氯化钴模拟法构建骨骼肌细胞缺氧模型
缺氧环境对宫颈腺癌细胞增殖和迁移的影响及其作用机制
缺氧环境对宫颈腺癌细胞增殖和迁移的影响及其作用机制刘艳; 李月洁; 黄小环; 龚莉; 周铁军【期刊名称】《《山东医药》》【年(卷),期】2019(059)031【总页数】5页(P46-50)【关键词】宫颈腺癌; 缺氧环境; 缺氧诱导因子2α; 血管内皮钙黏蛋白; 细胞增殖;细胞迁移【作者】刘艳; 李月洁; 黄小环; 龚莉; 周铁军【作者单位】西南医科大学附属医院四川泸州646000; 重庆三峡医药高等专科学校【正文语种】中文【中图分类】R737.33在全球范围内，宫颈癌的发病率和病死率均居女性恶性肿瘤的第四位，是严重威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一[1]。
宫颈癌的发病机制非常复杂，目前尚不完全清楚。
缺氧是实体肿瘤微环境的基本特征之一，在肿瘤的生长、转移和治疗抵抗等方面发挥重要作用[2～4]。
肿瘤的缺氧适应主要通过缺氧诱导因子(HIF)调节来实现。
HIF主要有3种亚型，分别为HIF-1、HIF-2、HIF-3，其中参与调节细胞适应性缺氧的主要是HIF-1、HIF-2[5]。
这3种HIF均是由一个α亚基和一个β亚基构成的异源二聚体蛋白复合物[6]。
但迄今为止，关于HIF-2的研究较少。
本课题组前期研究发现，在宫颈腺癌组织中HIF-2α表达明显升高，表明HIF-2α可能在宫颈腺癌的发生、发展中具有一定作用。
血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)是血管内皮细胞黏附连接的主要分子，是维持血管内皮细胞极性和完整性必不可少的内皮细胞特异性钙黏蛋白。
有研究发现，HIF-2α可通过与VE-cadherin相互作用，促进肿瘤血管生成，继而促进胰腺癌进展[7]。
但在缺氧环境中HIF-2α是否通过与VE-cadherin相互作用来促进宫颈腺癌进展尚不清楚。
2014年9月～2015年4月，本研究通过氯化钴(CoCl2)干预建立宫颈腺癌细胞缺氧模型，观察了缺氧环境对宫颈腺癌细胞增殖和迁移的影响并初步探讨其可能的作用机制。
枸杞多糖对缺氧损伤PC12细胞保护作用-申志远,张兆辉
69第16卷 第8期 2014 年 8 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 16 No. 8 Aug .，2014枸杞多糖对缺氧损伤PC12细胞保护作用申志远，张兆辉（武汉大学人民医院神经内科，湖北 武汉 430060）摘 要：目的：研究枸杞多糖对缺氧损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤株PC12的保护作用。
方法：采用氯化钴（CoCl 2）建立PC12细胞，通过测定受损细胞给药后的活力、受损细胞LDH 泄露量和受损细胞ROS 生成量及线粒体膜电位，研究枸杞多糖对受损细胞的保护作用。
结果：枸杞多糖能显著增加缺氧模型细胞的活力；降低细胞LDH 泄漏量；增强缺氧损害细胞的SOD 活性；并增加缺氧损害细胞线粒体膜电位。
结论：枸杞多糖对缺氧损伤PC12细胞具有明显的保护作用。
关键词：枸杞多糖；PC12细胞；缺氧损伤中图分类号：R743.31 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2014) 08- 0069- 03收稿日期：2014-02-20作者简介：申志远（1981-），男，湖北襄阳人，主治医师，硕士研究生，研究方向：神经内科疾病。
通讯作者：张兆辉（1963-），男，湖北武汉人，教授、主任医师，硕士研究生导师，博士，研究方向：神经内科疾病。
Protective Effects of Polysacchrides of Lycium Barbarumon Anoxia Injury in Cultured PC12 CellsSHEN Zhiyuan，ZHANG Zhaohui（Department of Neurology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，Hubei，China）Abstract：Objective ：To investigate the protective effect of polysacchrides of Lycium barbarum on anoxia injury in cultured PC12 cells. Methods ：Cultured PC12 cells were treated with 150 μmol/L cobalt dichloride in combination