脂肪酶的产生菌的分离生产及其运用

四、酶的固定化
在一定的pH缓冲液中，加入一定量的酶液，搅拌搅拌使 在一定的pH缓冲液中，加入一定量的酶液，搅拌搅拌使 其充分溶解，选用一定量的吸附载体（石英砂。琼脂粉、 CM-sephsrose、DEAE-sepharose以及phenylCM-sephsrose、DEAE-sepharose以及phenylSepharose)加入酶液中，恒温水浴搅拌一定时间后，离 Sepharose)加入酶液中，恒温水浴搅拌一定时间后，离 心手机固体，将固定化载体用缓冲液洗3~5次，室温下干 心手机固体，将固定化载体用缓冲液洗3~5次，室温下干 燥。再配制一定浓度的海藻酸钠溶液，向其中加入已吸附 了脂肪酶的载体，中速充分搅拌，使之混匀，用微量注射 器逐滴滴入到一定浓度20mlCaCl2溶液中，4 器逐滴滴入到一定浓度20mlCaCl2溶液中，4 ℃下固化
脂肪酶产生菌的分离及 脂肪酶生产和运用
一、脂肪酶及其应用前景
脂肪酶是一类特殊的酯键水解 酶，它可以在 油——水界面上将油脂水解成甘油和脂肪。在微 ——水界面上将油脂水解成甘油和脂肪。在微 生物及动植物体内普遍存在。目前已发现多种具 有不同酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶， 其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中 都表现出较好的应用前景。脂肪酶广泛运用于食 品加工及风味改革、油脂水解、皮革绢纺原料脱 脂、化妆、洗涤、医药、能源等领域。
反应式：
脂肪酶
植物油+ ——————生物柴油 植物油+水——————生物柴油
采用气相色谱内标法分析产品，不锈钢填充柱2 采用气相色谱内标法分析产品，不锈钢填充柱2 m×3 mm，固定相OV一17，载气为干燥的氮气， mm，固定相OV一17，载气为干燥的氮气， 燃气为高纯氢气，用压缩空气作助燃气；色谱工 作参数设定值：炉温150(1)25/M280(5)，检测 作参数设定值：炉温150(1)25/M280(5)，检测 器温度为320℃，气化室温度为320℃，灵敏度8 器温度为320℃，气化室温度为320℃，灵敏度8， 衰减(ATT） 衰减(ATT）0。 称取生物柴油样品0 称取生物柴油样品0．300 0 g，加入M g，加入M （s)=0．150 0 g的内标物十一酸甲酯和1 ml的 s)=0． g的内标物十一酸甲酯和1 ml的 溶剂苯，进样0 溶剂苯，进样0．1微升，计算内标物(As)、十六 微升，计算内标物(As)、十六 酸甲酯(A16)和十八酸甲酯(A18)峰的峰面积， 酸甲酯(A16)和十八酸甲酯(A18)峰的峰面积， 由回归方程得到的下列标准方程分别求出生物柴 油标样的质量
四、脂肪酶可用于酯合成反应，在温 四、 和条件下可制得特异性高纯度酯。利用脂 肪酶的酯交换作用，在微水反应过程中能 改变油脂和脂肪酸的组成分，由廉价原料 制得可可奶油样油脂。脂肪酶作用于糖和 脂肪酸的混合物可生成糖酯。

目前脂肪酶的主要运用
一、脂肪酶用途最多系用于医疗。主要和淀粉酶、
蛋白酶一起作综合消化酶用，有作测定血液脂质的 试剂、血液中的甘油三酸脂完全由脂肪酸分解，生 成的甘油用其它酶分解和染色剂组合测定。还用于 血液中脂型和游离型的胆甾醇作分别定量时 脂肪的分离。 二、食品中应用脂肪酶分解，制造牛奶香味物， 脂肪酶作用于牛乳分解乳脂肪后进行喷雾干燥，添 加到人造奶油、巧克力、冰淇淋等中，增强牛乳风 味。用微生物脂肪酶分解牛乳奶油味强。将脂肪酶 加入原干酪中，于酪熟成快，能增强香气，增加脂 肪酶能产生水果香。
。生物柴油的生产工艺属于化学催化法，即以酸 或碱作为转酯反应的催化剂。存在工艺复杂、醇 消耗量大、能耗大、产物回收困难、环境污染大 等缺点o 等缺点o，原料中存在的自由脂肪酸或水的含量对 反应有明显影响。酶法合成生物柴油具有反应条 件温和、醇用量小、后处理简单、无污染物排放 等优点，而且原料油中的自由脂肪酸能完全转化 成甲酯。尤其是采用固定化酶，反应结束后酶易 回收，可多次循环利用，大大降低了生产成本， 显示出良好的应用前景。
一定时间，测其酶活。
四、固定化脂肪酶催化合成生物柴油（甲 酯）
近年来，随着石油资源的逐渐枯竭和公众环保意 识的增强，可再生的绿色环保型燃料——生物柴 识的增强，可再生的绿色环保型燃料——生物柴 油，受到了许多国家的重视。生物柴油，即动植 物油脂与低碳醇进行酯交换反应所生成的脂肪酸 低碳醇酯，具有良好的燃料特性、含硫量低，可 替代矿物柴油作为内燃机的燃料。生物柴油主要 是通过酯交换反应来制备，即通过低碳醇在催化 剂作用下将甘油酯的甘油基取代下来，形成长链 脂肪酸酯。反应使用的催化剂可以是酸、碱或酶。
