绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究

绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方华，曹钰，陆健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有9条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。

富集后的图谱中只有4条带在免培养图谱中能找到对应的位置。

通过土豆培养基、察氏培养基和麦曲浸提液培养基对麦曲中的真菌进行分离，共得到24株真菌。

三种培养基分离得到的纯种数目和菌落数分别为8种、18种、11种和4.7×104 cfu/g 曲、1.4×104 cfu/g曲、8.4×104 cfu/g曲。

不同的培养基分离出来的优势菌不一样，每一种培养基都能检测到其它培养基所不能检测到的优势菌株。

必须联合使用多种培养基才能最大限度和更加准确的分离和了解麦曲中的真菌及其群落结构。

关键词：绍兴黄酒；麦曲；微生物群落结构；DNA提取；核糖体基因间隔区分析(RISA)前言麦曲在黄酒的酿造过程中起着非常重要的作用。

它是在一定的地理环境和生长条件下，通过制曲工艺的驯化，其中的微生物不断的发生着有序的消长和变化，逐步形成稳定的微生物区系。

分析微生物在麦曲中的区系分布和其中微生物菌群的系统发育，对于理解制曲过程中的微生物和周边环境的相互关系，建立麦曲微生物生态数据库，实现麦曲微生态系统的人工模拟和异域再现具有重要的指导意义。

国内对黄酒麦曲中的微生物尤其是真菌从筛选产酶的角度进行过研究，通过传统的分离培养方法[1]对真菌的种类进行分类鉴定，操作方法繁琐、周期较长，而且对鉴定者经验要求较高。

而对于麦曲中的微生物群落结构以及微生物种群之间的相互影响的关系，即微生物生态还未见研究报告。

目前，微生物生态学的研究有两个主要趋势：一方面，结合传统研究方法和各种分子生物学技术对不同环境的微生物群落进行研究，使人们能更加客观地认识环境中微生物的自然存在状况；另一方面，加强对各种复杂环境微生物的研究，希望从中发现更多新的微生物及基因资源，了解微生物对特定环境的适应机制，为合理利用和保护微生物资源奠定基础。

因此，本章采用不同的培养基对黄酒麦曲中可培养真菌进行系统分离和初步研究，同时比较不同培养基的分离能力。

通过大规模的平板稀释分离，将得到的不同种的真菌采用扩增真菌的内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS）保守序列，测定其序列组成，然后通过序列比对的方式对未知真菌进行鉴定。

另外，采用免培养的方法对麦曲中的真菌进行分离鉴定，通过比较，以综合利用这两种方法，更加客观准确地了解和掌握麦曲中真菌的群落结构。

1. 材料与方法1.1 麦曲样品的收集与保存黄酒麦曲样品采自绍兴黄酒厂某分厂的成品麦曲JH。

样品采集完成后转入无菌塑料袋中带回实验室。

分别取两块平行样品，粉碎，混合均匀，得到均一样品后，称取500 g放入塑料袋中，保存于4 ℃备用。

1.2 分离培养基土豆琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、定容至1000 mL、pH自然。

察氏培养基（CPK）：NaNO3,2 g、K2HPO4, 1 g、KCl, 0.5 g、MgSO4·7H2O, 0.5 g、FeSO4·7H2O, 0.01 g、蔗糖30 g、定容至1000 mL。

麦曲浸提液培养基(WQE): 500 g 粉碎的麦曲样品，加入1500 mL蒸馏水，100 ℃煮沸1 h 后，用四层纱布过滤，0.1 MPa下灭菌20 min备用[2]。

三种培养基中均添加去氧胆酸100 mg/L、链霉素3 × 104 U/L分别抑制菌丝的蔓延和细菌的生长，各培养基的固态培养基琼脂的添加量均为15 g/L，0.1 MPa下灭菌20 min。

1.3分离培养条件取10 g均一麦曲样品，加入到90 mL磷酸盐缓冲液中(PBS, 137 mmol/LNaCl, 2.7 mmol/L KCl, 4.3 mmol/L NaH2PO4·7H2O, 1.4 mmol/L KH2PO4, pH 7.0)，轻轻振荡10 min。

取上清液分别用PBS作梯度稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。

平板稀释分离：取不同稀释度的样品100 μL，分别涂布于对应的固态培养基上，每个稀释度作五个平行。

其间进行平板菌落计数，表示单位为cfu/g干曲。

然后根据菌落大小、形态和颜色等表型特征进行初步区分，分离纯化，得到纯种菌株。

液态培养基富集：取不同稀释度的样品1 mL 分别接入(接种量为10%, v/v)到装有9 mL各种培养基(PDA, CPK 和WQE)的试管中，在30℃下振荡培养2天。