with glucose deprivation. The protective effect of polysacchrides of Lyciumbarbarum on the model was evaluated by celluar survival rate，lactatedehydrogenate（LDH）efflux assay，content of SOD and mitochondrial membrane potential. Results ：Lycium barbarum polysacchrides significantly increased the celluar survival rate，reduced releases of LDH，increased activites of SOD and mitochondrial membrane potential in PC12 cells during hypoxia injury. Conclusions ：Lycium barbarum polysacchrides have a remarkably protective effect on anoxia injury in cultured PC12 cells.Key words：Lycium barbarum polysacchrides；PC12 cells；anoxia injury部被充分吸收，加速ATP 和ADP 相互转变释放化学能，穴位局部ATP 能量代谢较3壮灸组高，达到热量的最佳转移，故而测得的最高温度较3壮灸组明显升高。
利用低氧／厌氧工作站建立H9c2细胞缺氧复氧模型的探讨
利用低氧／厌氧工作站建立H9c2细胞缺氧复氧模型的探讨储倩雯;李伟秋;鲁诗史;黄丹梅;张艳美【摘要】目的：利用低氧／厌氧工作站，结合不同的缺氧条件，探讨建立H9c2细胞缺氧复氧（hypoxia／reoxygenation， H／R）模型的最佳方法。
方法缺氧时将H9c2细胞置于低氧／厌氧工作站中，分别以完全培养基，无糖培养基和酸性缺氧液培养1、2、4、6、8 h，缺氧后换用完全培养基于培养箱中按常规条件培养1 h。
流式细胞仪测定细胞内活性氧（ reactive oxygen species ，ROS）含量，噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测细胞生存率，倒置显微镜下观察H9c2细胞形态变化。
结果与对照组比较，缺氧时以完全培养基和无糖培养基处理的H9c2细胞H／R后，细胞内ROS含量和细胞存活率随缺氧时间延长无明显改变，且倒置显微镜下未观察到明显的形态变化。
缺氧时以酸性缺氧液处理的H9c2细胞，随H／R时程的延长，细胞内ROS含量不断增加（P＜0.01），且细胞存活率逐渐降低（P＜0.01），倒置显微镜下观察到细胞H砄1 h／R：1 h后开始出现部分细胞皱缩，少量坏死细胞漂浮，随时间延长损伤加重；缺氧8h后，细胞皱缩成圆形，大量坏死细胞漂浮，复氧1h后可见细胞膜表面不平滑，复氧液中仍有少量坏死细胞漂浮。
结论采用低氧／厌氧工作站，并结合酸性缺氧液，可成功建立重现性非常好的H9 c2细胞H／R模型。
%Objective To investigate optimal method of establishing hypoxia/reoxygenation(H/R) model ofH9c2 cell by using hypoxia/anoxic workstation under different conditionsin hypoxia.Methods H9c2 cell was placed into hypoxia/anoxic workstation and simultaneously cultured with complete medium, glucose-free DMEM and acidic hypoxic solution for 1,2,4,6 and 8 h respectively, and then reoxygenated with complete medium for 1 h in normoxic incubator.Thelevel of ROS was measured by flow cytometry.The cell viability was detected by MTT assay.The cellular morphology was observed by inverted microscope.Results With the extension of cell hypoxia time, there were no