关于脂肪酶催化制备生物柴油的研究主要集中在 脂肪酶种类、原料摩尔比、体系含水量、反应温 度、反应时间和 溶剂等方面，近年来也有不少关于反应体系中甲 醇浓度对脂肪酶活性影响的报道，但鲜见对固定 化脂肪酶进行预处理从而提高其催化活性的报道， 并且都是采用昂贵的试剂级脂肪酶作为催化剂。 本文以国产工业级固定化脂肪酶为催化剂，研究 了酶的预处理方式、体系含水量、甲醇加入方式 等因素对菜籽油醇解反应的影响。探讨了提高生 物柴油制备过程中脂肪酶催化活性的途径。
二、脂肪酶产生菌的分离
取6克含经粉碎处理麻疯树种子油预处理半年以上 的土壤，与40ml无菌水混合，180r/min震荡 的土壤，与40ml无菌水混合，180r/min震荡 30min，取5ml上清液加到富集培养基中，与 30min，取5ml上清液加到富集培养基中，与 30℃ 180r/min培养48h后取15ml转接入 30℃、180r/min培养48h后取15ml转接入 60ml新鲜的富集培养基中，连续转接3 60ml新鲜的富集培养基中，连续转接3次。 将经富集培养的菌液适当稀释后涂布于用麻疯树 为唯一碳源的分离培养基上，于35℃培养48h后 为唯一碳源的分离培养基上，于35℃培养48h后 挑取透明圈和荧光圈较大的单菌落与营养琼脂培 养基划线培养纯化，用无菌牙签接种于Tween80 养基划线培养纯化，用无菌牙签接种于Tween80 平板上35℃培养48h，菌落周围出现模糊晕圈， 平板上35℃培养48h，菌落周围出现模糊晕圈， 直径较大的菌株酶活性较高。 接下来即可摇瓶复筛，扩大培养。
近年来随着化石资源的枯竭，能源危机 越演越烈，生物柴油作为可再生的绿色能 源得到了人们的广泛关注。目前用于制备 生物柴油的脂肪酶Novozyme435和假丝 生物柴油的脂肪酶Novozyme435和假丝 酵母、无根根酶和青霉等微生物脂肪酶， 还有下面即将介绍的一麻疯树油为主要原 料生产生物柴油的脂肪酶。该脂肪酶来自 于一种用麻疯树油筛选出的细菌。
三、脂肪酶的分离纯化
酶的分离纯化书将酶从细胞中或其它酶原料中提取出来，再与杂 质分开，从而获得符合研究和使用要求的酶制品过程。主要内容包括 细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分 离，电泳分裂，萃取分离，浓缩，干燥和结晶等。酶的纯化策略的选 择首先要考虑的是其用途，在实验室研究和临床治疗中所使用的应为 高纯度的酶；而工业用途的酶对纯度的要求就不是很严格，但是一定 纯度的酶制剂不仅可以保证催化反应快速有效地进行，而且也降低了 反应的复杂性，增加了反应的可预测性。一次，脂肪酶的纯化研究具 有重要的意义。大部分微生物脂肪酶为胞外酶，发酵后通过离心或抽 滤出去菌体，得到的含酶上清液通过硫酸铵或有机溶剂萃取浓缩，出 去部分蛋白质和糖类，然后再用层析法进一步纯化。除了少部分基因 工程菌能够高效表达功能性脂肪酶，绝大部分野生型菌株都要联合两 种以上的层析方法纯化才能获得预期纯度的蛋白质。
实验
1．1试剂和仪器 固定化脂肪酶Novozym435(工业品)，标称活力约为10 固定化脂肪酶Novozym435(工业品)，标称活力约为10 000 PLU／g；菜籽油(毛油)；甲醇(分析纯)； PLU／ ；菜籽油(毛油)；甲醇(分析纯) 油酸甲酯(化学纯) 1102型气相色谱仪(氢火焰) CDMA色 油酸甲酯(化学纯)。1102型气相色谱仪(氢火焰)，CDMA色 谱工作站进行数据处理。 1．2实验方法 将一定量的脂肪酶在油酸甲酯中浸泡、过滤，用菜籽油淋洗 0．5 h后，再在菜籽油中浸泡、过滤；或 h后，再在菜籽油中浸泡、过滤；或 者将脂肪酶依次在菜籽油和油酸甲酯中浸泡、过滤，最后用 菜籽油淋洗0 菜籽油淋洗0．5 h。 h。 在具塞锥形瓶中加入一定量的脂肪酶、菜籽油和甲醇，置于 温度为30℃、振荡速率为150 r／min的 温度为30℃、振荡速率为150 r／min的 空气浴振荡器中进行反应，每间隔一定时间取样，静止，分 层，由气相色谱分析上层产品中甲酯含量。待 反应结束后，静置、冷却、分层，取上层溶液经蒸馏( 反应结束后，静置、冷却、分层，取上层溶液经蒸馏(回收甲 醇)、反复洗涤，得到黄色澄清透明的产品。
三、酒类配造中，原料中脂质特别是不饱和脂 三、 肪酸的存在，抑制酵母生成香气，可用脂肪酶除 去。日本酒在生产过程中，将原料米在有脂肪酶 溶液中浸几h后，经蒸煮分解生成物的脂肪酸分散 而使脂质含量减少。进行这种脂肪酶处理而酿造 的日本酒、异戊醋酸含量高，香浓而酒淡丽，即 使没有精白米作原料也能制造出优质清酒。现在 日本n×103t的原料米都用脂肪酶处理再进行酿 造。