抗氧化自由基检测的方法及步骤
抗氧化/自由基检测的方法及步骤
一、技术简介
自由基是含有未成对电子的原子、分子或原子团。它是线粒体在电子传递的过程中产生的，正常情况下，机体的自由基清除系统可使自由基的产生与消除保持在极低的动态平衡水平上，对机体是有利的。但当体内蓄积过量自由基时，就会损伤细胞，导致动物组织或细胞的氧化损伤。在抗氧化研究中，自由基的检测已成为至关重要的一环，得到了广泛的应用。自由基检测的方法多种多样，包括自由基相关酶的测定，化学发光测定，吸光度法等。以SOD检测为例，介绍其主要原理和实验流程。超氧化物歧化酶（SOD）是一种抗氧化剂，其主要功能是清除机体内的自由基。
黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺酸与甲萘胺作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性抑止作用，使可形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于空白管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中SOD的活力。
二、实验流程
1. 从血液或组织中提取超氧化物歧化酶（SOD）；
2. 设置测定管和对照管，加入相应的试剂；
3. 混匀，37℃恒温水浴30min；
4. 加入显色剂；
5. 吸光度检测；
6. 根据公式计算SOD活力。
羟基自由基的测定方法
羟基自由基(.OH)是最活跃的一种活性分子，也是进攻性最强的化学物质之一，几乎可以与所有的生物分子、有机物或无机物发生各种不同类型的化学反应，并伴有非常高的反应速率常数和负电荷的亲电性。羟基自由基是目前所知活性氧自由基中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化损伤，使细胞坏死或突变，羟基自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关。羟基自由基由于其寿命短，反应活性高，存在浓度低，目前尚未有专一、有效的方法可以精确测定羟基自由基的含量，其测定方法也成为一项国际性的难题。本文对近几年出现的羟基自由基检测方法进行了综述。 1电子自旋共振法 电子自旋共振法或电子顺磁共振法主要研究对象为未成对的自由基或过渡金属离子及其化合物。自旋捕捉(spin trapping)技术的出现为化学反应中自由基中间体及生命活动过程中短寿命自由基的检测开辟了新的检测途径[[1]]。此方法是利用捕捉剂与自由基结合形成相对稳定的自旋加合物(spin adducts)，然后进行ESR测定。 2HPLC法 HPLC法可用于间接测定自由基。测定过程中必须先选择合适的化合物捕集被测体系中的自由基，使之生成具有一定稳定性，且能被液相色谱分离与检测的产物，然后用HPLC进行测定。1）、采用二甲基亚砜捕集羟基自由基的HPLC测 2）、采用水杨酸捕集羟基自由基的HPLC测定方法 3化学发光法 化学发光法是一种灵敏、准确的检测自由基的方法，其原理是利用发光剂被活性氧自由基氧化成激发态，当其返回到基态时放出大量光子，从而对发光起放大作用。且自由基产生越多，发光值就越大。通过函数换算间接反应系统中自由基的量。与ESR和HPLC法相比，具有操作简便、设备成本较低、测定快速等优点。4氧化褪色光度法 6极谱法 7毛细管电泳-电化学检测法 8胶束电动毛细管色谱法
抗氧化酶活性等测定方法
叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用
围术期炎症细胞因子的监测
围术期炎症细胞因子的监测 围手术期是围绕手术的一个全过程，从病人决定接受手术治疗开始，到手术治疗直至 基本康复，包含手术前、手术中及手术后的一段时间，具体是指从确定手术治疗时起，直 到与这次手术有关的治疗基本结束为止，时间约在术前5- 7天至术后7 - 12天。 炎症反应一方面通过致炎因子直接损伤血管内皮，另一方面主要是通过一系列炎症介 质来实现；多数炎症介质通过与靶细胞结合发挥活性，炎症介质作用于细胞后可进一步引起 靶细胞释放次级炎症介质从而放大或抵消初级炎症介质的作用。不管机体遭受何种刺激， 宿主对炎症反应的总体特征非常相似，然而不同的损伤涉及不同类型的细胞，导致不同炎 症介质的产生和释放从而引起系统性和局部性损伤。通常术中的炎症反应与细胞因子的释放有关，细胞因子的作用又进一步加强了手术以及术中缺血再灌注损伤，如此恶性循环终将导致组织损伤而增加手术后临床相关并发症，影响患者的预后。 目前，手术方式以及麻醉方法、药物对恶性肿瘤术后免疫功能的影响逐渐受到重视。细 胞因子是机体免疫及炎症反应中细胞之间交流的信息分子，它们通过效应细胞表面相应的 受体对细胞生长、成熟和修复产生调控作用。创伤、应激、感染等是影响围术期病死率的 重要因素，与机体免疫状态密切相关。本文旨在总结各种炎症因子的特点、围术期使用不同药物和麻醉方式对炎症细胞因子的影响，提高患者围术期安全，从而改善患者的预后。 1. 炎症细胞因子 多达20%的肿瘤源自于慢性炎症，大部分的实体瘤都有炎性渗出物。免疫细胞对肿瘤 的发生、生长和进展有着广泛的影响，并且很多这些效应都是由促炎症细胞因子介导。在所有细胞因子中，TNF和IL-6具有促进肿瘤发生的效应，这一点是可以确定的。TNF和IL-6 作为肿瘤相关炎症和肿瘤形成的主要调节因子，使得它们在癌症的辅助治疗中成为很受欢迎 的研究目标。因此在围术期对患者进行炎症细胞因子的检测具有重要的临床意义。