significant differences in the ROS level and cell viability in complete medium-and glucose-free DMEM-treated H/R groups compared with control group(P<0.05).There was no obvious morphologic change observed with inverted microscope, either.Nevertheless, when H9c2 cells were treated with acidic hypoxic solution in hypoxia, the ROS level continuously increased and the cell viability decreased with the extension of cell hypoxia time ( P<0.01 ).Since H:1 h/R:1 h, some of the cells shrunk and a few necrotic cells floated in the media under the inverted microscope , and the damage was aggravated with the extension of hypoxia time.After the cells were exposed in hypoxia for 8 h, they wrinkled to be round and a large number of floating necrotic cells were observed.When the cells were reoxygenated for 1 h, the cytomembrane was not smooth and there were still a few necrotic cells floating in culture dish .Conclusion The H9c2 cell H/R model with good repeatability can be established successfully by using hypoxia/anoxic workstation combining with acidic hypoxic solution.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2015(000)011【总页数】4页(P11-14)【关键词】低氧/厌氧工作站;H9 c2细胞;缺氧复氧模型【作者】储倩雯;李伟秋;鲁诗史;黄丹梅;张艳美【作者单位】汕头大学医学院药理教研室，广东汕头 515041;汕头大学医学院分析细胞实验室，广东汕头 515041;汕头大学医学院第一附属医院药剂科，广东汕头 515041;汕头大学医学院药理教研室，广东汕头 515041;汕头大学医学院药理教研室，广东汕头 515041【正文语种】中文【中图分类】R363心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)损伤是心脏缺血性疾病和心脏外科手术后常见的一种病理生理现象。
氯化钴对急性下肢缺血大鼠模型缺氧诱导因子1α表达的影响
氯 化 钻 可 以增 加 缺 血 肢 体 骨 骼 肌 的 ＨＩ － ａ的 表 达 ， Ｆ１
续 均 匀 切 片 ，切 片 厚 度 ６ ｍ，０ １ ５ 胰 蛋 白 酶 ． ２
果， 尤其是 那 些 “ 解 ” 者 ， 高 龄 、 情 危 重 、 无 患 即 病 无 法耐 受有创 治 疗 ， 病 变远 侧 端 无 合 适 流 出道 ， 或 无 搭桥 或腔 内治疗 指 征 的患 者 ， 治疗 效 果更 差 。对 于
肤 、 合切 口， 缝 不处 理血 管 。 １２ ２ 分 组 ２ ． ． ０只 大 鼠随 机均 分 为 ４组 ： 手术 ＋ 氯化 钴 、 手术 ＋生 理盐 水 、 手术 ＋氯 化钴 、 假 假手 术 ＋ 生 理 盐 水。 术 后 １ ｄ 腹 腔 注 射 氯 化 钴 （０ｍｇ ｋ ） 或 等容积生 理盐水 。 ６ ／ ｇ ， １ ３ 监 测时 间点及 部位 ． 术前 １ｄ 术 后第 １天（ 、 腹 腔注射 氯化钴 ／ 生理 盐水 之 前 ） 第 ２ ４ ６天 ， 穿 及 ，， 用 刺活检 枪 于左 下 肢腓 肠 肌 处 穿 刺 活 检 。标 本 经 甲 醛 固定 后 ， 蜡包埋 。 石 １ ４ ＨＩ －ａ免疫 组织化 学染 色 ． Ｆｌ 蜡块 用切 片机 连
