第一章：基因打靶概述
基因打靶名词解释
基因打靶名词解释
基因打靶是一种基因工程技术，它利用特定的DNA序列，将外源基因精确地导入到一个特定的基因位点中。
这种技术可以用来研究基因功能、修复基因缺陷以及开发新的基因治疗方法。
基因打靶的过程包括两个主要步骤：识别和切割。
首先，研究人员使用特定的酶或蛋白质来识别目标基因的特定序列。
这些序列通常是一段短的DNA片段，称为“打靶位点”。
一旦打靶位点被识别，酶或蛋白质会结合到该位点，并启动下一步的切割。
接下来，酶或蛋白质会切割目标基因的DNA序列。
这个切割过程会导致DNA链的断裂，并触发细胞的DNA修复机制。
细胞会尝试修复这个断裂，但通常会出现错误的修复方式，导致插入或删除一些基因序列。
这些插入或删除的基因序列可以是研究人员提前设计好的，也可以是随机发生的。
基因打靶的最终目标是通过插入或删除特定的基因序列，改变目标基因的功能或修复基因缺陷。
例如，科学家可以使用基因打靶来修复一些遗传性疾病中的突变基因。
他们可以通过删除或替换这些突变基因来恢复正常的基因功能，从而治疗相关疾病。
此外，基因打靶还可以用于研究基因功能。
通过切割和修改特定的基
因序列，研究人员可以观察到这些基因对生物体的影响，并进一步理解基因在不同生物过程中的作用。
总而言之，基因打靶是一种精确编辑基因的技术，可以用于研究基因功能和开发基因治疗方法。
随着技术的不断发展，基因打靶有望成为一种重要的工具，用于治疗遗传性疾病和改善人类健康。
基因打靶
基因打靶基因打靶研究背景显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的。
可能导致下面几种情况出现：1导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺失；2导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；3外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；4导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。
解决办法：将外源基因导入预先确定的位点。
即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶。
什么是基因打靶基因打靶(gene targeting)技术也称为基因定点同源重组，是利用基因转移方法, 将外源DNA序列导入靶细胞后, 通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上的同源DNA序列间的重组, 将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点, 或对某一预先确定的靶位点进行定点突变, 从而改变细胞遗传特性的方法。
它是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。
基因打靶原理生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。
同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。
ES细胞是一类具有在体外培养件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。
首先获得ES 细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES 细胞。
通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES 细胞引入受体胚胎内。
经过遗传修饰的ES 细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。
基因打靶技术
4.基因打靶的策略
• 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping)
可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，neo基因插入到 ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的 ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来。
中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组 序列分析来获得。
基因打靶技术
叶亚新
基因打靶研究背景
基因转移技术
显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等 导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的