超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧 化法） （适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式
自由基及检测方法
ESR 电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。 自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。 H： V： ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？） (MGD)2 - Fe2 +,是含有10mmol·L- 1MGD 和2mmol·L- 1FeSO4的溶液。 体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定 体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定 腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。 通用捕获剂 典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基基因给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感， ESR 技术检测O-2 O-2可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron 半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题 ESR 技术检测·OH DMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。它与·OH产生的自旋加合物的ESR谱表现出特别容易识别的特征谱线。在溶液中容易形成的自我捕集产物二聚体自由基不会干扰实验结果。 ESR 技术检测血红蛋白结合的一氧化氮 在组织或血液中，一氧化氮大多与氧或过渡金属反应生成了硝酸盐或亚硝酸盐以及一氧化氮与金属的配合物。一氧化氮与血红蛋白的结合速率常数非常高，而且能够得到有特征的ESR 波谱。利用这一性质，我们可以用血红蛋白作为一氧化氮的捕集剂检测一氧化氮自由基。但是，HbNO 极易氧化，这就限制了这种方法在富氧条件下的应用。 ESR 技术检测生物体系产生的一氧化氮 一氧化氮与含金属蛋白反应产生的亚硝酰的金属配合物，往往会抑制细胞中许多重要的酶，对细胞产生毒害作用。目前应用较多的捕集剂的有Fe2+- (DETC)2，它可与一氧化氮形成稳定的单亚硝酰-铁配合物MNIC，给出特征的ESR 波谱。但由于Fe2+-( DETC)2不溶
抗氧化活性测定方法的比较
抗氧化活性测定方法的比较 人体衰老和多种疾病均与自由基有关，寻找天然抗氧化剂具有重要意义。黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性，抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2种测试体系。 体外：抗氧化活性可以用在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。常用的方法有羟基自由基（·OH）清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH法）、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS 法）、超氧阴离子自由基法（O2-·）、邻苯三酚自氧化法、β-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定（FRAP法）、总酚测定法、ORAC法等方法。体内：主要有DNA氧化损伤法、蛋白质氧化损伤法、线粒体氧化损伤法。 其中DPPH法和ABTS法操作较简单便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外分光光度测量值后计算其自由基清除率，缺点是不同物质具有组成和结构的差异，与DPPH·、ABTS+·的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断，且DPPH自由基会和其他自由基发生反应。邻苯三酚自氧化法缺点是检测波长、缓冲液的组成及ｐＨ值、邻苯三酚浓度等关键测定条件存在