股 动 脉 结扎 手术 可 增 加 术 侧 肢 体骨 骼 肌 ＨＩ－Ｃ 表 达 （一 ５ ９３ Ｐ一 ０ ０ ０ ， 血 肢 体 经 氯 化 钴 处 理 后 ＨＩ－ Ｆ１ 的 ｔ ｔ ．６ ， ． ０ ）缺 Ｆ
ｌ 的表 达 明显 高 于 对 照 组 （ － １ ． ７ ， ＜ Ｏ ０ ） 结论 Ｆ－ ８ ０ ４ Ｐ ． ５ 。 可 望 用 于 治疗 肢 体 动 脉 闭 塞 症 。 关 键 词 ： 钴 ； 氧 诱 导 因 子 １ ｎ亚 基 ； 脉 闭 塞性 疾 病 ；股 动 脉 ；缺血 ； 肢 ； 氧 ； 病 模 型 ， 缺 ， 动 下 缺 疾 动物
氯化钴诱导hiPSC-CMs体外缺氧模型的建立
浙江理工大学学报，2021,45(1)：84-93Journal of Zhejiang Sci-Tech UniversityDOI：10.3969力.issn.l673-3851(n),2021.01.011氯化钻诱导hiPSC-CMs体外缺氧模型的建立朱梦怡-柯敏霞I,王皓齐念民益3,吴月红(1.浙江理工大学生命科学与医药学院，杭州310018；2.杭州标模生物科技有限公司，杭州310018；3.上海丽坤生物科技股份有限公司，上海201499)摘要：为进一步了解缺氧性心血管疾病的发病机制.通过使用CHIR99021和IWP2抑制剂的组合诱导和单层诱导分化方法获得人诱导性多能干细胞来源心肌细胞(Human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs).并在hiPSC-CMs的培养系统中加入氯化祐进行处理，通过CCK-8检测,Hoechst荧光染色分析、台盼蓝染色分析、qRT-PCR检测和Western blot检测确定最佳处理浓度和时间。
CCK-8检测结果显示，低浓度CoCl2(100,300M mol/L)处理显著提高hiPSC-CMs细胞活力(/><0.01),高浓度CoCl2(900,1200M mol/L)处理显著抑制hiPSC-CMs细胞活力(p<0.001).并且作用趋势呈剂量和时间依赖性，600M mol/L CoCl2处理对于hiPSC-CMs的细胞活力影响不明显(/><0.05)；Hoechst荧光染色结果显示,CoCl2处理24h和48h后，低浓度CoCl2处理对细胞无影响，Hoechst染色阳性细胞数量少(p>0.05),高浓度CoCl2处理剂量依赖性增加阳性细胞数量(^<0.0001),且48h处理组的结果与24h处理组无显著差异；台盼蓝染色结果表明,CoCl2处理可剂量依赖性促进细胞凋亡；CoCl2处理后，促凋亡相关基因Bax和蛋白Bax表达呈剂量依赖性上调(/><0.001),抗凋亡相关基因B4-2和蛋白Bcl-2表达呈剂量依赖性下调(p<0.OODsCoCb处理可剂量依赖性促进hiPSC-CMs细胞的凋亡。
氯化钴对人eNOS基因启动子转录活性的影响
氯化钴对人eNOS基因启动子转录活性的影响樊振华;邢飞跃【期刊名称】《暨南大学学报（自然科学与医学版）》【年(卷),期】2009(030)004【摘要】目的:建立氯化钴诱导的人脐静脉血管内皮细胞-12(HUVEC-12)缺氧模型,研究人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因的启动子活性变化.方法:用含不同浓度氯化钴的培养基培养细胞,检测细胞培养上清中的乳酸脱氢酶(LDH)含量;将已构建的pGL2-eNOS-p质粒转染HUVEC-12细胞,利用双荧光素酶报告基因技术检测在不同浓度氯化钴和不同作用时间下的eNOS启动子转录活性.结果:氯化钴刺激下HUVEC-12细胞培养上清的LDH含量随氯化钴作用浓度增加而提高;氯化钴刺激后转染细胞的eNOS启动子活性呈现随氯化钴剂量增加而升高的趋势,随作用时间的延长而上升的趋势.结论:成功建立氯化钴诱导HUVEC-12细胞缺氧的体外模型.【总页数】4页(P379-382)【作者】樊振华;邢飞跃【作者单位】暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫中心,广东,广州,510632;暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫中心,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】R392.12【相关文献】1.异丙酚对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞内皮源型一氧化氮合酶基因启动子转录活性的影响 [J], 陈绪贵;古妙宁;王卓强2.氯化钴对人的e NOS基因启动子S P1改构体转录活性的影响 [J], 杨云华;樊振华;邢飞跃3.siRNA干扰p38α上调人血管eNOS基因启动子转录活性 [J], 王宝玉;邢飞跃;刘娜;李卓;唐征乐4.P38α对人血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响 [J], 刘娜;邢飞跃5.小鼠Na+-K+-2Cl-共转运蛋白基因启动子克隆及20-HETE对其转录活性的影响[J], 武晶晶;孔令慧;贾茹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