可能导致下面几种情况出现： ①导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺失； ②导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性； ③外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因； ④导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。
因此，如用G418筛选，则抗性细胞中将只包含后两种可能情况，根据这两种情况下基因组 DNA酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交即可检测出同源重组的克隆。
4.基因打靶的策略
• 完全基因剔除(complete knotk-out)的策略 • 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping) • 精细突变的引入
（2）正相选择法（positive selection method）
主要程序：将标记基因neor的启动子和起始密码剪切掉，再嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列 内 ①打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失； ②外源打靶序列随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始密码，整合位点周围亦无启 动子，使neor基因的表达受阻； ③虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子能启动neor基因的表达； ④外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶基因自然存在的启动子和起始密码 的作用而呈现表达活性。
基因打靶技术
基因打靶研究背景
基因转移技术
显微注射、基因枪法、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染 等 导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机 的
可能导致下面几种情况出现：
①导入的外源基因整合入某一正常基因内部，导致该正常 基因表达的缺失； ②导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影 响了其周围正常基因的活性；
显微注射每次只能注射一个细胞；
电穿孔法可同时使多个细胞转染。 逆转录特异性基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展 潜力。
基因打靶所使用的受体细胞一般用胚胎干细胞(ES细胞)，ES细胞是一种多潜能 的干细胞，能在体外传代而丌改变其多潜能性。小鼠胚胎干细胞是从着床前胚胎(
基因打靶的主要步骤
1. 打靶载体的构建
基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和目的片段及
选择性标记基因等。
靶基因同源序列被称为同源重组指导序列(homologous
recombination directing sequences, HRDS) 。外源基因 插入这一同源序列之中。
同源序列是同源重组效率的关键因素，基因打靶载
主要步骤：将标记基因neo的启动子和起始密码剪切掉，再嵌合 入打靶载体中不靶位点同源的序列内，将打靶载体转染进靶细胞。 可能出现下面几种情况：
①打靶载体丌整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失；
②外源打靶序列随机整合，由于neo基因缺失了其自身的启动子 和起始密码，整合位点周围亦无启动子，使neo基因的表达受阻；
的特定片段上，并可对宿主染
色体进行精细改造
新引入基因随染色体DNA的复
制而稳定复制
基因打靶的结局
(1) 靶基因被灭活，即基因敲除(gene knock-out)，当打靶
基因转移技术和基因打靶技术
第一节 概 述
转基因动物(transgenic animal)是指用重组DNA技术将外源基因导入 基因组内，使之能在动物体内表达并稳定传代的一类动物。 整合到动物染色体基因组上的外源基因称转基因。 只有部分组织细胞整合有外源基因的动物称嵌合体动物。
基因剔除动物是指运用基因剔除技术将特定
另外将包装蛋白基因导入专门的细胞并使之整合到染色体上，形成包装细胞。 如果重组病毒DNA导入这种包装细胞中，病毒包装蛋白能将DNA包装成具有感染力的重组
蛋白颗粒，能浸染动物细胞而将重组DNA引入宿主细胞。
步骤：
1.反转录病毒载体的构建 2.选择和培养包装细胞系 3.重组病毒DNA导入包装细 胞 4.收集重组病毒颗粒 5.感染胚细胞，使细胞转化
磷酸钙沉淀法：
目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA 微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受 体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。