着较大差异。β-胡萝卜素漂白法的缺点是β-胡萝卜素本身有抗氧化活性，对样品活性的测定结果有影响。FRAP法主要用于食品业，优点是简单易操作、可以重复，缺点是无法测定硫醇化合物的还原能力。ORAC法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法，缺点是仪器成分较复杂，检测成本较高。 目前普遍使用的体外抗氧化活性指标一般都采用分光光度法，使用分光光度计测量各种颜色成分含量的变化。分光光度法操作较简单、便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外-可见分光光度测量值后计算其活性大小，具有成本低、效率高、样品量少等优点。分光光度法缺点是会受到样本自身颜色和浑浊度的影响和限制，颜色深的样品测得的数据误差大，甚至得到错误的结果；不同物质组成和结构存在差异，与各种自由基的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。外界环境因素对实验结果也存在一定程度的影响，有些抗氧化活性实验在冬天低温时不易成功，测得的数据往往没有规律。 我觉得在测定样品的抗氧化活性时，各种方法都有自己的优缺点，要根据需测物质来决定用什么方法，比如DPPH 法的自由基选择性强，不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应，这类物质需用其他方法测定。若对检测结果
细胞因子的ELISA方法检测
实验报告
1.取已包被抗体并完成封闭的酶标条2条，分别装于酶标架上。在每条酶标条的1~6孔分别加入稀释液100微升。 2.向第6、7孔加入分别加入2000pg/ml PGFβ1标准品100微升。 3.用加样枪吹吸混匀第6孔的液体，注意避免气泡形成。混匀后其浓度约为1000pg/ml。 4.再吸出100微升加入第5孔，吹吸混匀。其浓度变为500pg/ml。以此类推，一直加到第2孔。吸去多余的100微升。 5.向第8、9孔各加入100微升样品1。10、11孔加入100微升样品2. 6.封口膜覆盖酶标板，防止水分挥发。 7.将酶标板置于37℃温箱孵育120min。 8.取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体，注意甩动方向，避免液体流入相邻酶标孔，造成交叉污染。 9.加入洗涤液，注意不要溢出至相邻孔，造成交叉污染。静置3min后甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。在吸水纸上拍干孔中液体。 10.每个孔各加入酶标记抗体100微升。封口膜覆盖酶标板，将酶标板置于37℃温箱孵育60min。 11. 取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体。再加入洗涤液，静置3min后，甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。在吸水纸上拍干孔中液体。 12. 每个孔各加入底物A 100微升，再加入底物B各100微升。晃动酶标板混匀。将酶标板放入37℃温箱孵育15min显色。 13. 取出孵育后的酶标板，见酶标板孔中液体呈蓝色。 14. 每个孔各加入终止液100微升，可见液体变成淡黄色。 15.用酶标仪在450nm处测OD值。结果如下： 16. 分析结果： 将2组标准品的OD值和标本1、标本2的4个副本的OD值合并得到平均值。根据各自的OD值，在半对数坐标上标出62.5、125、250、500、1000、2000这6个不同稀释度标准品所处的位置，将6个点连线集会成标准曲线。
超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)
超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法) 简介： 超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。 Leagene 超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)又称超氧阴离子清除能力检测试剂盒，其检测原理是利用羟胺氧化的方法可以检测生物体系中超氧阴离子自由基(O 2-)，即超氧阴离子自由基(O 2-)与羟胺反应生成NO 2-，在一定范围内颜色深浅与超氧阴离子自由基(O 2-)成正比，根据NO 2-反应的标准曲线将A 530换算成NO 2-浓度，再依据上述关系式即可计算出O 2-浓度。该试剂盒主要用于测定植物组织中的超氧阴离子自由基含量或超氧阴离子清除能力。