、电击桌面上的［Start ］。
3、退出视窗,关闭计算机. 4、关闭控制面板上的电源开关. 5、等待15分钟后关掉循环水. 6、关掉总电源. 二. 方法原理 1、扫描电镜近况及其进展 扫描电子显微镜的设计思想和工作原理，早在1935年已经被提出来了，直到1956年才开始生产商品扫描电镜。商品扫描电镜的分辨率从第一台的25nm提高到现在的，已经接近于透射电镜的分辨率，现在大多数扫描电镜都能同X 射线波谱仪、X 射线能谱仪和自动图像分析仪等组合，使得它是一种对表面微观世界能够进行全面分析的多功能的电子光学仪器。数十年来，扫描电镜已广泛地应用在材料学、冶金学、地矿学、生物学、医学以及地质勘探，机械制造、生产工艺控制、产品质量控制等学科和领域中，促进了各有关学科的发展。随着纳米材料的出现，原有的钨灯丝扫描电镜由于分辨率低，不能满足纳米材料分析检测的要求，之后，电镜生产厂家推出了场发射扫描电子显微镜，使扫描电镜的分辨率提高到了。场发射扫描电子显微镜又分为冷场场发射扫描电子显微镜和热场场发射扫描电子显微镜，它们的共性是分辨率高。热场发射扫描电镜的束流大且稳定，适合进行能谱分析，但维护成本和要求高；冷场发射扫描电镜的束流小且不稳定，适合于做表面形貌观察，不适合能谱分析，相对而言维护成本和要求要低一些。环境扫描电镜的特点是对于生物样品、含水样品、含油样品，既不需要脱水，也不必进行导电处理，可在自然的状态下直接观察二次电子图像并分析元素成分。 2、扫描电镜的特点 能够直接观察样品表面的微观结构，样品制备过程简单，对样品的形状没有任何限制，粗糙表面也可以直接观察； 样品在样品室中可动的自由度非常大，可以作三度空间的平移和旋转，这对观察不规则形状样品的各个区域细节带来了方便； 图象富有立体感。扫描电镜的景深是光学显微镜的数百倍，是透射电镜的数十倍，故所得到的图象立体感比较强； 放大倍数范围大，从几倍到几十万倍连续可调。分辨率也比较高，介于光学显微镜和
透射电镜样品的制备方法(精)
试验材料为经过热处理后的钢材! 一、样品要求 1.粉末样品基本要求 (1)单颗粉末尺寸最好小于1μm; (2)无磁性; (3)以无机成分为主，否则会造成电镜严重的污染，高压跳掉，甚至击坏高压枪; 2.块状样品基本要求 (1)需要电解减薄或离子减薄，获得几十纳米的薄区才能观察; (2)如晶粒尺寸小于1μm，也可用破碎等机械方法制成粉末来观察; (3)无磁性; (4)块状样品制备复杂、耗时长、工序多、需要由经验的老师指导或制备;样品的制备好坏直接影响到后面电镜的观察和分析。所以块状样品制备之前，最好与TEM的老师进行沟通和请教，或交由老师制备。 二、送样品前的准备工作 1.目的要明确：(1)做什么内容(如确定纳米棒的生长方向，特定观察分析某个晶面的缺陷，相结构分析，主相与第二相的取向关系，界面晶格匹配等等);(2)希望能解决什么问题; 2.样品通过X-Ray粉末衍射(XRD)测试、并确定结构后，再决定是否做HRTEM;这样即可节省时间，又能在XRD的基础上获得更多的微观结构信息。 3.做HRTEM前，请带上XRD数据及其他实验结果，与HRTEM老师进行必要的沟通，以判断能否达到目的;同时HRTEM老师还会根据您的其他实验数据，向您提供好的建议，这样不但能满足您的要求，甚至使测试内容做得更深，提高论文的档次。 三、粉末样品的制备 1.选择高质量的微栅网(直径3mm)，这是关系到能否拍摄出高质量高分辨电镜照片的第一步;(注：高质量的微栅网目前本实验室还不能制备，是外购的，价格20元/只;普通碳膜铜网免费提供使用。) 2.用镊子小心取出微栅网，将膜面朝上(在灯光下观察显示有光泽的面，即膜面)，轻轻平放在白色滤纸上; 3.取适量的粉末和乙醇分别加入小烧杯，进行超声振荡10~30min，过3~5 min 后，用玻璃毛细管吸取粉末和乙醇的均匀混合液，然后滴2~3滴该混合液体到微栅网上(如粉末是黑色，则当微栅网周围的白色滤纸表面变得微黑，此时便适中。滴得太多，则粉末分散不开，不利于观察，同时粉末掉入电镜的几率大增，严重影响电镜的使用寿命;滴得太少，则对电镜观察不利，难以找到实验所要求粉末颗粒。建议由老师制备或在老师指导下制备。)