（八）脂质体载体法
•
应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构——脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细
胞，使其表达。
DNA
细胞融合 转化细胞
原理：
○ 将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞，从 阳性转基因细胞中分离细胞核，通过显微注射或电 穿孔将这种导入细胞核去核的成熟卵母细胞中。将 重组胚移植到代孕受体，进而获得带有外源目的基 因的转基因动物。
（六）受体介导法
是将外源DNA与受体分子连接后 与胚胎细胞共培养，受体可以介 导外源DNA进入受体细胞，从而 实现基因转移。 1999年，Ivanava用受体介导法 制作了转基因鼠。
（二）转基因载 体的构建
载体通常由结构基因及其调控序列组成。 常常在载体中附加半乳糖苷酶或绿色荧 光蛋白等报告基因。
转基因生物和基因打靶
精子载体法：
经电穿孔等方法把外源基因导入精子，令其与卵
子结合，受精。
•12
6、接受外源基因的个体的产生 1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假
孕动物子宫→胚胎→个体。 2） 胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中 分离多功能胚胎干细胞 →基因操作→注 射入动物囊胚→形成嵌合体胚胎→嵌合 个体
•13
•29
•同源重组 •随机整合
•30
3 、将基因敲除ES细胞注射入胚泡，形成嵌 合胚胎。
4 、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子宫。
5 、获得子代小鼠，筛选带有靶基因的小鼠 。常有的方法有：Southern印记、 Northern印记
•把细胞注入胚泡
•把胚胎注入 假孕小鼠
•Southern印 记
•31
可作为器官移植的供体
•19
第二节 转基因植物
概念 :指用人工方法将外源基因导入或整合 到基因组内，并能稳定传代的一类植物。
方法：获取目的基因→受体细胞培养→将目 的基因导入受体细胞（载体直接转化或先转 化农杆菌，后者再转化受体细胞）→培养转 化细胞→筛选阳性细胞→培植阳性植株→转 基因植株的鉴定
6、杂和小鼠（+/-）间杂交，获得子二代 小鼠（+/+、-/-、+/-）。
7、筛选的-/-、+/-子二代小鼠。
•（•（++/-/））
••（（++//-））
•）（•）（++/+/+
•（•（+/--/-） •（+/-•（+/- •（-/-）
）
））
•32
三 、基因打靶在医学中的应用
1、采用基因打靶技术可建立基因缺陷型的 疾病模型，用于研究遗传疾病发生的分 子机制。
基因打靶技术
1
意 义：
基因打靶技术作为最有效的定向修饰小鼠基 因的技术手段在揭示基因的生理功能、研究 人类疾病的遗传机制以及寻找新的药物靶标 的过程中发挥着重要的作用。
定
义
理论基础 操Байду номын сангаас流程 应 用
基因打靶技术和RNAi
2
基因打靶技术是一种定向改变细胞或者生物个 体遗传信息的实验手段，是利用基因转移方法， 将外源DNA序列导入靶细胞后，通过同源重组， 将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定 的位点，从而改变细胞遗传特性的方法。
2008年中科院： 比较基因打靶技术与RNAi这2种方法的异同点 2008年南大： 若有一哺乳动物新基因的开放阅读框序列已测出，但对其功能 一无所知。请设计3种以上研究途径和方法，研究此基因有何 功能。
何为RNA干扰？说明其基本原理及它与反义RNA技术的主要差别
8
ES 细胞技术与同源重组技术的结合使得在生物整体水平上定向 改变和修饰哺乳类动物的遗传物质成为可能。
定
义
理论基础 操作流程 应 用
基因打靶技术和RNAi
4
打靶载体的构建
同源重组指导序列、外源DNA序列
转化受体细胞
显微注射、电穿孔DNA - 磷酸钙共沉淀、脂质体包装和PEG介导
筛选
正筛选标记：同源序列内；负筛选标记：同源序列外侧
定
义
理论基础 操作流程 应 用
基因打靶技术和RNAi
3
基因打靶技术是在胚胎干细胞(ES)技术和同源重 组技术成就的基础之上产生和发展的。
Joshua Lederberg 由于50 多年前在细菌中首先证实同源基 因间重组的原理而获得了1958 年的诺贝尔奖。 Capecchi 和Smithies都首先预见并证实到新的遗传物质可 以通过同源重组引入哺乳动物细胞的基因组, 从而对基因进行特 异性修饰和改造。 Evans贡献了制造小鼠生殖细胞系的工具——胚胎干细胞 。
基因打靶技术及其应用2
应用实例：
Add Your Title
实验一
VBS（可见洞穴系统）实验：
Add Your Title
Approach: front and back（approach to the front or back of another animal ） Self-grooming： lick or rub self Allo-grooming： lick or rub with paws, another animal Huddle Alone