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 实验材料：植物组织(大豆、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等 3、 研钵或匀浆器 4、 离心管或试管 5、 低温离心机 6、 恒温箱或水浴锅 7、 比色杯 8、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 编号 名称 TO1123 50T Storage 试剂(A): NO 2-标准(1mM) 1ml RT 试剂(B): O 2- Lysis buffer 125ml RT 试剂(C): 羟胺溶液 30ml RT 试剂(D): 氨基苯磺酸显色液 30ml 4℃ 避光 试剂(E): 萘胺显色液 30ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
1、准备样品： ①植物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取预冷的O2-Lysis buffer后冰浴条件下匀浆或研磨，4℃离心，上清液即为超氧阴离子自由基提取液，4℃保存备用。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，4℃保存，用于超氧阴离子自由基的检测。 ③高活性样品：如果样品中含有较高浓度的超氧阴离子自由基，可以使用O2- Lysis buffer 进行恰当的稀释。 2、配制系列NO2-标准溶液：取出NO2-标准(1mM)恢复至室温后，以NO2-标准(1mM) 按下表继续稀释： 加入物(ml) 1 2 3 4 5 6 NO2-标准(1mM)0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 蒸馏水0.99 0.98 0.97 0.96 0.95 0.94 NO2-含量(μM) 10 20 30 40 50 60 3、O2-加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意 避免产生气泡。如果样品中的超氧阴离子自由基浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。 加入物(ml) 空白管标准管测定管 蒸馏水1—— 系列NO2-标准(1-6号管) — 1 — 待测样品——0.25 O2- Lysis buffer ——0.25 羟胺溶液——0.5 混匀，25℃水浴孵育。 氨基苯磺酸显色液0.5 0.5 0.5 萘胺显色液0.5 0.5 0.5 混匀，30℃水浴孵育。 4、O2-测定：以空白调零，分光光度计(1cm光径比色杯)检测标准管、测定管530nm处吸光度(A标准、A测定)。 计算： 以系列NO2-标准(1-6号管)含量(μM)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据测定管的吸光度进而计算NO2-含量。根据如下公式计算具体样品中超氧阴离子
抗氧化剂抗氧化活性的测定方法
1.抗氧化剂是指在低浓度下能有效延缓或阻止底物氧化的物质。被氧化的底物包括蛋白质、脂质、糖和DNA。 2.初始型抗氧化剂(AH)可通过与脂质自由基L.、过氧自由基LOO.或烷氧自由基LO.反应抑制脂质氧化链反应。 L.+ AH--- LH + A. LOO.+ AH--- LOOH + A. LO.+ AH--- LOH + A. 抗氧化剂自由基A.也能与过氧自由基、烷氧自由基反应从而终止脂质氧化反应。 LOO.+ A.---LOOA LO.+ A.---LOA 次级型抗氧化剂可通过各种机理延缓脂质氧化,如螯合过渡金属、给初始型抗氧化剂补充氢、清除氧以及使活性物质失活等。 抗氧化剂的活性分为在生物体外(如食品中)的活性和在生物体内的活性。本文综述了体外测定抗氧化剂抗氧化活性的方法,不包括在生物体中测定生物活性的方法。 3.评价或表征抗氧化活性的方法为了说明在特定条件下被测物抑制底物氧化的效力或清除自由基的能力 实际测定时至少要说明在测试条件下被测物是抗氧化剂还是促氧化剂;在指定浓度下比较不同测试材料(如被测物与标准抗氧化剂或添加有被测物的测试体系与空白体系)对底物的作用。 评价或表征抗氧化活性的方法有: (1)在指定的时间测量氧化产物或官能团的浓度或吸光度值;( 2)测量反应的速率;