1.4分离获得的真菌的鉴定1.4.1真菌基因组DNA的提取采用氯化苄抽提真菌DNA[3]：用接种环刮取一环纯种斜面的孢子于土豆液体培养基中，30℃摇瓶过夜。

将摇瓶培养物抽滤后，收集菌丝体，超纯水洗涤3遍后，转入7 mL离心管中，加入2.5 mL 提取液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0; 40 mmol/L EDTA，pH 8.0; 2% SDS)振荡混匀后，再加入1 mL 10% SDS和2 mL氯化苄，50℃保温1 h(每10 min上下颠倒混匀)，加入1 mL 3 mmol/L的NaAc，冰浴15 min，9,800×g离心15 min，取上清，加入等体积的异丙醇，室温放置20 min，9,800×g离心15 min，弃上清，加入70%乙醇洗涤，离心15 min，弃上清，室温放置15 min后，加入50 µL TE溶解。

0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4.2 ITS-PCR扩增真菌的ITS(内转录间隔区)序列扩增参照White等[4]的方法。

采用引物对pITS1：5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，pITS4：5’ - TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’来扩增真菌的ITS 保守序列。

PCR扩增的反应体系为：50 µL的总反应体积中含有1 µL dNTP(10 mmol/L)，5 µL 10×Buffer，10 mmol/L的MgCl2，2.5 U的Taq酶(上海申能博彩生物技术公司)，引物pITS1、pITS4各10 pmol/L，DNA模板量1 μL。

扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。

PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外成像系统拍照。

1.4.3 ITS-PCR产物胶回收割下含目的DNA片段的琼脂糖凝胶(尽量小)，放入1.5 mL的离心管中，采用小量琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜生物工程公司)对PCR产物进行纯化，具体操作步骤见说明书。

1.4.4 PCR纯化产物与pUCm-T载体连接连接体系为10 µL。

在微型离心管中加入以下成分：1.0 µL的10 ×连接酶缓冲液和1.0 µL的T4连接酶，pUCm-T Vector 1.0 µL，纯化后的PCR产物7.0 µL。

16℃连接过夜。

1.4.5转化采用CaCl2法预先大量制备E.coli JM109的感受态细胞，取出一支100 µL已制备好的保存在-70℃超低温冰箱中的感受态大肠杆菌，放在冰上，加入DNA连接液10 µL，冰上放置30 min。

然后42℃, 热击90 s。

取出0℃，放置2 min。

加入LB液体培养基400 µL，37℃摇床150 r/min，振荡培养45 min。

将离心管中的液体9,800 ×g离心1 min，用枪吸掉300 µL，剩余的菌液用枪混匀后全部涂布在含Amp、IPTG、X-Gal (终浓度均为100 mg/mL) 的LB固体平板上，37℃培养过夜。

1.4.6 阳性克隆子的挑选与质粒抽提观察培养皿上的转化子的生长状况，在超净台上用接种针从每个培养皿上挑取5个白色克隆子，接入含有Amp+(终浓度均为100 mg/mL)的LB液体培养基小试管中，37℃，180 r/min摇床上培养8 h。

将培养好的细菌全部倒入2 mL的离心管中，9,000 ×g离心1 min。

弃上清，得到菌体进行质粒抽提，具体操作步骤见说明书。

提取的质粒放在-20℃保存备用。

1.4.7 质粒PCR法验证插入片段以上述抽提的质粒为模板，用质粒PCR法验证插入片段是否有插入片段。

PCR扩增条件参照1.4.2。

1.4.8 序列测定将含插入片段的质粒，送往宝生物(大连)生物工程公司进行序列测定。

1.4.9 系统发育学分析从NCBI (National Center for Biotechnology Information)数据库中选取一些已知的序列，采用Clustal X 软件（ver. 1.8）将已知序列和测得的序列进行多重序列比对，比对完成后用MEGA生物软件(ver 3.1)中的邻接法构建系统发育树。

1.5麦曲中真菌的核糖体内转录基因间隔区分析(RISA)1.5.1 免培养法和液态富集培养后菌体总DNA的提取免培养法：称取1.0 g均一的麦曲样品于7 mL离心管中，加入提取缓冲液，采用氯化苄抽提样品的总DNA。

具体操作方法参照1.4.1。

液态富集培养法：液态培养结束后，菌悬液于10,000 ×g离心10 min 收集菌体，总DNA的提取方法参照1.4.1。

1.5.2 麦曲样品的RISA图谱分析以1.5.1方法中得到的总DNA为模版分别进行PCR扩增，具体扩增条件参照1.4.2。

PCR产物经PCR Purification Kit(上海华舜生物工程有限公司)纯化后，进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳。

100V电泳12 h。

电泳结束后，溴化乙锭染色15 min。

去离子水洗15 min，紫外系统成像拍照后，用手术刀割下胶中的各条带，放置于1.5 mL的离心管中，供回收DNA使用。

1.5.3 回收条带的克隆和序列测定在装有回收条带的离心管中加入50 µL的洗脱缓冲液[5](500 mmol/L乙酸铵，10 mmol/L乙酸镁，1mmol/L EDTA，0.1% SDS)，37℃水浴5 h，12,000 ×g离心10 min，取上清，用PCR Purification Kit 回收DNA。

然后以纯化的DNA为模板，进行克隆测序，以下操作步骤参照1.4.4-1.4.8所述。

1.5.4 ITS序列的比对和同源性分析测序结果经DNAMAN 3.0软件去载体后，将序列提交GenBank数据库，利用Blastn软件进行序列比对，将所得序列提交GenBank数据库获得登录号。