HSV-tk 胸苷激酶 标记基因 ← gangcyclovir （GCV） neor 新霉素抗性 基因→G418
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞
基因打靶的结局有如下可能：
(1)基因敲除(gene knock-out):靶基因被灭活 (2)基因替代:靶基因被导入的基因替代，可以是 以正常基因替代突变的基因。 (3)基因敲入(gene knock-in)：在受体细胞基因 组中定点引入一个原本不存在的完全新的基因
Wu R，Hendrix Lucas N. Cancer Cell，2007，1l(4)：321-333．
建立人类疾病的动物模型
基于基因同源重组原理的基因打靶技术的出现， 使转基因在体内的定点整合成为现实，因而产生 了去除特定基因的动物模型。 利用基因打靶技术建立了人类癌症、心血管疾病、 骨质疏松、神经退行性病变、免疫缺陷等疾病小 鼠模型，为疾病机理研究、新药研发和治疗方案 提供了宝贵的遗传资源。
实验结论
催产素受体基 因敲除的小鼠
社会交际 能力下降
VS 正常小鼠
展望
发展趋势： 通过条件基因打靶技术在时间和空间上对基因 剔除进行调控； 发展满足大规模基因功能研究需要的随机基因打 靶技术； 通过定位引入技术在基因组上引入精细突变以研 制精确模仿人类疾病的动物模型。
分子生物学 基因功能研究1---基因打靶和转基因
•转基因技术（Transgenic technology）* ： 产生转基因生物的技术。
二、 转基因小鼠模型的建立
基本流程*：
•转基因载体的构建
Enhancer
P
transgenic gene
NeoR
二、 转基因小鼠模型的建立
事实上，目前至少500种基因已经获得了基因敲除小鼠！
基因敲除小鼠工程
2006年，
•美国NIH推出knockout Mouse Project (KOMP) •将系统敲除或破坏小鼠的2万个基因 •计划投入5200万美元建立小鼠基因组突变基因数据库 •此计划与加拿大North American Conditional Mouse Mutagenesis Project (NorCOMM)及European Conditional Mouse Mutagenesis Program (EUCOMM)合作，以避免重复工作
英国卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院
马丁·埃文斯 Martin J. Evans
美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院 奥利弗·史密斯 Oliver Smithies
一、基因敲除的定义 *
•利用DNA同源重组的原理，在活体内将特定基因从染色体 上剔除的过程。
Genomic DNA: Targeting DNA fragment:
基本流程：
•转基因载体的构建 •将重组转基因导入受体细胞核内 •将转基因ES细胞移植胚泡中
一般认为，
•转基因是随机整合 到染色体上，因此， 转基因杂合子的几率 在10-20% 以下
•将嵌合胚泡、或转基因受精卵移植入假孕小鼠的子宫腔中
基因打靶综述
基因打靶技术【摘要】基因打靶技术是建立在同源重组技术之上,可对基因组进行定位修饰的实验方法。
本文简述了基因敲除技术的基本原理、打靶策略、筛选机制,在动植物和微生物中常用的基因敲除方法以及基因打靶的应用。
基因敲除技术是研究功能基因作用的重要方法, 是后基因组时代的重要研究内容。
【关键词】基因打靶;同源重组;打靶策略;筛选机制一．前言发展历史：基因敲除（gene knockout）又称基因打靶（Gene targeting）是自20 世纪80 年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，。
早在80年代初,人们就开始研究在哺乳动物基因组中,存在使外源DNA与现存同源序列同源重组的可能性。
1985年, Smithies及其同事的研究使之得到确证。
同期的相关研究证明了鼠多能干细胞系具有诱发小鼠产生种系组织的能力,甚至在长期培养后仍存在,导入这些细胞器系的突变可以传给后代。
其传统概念是指同源重组敲除技术即利用DNA 转化技术，将构建的打靶载体导入靶细胞后，通过载体DNA 序列与靶细胞内染色体上同源DNA 序列间的重组，将载体DNA 定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或与靶细胞基因组上某一确定片段置换，从而达到基因敲除的目的[5]。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。
所以，基因敲除的基本原理是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的一种分子生物学技术。
二．主题1基因打靶的基本原理绝大多数的基因打靶策略都是基于同源重组( homologous recombination)的机制。
同源重组是指发生在非姐妹染色单体( sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合,普遍存在于噬菌体、细菌和真核生物中。