( 3)测量诱导期(延滞期)或氧化达到一定程度所需的时间;( 4)测量速度的积分(即动力学曲线下的面积) ; ( 5)测量被测物产生与标准抗氧化剂相当作用的浓度。4.参数 4.1诱导期( induction period) 诱导期tIND(也叫延滞期, lag period)常定义为化学反应的速度。诱导期是一个相当不确定的值,受检测方法、使用仪器的灵敏性以及一些其他因素的影响。对于脂质氧化,诱导期通常是指链增长阶段动力学曲线的切线和时间轴的交点。 4.2抑制率( percentag e of inhibition)和IC50 抑制率和IC50 (抗氧化剂提供50%抑制作用时的浓度,也可用EC50表示的)常用来表征抗氧化能力。它们不仅与被测抗氧化剂的反应性能和氧化的底物有关,而且受其他因素的影响,如脂质氧化链反应的长度和抑制速率等。此外,用IC50表征抗氧化剂 的活性与比较活性的时间点有关。只有在其他参数相同的情况下,在某一研究中测得的抑制率和IC50才可以与另一研究中测得的值进行直接比较。TEC50是指抗氧化剂提供50%抑制作用所需的时间,也常用来表征抗氧化活性 5.对测定方法的要求 测定抗氧化剂抗氧化活性的方法应满足如下要 求: ( 1)能说明测试体系中发生的反应,并能用明确的动力学图解描述;( 2)测试要有再现性; ( 3)测试效率要足够高; ( 4)方法要相对简单; ( 5)能连续检测; ( 6)应使用与体内或食品有关的活性自由基;
抗氧化活性测定方法
抗氧化方法 一、Determination of Superoxide Anion Scavenging Ability（超氧阴离子清除能 力） 1、determined by a CL method in the pyrogallol-luminol system on a BPCL Ultra-weak luminescence analyzer。（焦性没食子酸-发光胺，荧光检 测） 2、步骤：10μL sample (不同浓度) + 50 μL焦棓酸(6.25*10-4 mol/L) + 0.94 mL of a mixture containing luminol (0.05 mol/L) and carbonate buffer (pH 10.2) （发光胺用pH 10.2碳酸盐缓冲液配成0.05 mol/L） 3、Hi-V, 800; Kv, -1; the spectral range of CL（波长范围）180-800 nm; 温 度：30 ° C.总时间：300S，每2S读数一次。 4、对照：不加样品（样品用水代替）。空白不加焦棓酸（用来调零）。 二、Determination of Scavenging Ability on Hydroxide Radicals（羟基自由基清除能力） 1、CuSO4-Phen-Vc-H2O2 CL system（1 mL体系） 2、50 μL of sample solution （样品液）+ 50 μL of a 1.0 mmol/L CuSO4 solution （CuSO4 溶液）+ 50 μL of a 1 mmol/L 1,10-phenanthroline solution（邻二氮菲溶液）+ 700 μL of a 0.05mol/L borate buffer (pH 9.0) （硼酸缓冲液）+ 100 μL of a 1 mmol/L ascorbate solution + 50 μL of a 0.15% H2O2 solution 3、总时间400S，间隔3S。Hi-V, 800; Kv, -1; the spectral range of CL（波长范围）180-800 nm; 温度：30 ° C. 4、阳性对照：不加样品（样品用水代替）。空白不加H2O2（用来调零）。 三、Determination of Scavenging Effect on Hydrogen Peroxide（过氧化氢清除 能力） 1、luminol-H2O2 system
细胞内细胞因子的检测
细胞内细胞因子的检测 细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。 活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。 胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。应用该方法，在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被
氧自由基吸收能力测定方法的研究进展
基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目（ＩＴＢＢ２Ｄ２００８－４－０７）作者简介：宋立霞（１９８２－），女（汉），硕士研究生，研究方向：植物抗氧化剂的高通量筛选。＊通讯作者 宋立霞１，２，王向社１，２，吴紫云２，３ ，李明芳１，刘兴地１，郑学勤１，＊ （1.中国热带农业科学院生物技术研究所，海南海口571101；2.海南大学农学院，海南儋州571737； 3.中国热带农业科学院橡胶研究所，海南儋州571737） 氧自由基吸收能力测定方法的研究进展 ADVANCE IN OXYGEN RADICAL ABSORBANCE CAPACITY SONG Li-xia 1,2,WANG Xiang-she 1,2,WU Zi-yun 2,3,LI Ming-fang 1,LIU Xing-di 1,ZHENG Xue-qin 1,*(1.