氯化钴浓度不同对原代脑微血管内皮细胞增殖与缺氧诱导因子HIF-1α
2019 年第 6 卷第 43 期2019 Vol.6 No.43167临床医药文献电子杂志Electronic Journal of Clinical Medical Literature氯化钴浓度不同对原代脑微血管内皮细胞增殖与缺氧诱导因子HIF-1α表达的研究邵玉红，刘 晶，杨 柳（塔里木油田医院体检部检验科，新疆 巴音郭楞 841000）【摘要】目的 研究不同浓度的氯化钴（CoCl 2）对原代脑微血管内皮细胞（BMECs ）细胞增殖和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达的影响。
方法 利用不同浓度的CoCl 2建立原代脑微血管内皮细胞缺氧模型。
结果 MTT 显示CoCl 2对BMECs 细胞增殖抑制作用表现出浓度依赖性抑制作用。
免疫印迹法显示HIF-1α的蛋白表达水平在（50、100、400、800）μmol/L ，HIF-1α在细胞中的表达与CoCl 2浓度0 μmol/L 没有差异改变（P ＞0.05），当其浓度达到200 μmol/L 时，与对照组CoCl 2浓度为0 μmol/L 相比，HIF-1α表达有显著差异 （P ＜0.01）。
结论 CoCl 2可抑制细胞的增殖，同时通过CoCl 2建立的化学法缺氧的模型能够体外引起BMECs 细胞导致HIF-1α上调；通过上调HIF-1α可增加对脑微血管内皮细胞的损害，为下一步耐缺氧脑损伤药物实验奠定基础。
【关键词】氯化钴；缺氧诱导因子-1【中图分类号】R743 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-8242.2019.43.167.01脑微血管内皮细胞（B M E C s ）作为构成血脑屏障（BBB ）[1]的主要结构基础[2]，在中枢神经系统中的血管内外物质交换中发挥着重要的作用。
因此体外培养BMECs 为研究脑血管疾病提供了一种新的方法[3]。
1 材料1.1 材料和试剂SD 大鼠20只，ECM 培养基；胎牛血清；氯化钴；β-actin 鼠单克隆抗体、HIF-1α兔多克隆抗体、HRP 标记的 二抗。
氯化钴诱导神经细胞缺氧损伤的机制及应用
（ Ｖ ｏ ｎ Ｈｉ ｐ ｐ ｅ ｌ — Ｌ ｉ ｎ ｄ ａ ｕ ｔ ｕ ｍ ｏ ｒ ｓ ｕ ｐ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｏ ｒ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ， ｐ Ｖ ＨＬ ）
根据 其 Ｆ ｅ 是否与 Ｏ 结 合 而 分 为 氧 合 和 脱 氧 状 态， 缺氧 时它 通过 转 变 为 脱 氧合 状 态 来 感 受 细 胞 缺 氧， 然 后 经信 息传 递 引起 缺 氧 相 关 基 因的 转 录 。 当
到 目前 为 止 已 发 现 ６ ０多 种 基 因 的 调 控 与 Ｈ Ｉ Ｆ 一 １
有 关 。
素 中的 Ｆ ｅ “， 使类 血红 素 不 能 和氧 结 合 而保 持 脱 氧
状态 ， 从 而模 拟缺 氧 ¨ ； 另一 方 面 ， ｃ ｏ “会 置 换 催 化 基 团上 的 Ｆ ｅ Ｈ， 从 而 阻止 脯 氨酸 羟 化 酶 和天 冬 氨 酸
细胞 内 的氧 感 受器 类血 红素 蛋 白及 一些催 化酶 中的 Ｆ ｅ 、 Ｈ Ｉ Ｆ表达 增 多 、 Ｒ Ｏ Ｓ蓄 积等都 密切 相 关。 本 文就 Ｃ ｏ Ｃ １ 诱 导 神经 细胞缺 氧 的可 能机 制及 应用 作 一综述 。 关键 词 Ｃ ｏ Ｃ １ ２ ； 神 经细胞 ； 缺 氧模 型 ； 机制 ； 应用
节过 程 中处 于关 键 地 位 。１ ９ ９ ２年 ， Ｓ ｅ ｍ ｅ ｎ ｚ ａ等 在 缺 氧诱 导 的细 胞核 粗 提 液 中发 现 了 ＨＩ Ｆ 一 １ ，它 主要 由
稳定而成为诱导神经细胞 慢性缺氧损 伤的首选药
物， 本文将从 Ｃ ｏ Ｃ １ 诱 导 神 经 细 胞 缺 氧损 伤 的机 制