基因敲除的操作步骤基因敲除的一般流程见图1, 基本程序是: 用PCR 技术扩增目的基因序列, 在体外插入卡拉霉素、四环素等受体菌原先不具有的抗性标记, 使目的基因失活,再将失活的目的基因构建至一环状载体上, 用电转化、显微注射等方法将构建好的载体转化入受体细胞内, 以抗性标记初步筛选阳性菌或进行目的基因功能的失活检测, 再以PCR, southern杂交等做进一步验证。
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在科学界，转基因动物被定义为“由于外源DNA导入动物基因组而产 生了可遗传的改变，这样的动物叫转基因动物”（陈永福，《转基因动 物》）。科学界对转基因动物的狭义定义主要指外源DNA被整合到生殖系 中（即可遗传），而不包括非生殖系整合的体组织基因导入。 具体含义： －转基因动物体内含有导入的外源DNA片段 －外源DNA必须整合到动物的基因组中 －动物的所有细胞基因组中都应含有导入的DNA －外源DNA可通过猪、鱼基因工程育种 “ 863”七五、八五计划, 转羊MT/猪GH基因:
转大马哈鱼和草鱼GH基因： 2. 乳腺生物反应器 “863”九五、十五计划重大专项,
3. 异种器官移植 “ 863”九五计划, 转hDAF基因：
猪(1989), 兔(1990) ， 绵羊(1991), 鱼(1986) （1995-2005）
二，什么是转基因动物（transgenic animal)
美国FDA：A transgenic animal is defined as an animal which is altered by the introduction of recombinant DNA through human intervention. This includes two classes of animals; those with heritable germline DNA alterations, and those with somatic nonheritable alterations. （转基因动物就是一种GE animal！）
第一章
基因打靶概述
第一节 基因打靶的概念
一，什么是基因修饰（或遗传修饰）（ Genetic Modification，GM)
欧盟：Genetically modified organism (GMO) means an organism, with the exception of human beings, in which the genetic material has been altered in a way that does not occur naturally by mating and/or natural recombination （利用 非自然发生的方式导致生物遗传物质发生改变，即人为故意方式） 所采用的方式包括：
转SV40病毒大T 抗原基因导致小 鼠脑部肿瘤
转c-Myc基因导 致小鼠乳腺肿瘤
转Fos基因导致 小鼠骨肿瘤
三，育种（农业）
加快生长速度 相关基因：GH，Igf-1， Myo-D ， myostatin（敲除） 提高饲料利用率 相关基因：xylanase 改善肉质 相关基因：Fat1，Fad2, 增加有益脂肪酸（Ω -3 fatty acids） LDL-受体基因，leptin（降低脂肪和胆固醇） 提高抗病力 相关基因：MHC（提高免疫力），Mx1（抵抗流感病毒） lysostaphin（抗乳房炎） PrP(敲除） 特异性病毒基因（RNAi) 改善奶成分 相关基因：lactoferrin，lysozyme βand κcasein lactase 改善羊毛品质 相关基因：Igf-1，keratin 提高繁殖力： 相关基因：ESR，FecB 环境保护： 相关基因： phytase
但目前世界上尚无一例转基因家畜品种获得商业化许可
转基因鱼—目前唯一一种获得商业许可的、用于食品 消费的转基因动物
转生长激素基因的Atlantic salmon (rDNA: opAFP-GHc) AquaBounty Technologies, Inc
四，医药（生物反应器）
第一个种获得商业许可的转基因动物产品 (转基因山羊产 生的Recombinant Antithrombin, rAT or ATryn®，GTC Biotherapeutics )
二， 基因打靶技术
1，20世纪80年代前半期：胚胎干细胞技术发明
1981, Evans and Kaufman , 1984， Bradley et al. Nature Nature
2, 20世纪80年代后半期：小鼠基因打靶技术发明
1987， Doestschman T，et al. Thomas and Capecchi, 1989， Trompson, et al. Schwartzberg, et al. Nature Cell Cell Science
第二节 发展简史
一，转基因技术
1，20世纪70年代：早期的转基因研究