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101,Hainan,China;2.College of Agriculture of Hainan University,Danzhou 571737,Hainan,China;3.Rubber Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Danzhou 571737,Hainan,China)Abstract:The principle,reactive mechanism,advantage and disadvantage of oxygen radical absorbance capaci －ty (ORAC)were revealed.The advance of ORAC at home and abroad was described.The significance of ORAC was explained. Key words:oxygen radical absorbance capacity;antioxidant activity;antioxidant;free radical 摘 要：介绍氧自由基吸收能力（ORAC ）法的原理、反应机制及其优缺点，综述ORAC 法在国内外的研究进展，阐明 ORAC 法在抗氧化剂评价中的研究意义。 关键词：氧自由基吸收能力；抗氧化活性；抗氧化剂；自由基 盐也有显著的鲜味。 此外，氨基酸与戊糖或甲基戊糖的还原产物4-羧基戊烯醛作用生成含有氨基类的烯醛类的香味物质[6]。氨基酸种类不同，与戊糖作用所产生的香味风味也有差别。3.3其它菌群对泡菜风味的作用 主要是酵母类，如鲁氏酵母、圆酵母、隐球酵母等。酵母菌在缺氧条件下进行酒精发酵生成乙醇，乙醇本身具有香气，还能和有机酸结合成酯类，更能增加泡菜的香气。鲁氏酵母既有酒精发酵的作用，又能分解戊糖产生4-乙基-愈创木酚[7] ， 对泡菜的风味有辅助性作用。此外，少量的醋酸菌在泡菜发酵的后期阶段也起一定的作用，产生的醋酸具有风味的同时，还能与醇类结合生成酯类，增加泡菜的香气香味。4结论 泡菜是一种营养卫生的蔬菜发酵制品，泡菜风味取决于发酵所用的蔬菜原料和发酵所用的乳酸菌种和 其他相关菌种。深入了解泡菜发酵的风味形成原理，有利于进一步改善泡菜制品的风味，有利于加速泡菜工业的产业化进程，同时可为调香师提供重要依据。参考文献: [1] 陈仲，翔董英．泡菜工业化生产的研究进展[J]．食品科技，2004（4）：33-35 [2]张静， 张锦丽，杨娟侠．乳酸菌群对乳酸发酵作用的探讨[J]．天津农业科学，2002（2）：18-20[3]郑炯，黄明发．泡菜发酵生产的研究进展[J]．中国调味品，2007（5）：22-25 [4]苏扬，陈云川．泡菜的风味化学及呈味机理的探讨[J]．中国调味品，2001（4）：28-31 [5] 周晓媛，夏延斌．蔬菜腌制品的风味研究进展[J]．食品与发酵工业， 2004（4）：104-107[6]黄梅丽．食品色香味化学[M]．北京：轻工业出版社，1984：110-112[7]庞杰，向珣．涪陵榨菜的加工及生产现状[J]．长江蔬菜，1999（2）： 42-44 收稿日期：2008-05-22 222222222222222222222222222222222222222222222222
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法（倾向于考虑DPPH法和ORAC法） 1.FRAP法:铁离子还原抗氧化能力测定法[1] FRAP(ferric ion reducing antioxidant power)方法，在低pH值的溶液中， Fe3+-TPTz(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成有色的Fe2+-TPTZ。反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。 该法快速简便、易于操作、重复性好，但FRAP反应属于电子转移(SET)反应，因此FRAP方法不能够测定氢转移反应(HAT)起作用的物质。而且该法实际测定的是待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力，因此没有抗氧化能力的生物学相关性。 2.TEAC法(trolox equivalent antioxidant capacity) ABTS(2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐)与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力，测得的结果以TEAC表示，即被测抗氧化剂清除ABTS·+的能力(吸光度大小的变化)与标准抗氧化剂trolox(VE的水溶性类似物)清除ABTS·+的能力的比值。 TEAC法十分简单，适用于大量样品的分析检测。