羟化 酶 的活性 ， 抑 制 ＨＩ Ｆ － １ 的降解 ， ＨＩ Ｆ 一 １ ０ 【 聚集 后 引起 缺 氧损 伤作 用 Ｊ 。 此外 ， ｃ ｏ 也 可 以作 为 亚 铁 螯合 酶 的底 物 ， 亚 铁 螯 合 酶 是将 铁 合成 亚 铁 血 红 素 的重 要 的参 与酶 ， ｃ ０ 作 为 底 物参 与合 成 后 可 使 新
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氯化钴模拟法构建骨骼肌细胞缺氧模型李晰;辛世杰;王磊;宋泽;荆玉辰;曹辉;段志泉;张健【摘要】目的观察CoCl2对体外培养的原代骨骼肌细胞的影响,探讨合理的体外化学模拟低氧模式.方法利用组织贴块法培养并鉴定原代骨骼肌细胞,给予CoCl2处理,观察不同时间和浓度细胞凋亡情况,以及通过免疫印迹及实时定量聚合酶链反应检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、BAX的表达变化情况.结果与对照组比较,CoCl2处理组的细胞存活率明显下降(P＜0.05),凋亡率明显增加(P＜0.05),且骨骼肌细胞存活率下降程度及细胞凋亡率增加程度均随着氯化钴浓度增加时间延长而升高.HIF-1α、BAX蛋白水平亦随CoCl2浓度升高和时间延长而增加.结论 CoCl2对原代骨骼肌细胞的增殖凋亡及相关基因的表达成呈时间和浓度依赖性,成功建立起一种体外培养原代骨骼肌细胞缺氧诱导模型,可以作为体外研究骨骼肌缺血缺氧的良好模型.【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(卷),期】2014(043)003【总页数】4页(P265-268)【关键词】氯化钴;骨骼肌细胞;凋亡;低氧诱导因子1α【作者】李晰;辛世杰;王磊;宋泽;荆玉辰;曹辉;段志泉;张健【作者单位】中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001【正文语种】中文【中图分类】R654.3下肢动脉闭塞症是常见的下肢动脉闭塞性疾病，由于下肢缺血时动脉血流减少、组织因缺血等发生不可逆性损伤。
细胞坏死、萎缩和间质纤维化等导致骨骼肌损伤。
目前对这种肌肉缺血性变化尚无良好的治疗方法。
缺血与缺氧常常是相互伴随的，各种研究表明显示，在哺乳系统中，二氯化钴是已经被广泛应用的模拟缺氧环境的化学试剂，能够产生与缺氧缺血相似的反应［1］。
因此，为了进一步探讨骨骼肌在缺血缺氧过程中变化机制，我们利用原代骨骼肌细胞在二氯化钴不同浓度和处理时间情况下研究细胞的增殖、活力、凋亡及缺氧相关反应基因的变化，以便建立一个可靠、重复性高、检测方便的骨骼肌缺氧诱导模型，为探索及防治下肢动脉硬化闭塞症奠定基础。
1.1 材料2～3 d新生SD大鼠，雌雄不限（中国医科大学实验动物中心提供）；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（HyClone，美国）；α横纹肌肌动蛋白、TRITC标记的山羊抗兔IgG（博奥森，中国）；低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）抗体、BAX抗体、GAPDH抗体（Santa Cruz公司，美国）；Real-time PCR试剂盒（TaKaRa公司，日本）；CoCl2、MTT、二甲基亚砜（Sigma，美国）。
1.2 方法1.2.1 原代骨骼肌细胞培养：应用原代细胞培养方法，2～3 d新生SD大鼠通过机械剥离骨骼肌。
骨骼肌剪碎成许多小片，放置于含10%胎牛血清的DMEM，使其贴在培养瓶表面。
肌细胞从肌组织爬出，几天后相互融合。
原代细胞应用含EDTA 的胰酶消化传代。
以5×104密度将细胞接种于培养皿，给予氯化钴不同浓度（0、50、100、200、400 μmol/L）和不同时间（0、4、8、12、24 h）处理。
1.2.2 细胞免疫荧光鉴定：免疫荧光染色在以每孔104个细胞密度接种于24孔板。
细胞经PBS清洗甲醇固定，5%BSA封闭，兔抗横纹肌肌动蛋白（1∶200）和TRITC标记的山羊抗兔IgG（1∶100）。
细胞核用Hoechst 33258染色，成像使用激光共聚焦显微镜（FV1000S-SIM/IX81，Olympus）。
1.2.3 实时定量聚合酶链反应：按照日本TaKaRa公司说明书，采用Trizol处理剪碎的组织并提取总RNA，根据日本TaKaRa公司逆转录试剂盒说明书进行逆转录。
应用日本TaKaRa RR420A试剂盒来研究HIF-1α的表达，反应条件为：95℃预变性30 s；95℃5 s，60℃30 s，40个循环，HIF-1α上游引物为5′-TTGAAGATGTCCCGTTGTA-3′；下游引物为5′-GTGACTCTGGGCTTGACTCTA-3′。