1971, Brackett, et al. PNAS, 兔, 精子载体 1974, Jaenisch, et al. PNAS, 小鼠,反转录病毒囊胚注射 1976, Jaenisch, et al. PNAS, 小鼠，反转录病毒感染
五，异种器官移植
修饰猪的基因组，降低免疫排斥
六，伴侣动物
低致敏猫（敲除Fel-d1) 彩色鱼类
存在问题及争议
1. 效率低
理论上的限制（常常不能获得预期表型） 技术上的限制（技术上的固有缺陷）
2. 生物安全性
环境安全性 产品安全性(作为食品、药物和饲料）
3. 动物福利
转基因对动物的伤害 动物遗传修饰是否合理
第三节 转基因技术和基因打靶技术的用处
一，基因功能研究
分子水平-细胞水平-个体水平的有机结合： 基因的生理学功能 启动子、内含子等调控序列的作用 组织特异性和发育阶段特异性表达功能与机制 复杂的生物学过程：
生长发育、脑功能、行为学、免疫学
二，疾病模型（医学）
用于观察疾病发生过程，评估治疗效果 遗传病 如：LAM2敲除导致肌肉营养失调综合症
基因工程（或遗传工程）：(Genetic Engineering, GE)
美国FDA： Genetic engineering is a process in which scientists
use recombinant DNA (rDNA) technology to introduce desirable traits into an organism. Genetic engineering involves producing and introducing a piece of DNA (the rDNA construct) into an organism so new or changed traits can be given to that organism .(明确：主要使用重组DNA技术来改变 生物性状）。 GM和GE可以用于动物、植物、微生物及其产品，是比较 正式的专业术语。
4. 20世纪90年代后半期：体细胞克隆转基因技术诞生 1997，Wilmut，et al. Nature, 绵羊 1997, Schnieke, et al. Science,绵羊 1998，Cibelli，et al. Science,牛
5. 21世纪至今：以体细胞克隆技术为基础的家畜转基因迅速发展
3. 20世纪90年代：小鼠基因打靶技术开始广泛使用 4. 21世纪：家畜基因打靶技术诞生
2000， McCreath, et al. 2002， Lai et al. Dai et al. 2007， Richt et al. Nature 绵羊 Science; 猪 Nature Biotechnology，猪 Nature Biotechnology, 牛
1. 体外重组核酸技术 2. 将体外重组核酸直接导入生物体的技术 3. 细胞融合技术（非自然的） 但不包括： 1.体外受精 2.自然方式的接合、转导、转化等 3.多倍体诱导
诱导突变和植物常规育种技术也属于广义上的基因修饰技术，但往往不包 括在欧盟法律定义的GMO范畴内，因为这些技术不涉及重组核酸技术
属于转基因动物范畴的基因改变 1，外源DNA片段至少整合到一条染色体的一个位点上； 2，外源DNA的插入使基因组中任何一个基因的结构发生改变 3，外源DNA的插入使染色体发生重排 4，导入可持续存在的遗传实体，如人工染色体 不属于转基因动物范畴的基因改变： 1. 由于化学品诱发的基因改变 2. 由于辐射导致的基因改变 3. 胞质细胞器的转移, 如线粒体. 4. 通过核移植交换遗传物质 5. 使用基因治疗技术导入DNA
猪
“十一五”和“十二五”期间
“863”计划 以技术探索为目标
国家重大科技专项（转基因新品种培育） 以家畜育种为目标（猪、牛、羊） 十三五继续滚动支持
2,20世纪80年代：转基因技术建立
1980, Gordon, et al. PNAS, 小鼠, 原核注射 1982，Palmiter, et al. Nature, 小鼠，高表达rGH 1985, Hammer, et al. Nature, 转基因家畜（兔, 绵羊, 猪）
3, 20世纪90年代前半期：转基因技术在家畜的广泛应用 （主要是生物反应器）
CFTR突变导致囊性纤维炎 renin转基因导致高血压症
传染病，表达细菌或病毒的识别或受体基因
如：表达人CD46对疱疹病毒敏感 人U-plasminogen activator gene对肝炎病毒敏感 表达CD4，CCR5对HIV敏感
癌症
如：病毒基因SV40大T抗原基因 原癌基因 c-Myc, Ras,Fos等 抑癌基因突变
基因敲除（knock out)，删除特定位点的基因(主要应用）
基因敲入（Knock in )，在特定位点增加基因
四，转基因技术与基因打靶技术的区别
1，目的 基因打靶：灭活基因功能 转基因：增加基因功能 2，基因来源 基因打靶：内源性 转基因：外源性 3，整合方式 基因打靶：定点整合 转基因：随机整合 4, 载体 基因打靶：打靶载体，主要考虑重组效率 转基因：表达载体，主要考虑表达效率 5，载体来源 基因打靶：侧翼序列必须与靶动物/细胞同源 转基因：调控序列与靶动物/细胞可以是异源的 6，技术路线 基因打靶：ES-嵌合体途径；体细胞克隆途径 转基因：显微注射；精子介导；反转录病毒载体， ES－嵌合体途径；体细胞克隆途径