内参GAPDH上游引物为5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′；下游引物为5′-ATGGTGGTGAAGACGCCA-3′。
超纯水代替cDNA作为对照。
PCR产物的质量监控PCR扩增后的熔融曲线分析。
目的基因的表达量通过2-ΔCt方法进行统计。
1.2.4 免疫印迹：细胞在裂解液中充分裂解，于冰上静止15 min后12 000g离心30 min。
蛋白含量通过紫外分光光度计检测（UV3103 PYE UNICAM），每个样本上样量40 μg，配置10%聚丙烯酰胺凝胶，煮样后电泳、PVDF膜转膜、5%脱脂牛奶封闭1 h，HIF-1α一抗（1∶100）、BAX一抗（1∶200）、GAPDH为内参（1∶1000），4℃孵育过夜。
洗膜后，以二抗（1∶5 000）室温孵育，清洗后ECL发光，应用Quantity One软件计算光密度值。
1.2.5 MTT检测：MTT 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，Sigma，美国）来检测二氯化钴（Sigma，美国）处理的肌细胞。
细胞经过0.05%的胰蛋白酶消化并计数，以每孔100 μL 5 000个细胞铺至96孔板中过夜。
细胞给予氯化钴不同浓度（0、50、100、200、400 μmol/L）和不同时间（0 h、4 h、8 h、12 h、24 h），加入20 μL MTT（每毫升5 mg溶于PBS）于37℃培养4 h。
随后除去培养基，每孔加入100 μL二甲基亚砜10 min，使结晶物溶解。
酶标仪检测各孔OD值（检测波长570 nm）。
1.3 数据统计学分析数据均用表示，至少3次以上独立实验，应用SPSS 19.0软件对实验数据进行单因素方差统计分析（SPSS，Chicago，IL，美国），P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 原代骨骼肌细胞的培养及鉴定倒置显微镜下观察原代骨骼肌细胞，培养3～4 d后开始有细胞逐渐爬出，随后开始增生，细胞逐渐延展成梭形（图1A）。
细胞逐渐增多并相互融合，按一定方向呈有序排列（图1B）。
我们利用横纹肌肌动蛋白进行免疫荧光染色，胞质染成红色，表明培养的为骨骼肌细胞（图1C）。
2.2 氯化钴对原代骨骼肌细胞存活及凋亡的影响MTT结果显示，终浓度为200 μmol/L CoCl2培养不同时间后，骨骼肌细胞存活率随着时间延长而降低；在不同浓度处理后，骨骼肌细胞的凋亡率也随着浓度的增加而增加。
同样，免疫印迹发现促凋亡蛋白BAX也具有相同的趋势（图2，P＜0.05）。
2.3 氯化钴对原代骨骼肌细胞HIF-1α的影响经200 μmol/L CoCl2处理0、4、8、12和24 h，发现HIF-1α基因和蛋白水平上逐渐升高；同样地，HIF-1 α基因和蛋白表达增高与CoCl2浓度正相关（图3、4，P＜0.05）。
目前国内各实验室广泛使用简易密封舱模拟缺氧模型，不足之处是不能控制缺氧程度，不便于观察氧分压，而且不便于控制温度，通入的气体未经过滤，有污染的危险性。
氯化钻模拟缺氧是国际上比较常用的模拟缺氧的方法，钴离子能竞争氧感受器—血红蛋白卟啉环中的铁离子，抑制氧合血红蛋白的形成而丧失与O2结合的能力，诱发一系列类似缺氧反应，从而模拟缺氧状态［2］。
有研究表明经过氯化钴处理后而引起的一系列基因变化与缺氧微环境的影响是相似的，可能是经过相同的信号转导途径来调控，包括一些基因转录水平的变化，如HIF-1α、p53、p21和PCNA。
而目前已经证实在维持氧平衡的调节中，HIF-1α是一个主要的调节因子，能在基因转录水平调节细胞对缺氧的适应性［3］。
本研究观察氯化钴对原代培养骨骼肌细胞凋亡的影响及HIF-1α的表达变化，结果显示与对照组比较，经CoCl2处理的细胞存活率明显下降（P＜0.05），凋亡率明显增加（P＜0.05），且肌细胞存活率下降程度及细胞凋亡率增加程度均随CoCl2浓度增加和时间延长而逐渐升高，免疫印迹显示促凋亡蛋白BAX具有逐渐升高的趋势反映CoCl2对骨骼肌细胞凋亡作用。
有趣的是，HIF-1α基因和蛋白水平亦随CoCl2浓度升高和时间延长而增加。
尽管CoCl2介导HIF-1α蛋白稳定的机制还没有完全阐明，但普遍认为氯化钴是HIF-1α的非缺氧激活的一种方式，其一机制是金属钴离子取代脯氨酸羟化酶催化中心的亚铁离子，抑制脯氨酸残基的羟化作用，同时氯化钴影响抑癌基因产物pVHL而抑制pVHL与HIF-1 α之间的相互作用［4］，二种机制均是使HIF-lα不被泛素化及其在蛋白酶体中的降解而变得稳定，表达因而增加。
而凋亡的发生主要是由内在（线粒体）通路引起线粒体膜高通透性，不仅是线粒体呼吸链活性的丧失，导致细胞色素C释放而诱导凋亡［5］。
本实验同样证实以往研究，氯化钴诱导缺氧与多种细胞增殖和凋亡密切相关，以及凋亡相关因子表达的显著变化。
HIF-1α为缺氧应答的全局性调控因子，在缺氧诱导的哺乳动物细胞中广泛表达，对缺氧具有特异感受性，参与体内许多缺氧反应性基因的转录调节，在低氧性介导的细胞凋亡中有着重要的作用。
然而，HIF-1α是否刺激细胞凋亡或抗凋亡，这一结论还不清楚。
不同的研究得出不同结论［6～8］。
一些数据显示过表达HIF-1α能够显著抑制Mdm2阻止泛素化稳定p53进而促进凋亡［8］。
相反的，关于HIF-1α抗凋亡的作用，还有学者发现过表达HIF-1α能够降低缺氧所引起的细胞凋亡，在低氧应激中发挥抗凋亡蛋白的作用［10］。
因此HIF-1α与凋亡之间相互作用仍需要进一步研究，但我们可以肯定的是，HIF-1α在缺氧组织发生凋亡失调中发挥重要作用，总之，CoCl2化学模拟低氧过程中伴随着对细胞增殖和凋亡的复杂影响，也影响缺氧主要调节因子HIF-1α蛋白水平，因此以氯化钴用于构建模拟原代骨骼肌细胞缺氧诱导模型是可行的。
【相关文献】［1］Grasselli F，Basini G，Bussolati S，et al.Cobalt chloride，a hypoxiamimicking agent，modulates redox status and functional parameters of cultured swine granulosa cells ［J］.Reprod Fertil，2005，17（7）：715-720.［2］Vengellur A，Woods BG，Ryan HE，et al.Gene expression profiling of the hypoxia signaling pathway in hypoxia-inducible factor 1alpha null mouse embryonic fibroblasts ［J］.Gene Expr，2003，11（3-4）：181-197.［3］Semenza GL.HIF-1 and human disease：one highly involved factor［J］.Genes Dev，2000，14（16）：1983-1991.［4］Yuan Y，Hilliard G，Ferguson T，et al.Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha［J］.J Biol Chem，2003，278（18）：15911-15916.［5］Brenner D，Mak TW.Mitochondrial cell death effectors［J］.Curr Opin Cell Biol，2009，21（6）：871-877.［6］Liu XH，Kirschenbaum A，Yao S，et al.Up-regulation of vascular endothelial factor by cobalt chloride-simulated hypoxia is mediated by persistent induction of cyclooxygenase-2 in metastatic human prostate cancer cell line［J］.Clin Exp Metastasis，1999，17（8）：687-694.［7］Gwak GY，Yoon JH，Kim KM，et al.Hypoxia stimulates proliferation of human hepatoma cells through the induct ion of hexokinaseⅡexpression［J］.J Hepatol，2005，42（3）：358-364.［8］Zhang B，Guo W，Yu L，et al.Cobalt chloride inhibits tumor formation in osteosarcoma cells through upregulation of HIF-1α［J］.Oncol Lett，2013，5（3）：911-916.［9］Chen DL，Li MY，Luo JY，et al.Direct interactions between HIF-1 alpha and Mdm2 modulate p53 function［J］.J Biol Chem，2003，278（16）：13595-13598.［10］Yu EZ，Li YY，Liu XH，et al.Antiapoptotic action of hypoxia-inducible factor-1 alpha in human endothelial cells［J］.Lab Invest，2004，84（5）：553-561.。