但是，ABTS·+并非生理自由基，缺乏生理相关性，而且与FRAP方法相似，ABTS·+与不同抗氧化剂问的氧化反应时间不同，因此，只能定性不能定量评价样品的抗氧化能力。 3.DPPH法[2，3](2，2-diphenyt-l-picrylhydrazyl radical scavenging capacity) DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)法是较常用的方法之一。DPPH·是一种稳定的以氮为中心的自由基，其醇溶液呈深紫色,在517nm 处有一吸收峰。当反应系统中存在自由基清除剂时，它可以和DPPH·的单电子配对而使517nm 处的吸收峰渐渐消退。而且，这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学计量关系。因此，根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。通过计算DPPH自由基剩余一半时所需抗氧化剂的浓度(EC50)以及时间(TEC50)反应抗氧化物的活性。 DPPH法快速、简单，仅需要一台紫外分光光度计就可以测定，但DPPH方法存在的不足是，当被测物与DPPH紫外吸收有重叠时，将会影响测定结果，比如类胡萝卜素。此外，由于空间位阻决定反应的倾向，小分子化合物由于更易接近自由基而拥有相对较高的抗氧化能力。此外该方法线性范围也相对较窄，而且所有还原剂都能够对DPPH起作用，因此结果并不能完全代表抗氧化能力。
抗氧化活性测定方法的比较 ()
抗氧化活性测定方法的比较人体衰老和多种疾病均与自由基有关，寻找天然抗氧化剂具有重要意义。黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性，抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2种测试体系。 体外：抗氧化活性可以用在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。常用的方法有羟基自由基（·OH）清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH法）、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS法）、超氧阴离子自由基法（O2-·）、邻苯三酚自氧化法、β-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定（FRAP法）、总酚测定法、ORAC法等方法。体内：主要有DNA氧化损伤法、蛋白质氧化损伤法、线粒体氧化损伤法。 其中DPPH法和ABTS法操作较简单便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外分光光度测量值后计算其自由基清除率，缺点是不同物质具有组成和结构的差异，与 DPPH·、ABTS+·的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断，且DPPH自由基会和其他自由基发生反应。邻苯三酚自氧化法缺点是检测波长、缓冲液的组成及ｐＨ值、邻苯三酚浓度等关键测定条件存在着较大差异。β-胡萝卜素漂白法的缺点是β-胡萝卜素本身有抗氧化活性，对样品活性的测定结果有影响。FRAP法主要
用于食品业，优点是简单易操作、可以重复，缺点是无法测定硫醇化合物的还原能力。ORAC法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法，缺点是仪器成分较复杂，检测成本较高。 目前普遍使用的体外抗氧化活性指标一般都采用分光光度法，使用分光光度计测量各种颜色成分含量的变化。分光光度法操作较简单、便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外-可见分光光度测量值后计算其活性大小，具有成本低、效率高、样品量少等优点。分光光度法缺点是会受到样本自身颜色和浑浊度的影响和限制，颜色深的样品测得的数据误差大，甚至得到错误的结果；不同物质组成和结构存在差异，与各种自由基的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。外界环境因素对实验结果也存在一定程度的影响，有些抗氧化活性实验在冬天低温时不易成功，测得的数据往往没有规律。 我觉得在测定样品的抗氧化活性时，各种方法都有自己的优缺点，要根据需测物质来决定用什么方法，比如DPPH法的自由基选择性强，不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应，这类物质需用其他方法测定。若对检测结果要求高的可用ORAC法，若是做两个活性物质的抗氧化活性的对比可用多种方法测定后综合比较。在实际应用中，要根据样品的物理、化学特征灵活采用多种方法综合评价其抗氧化活性，使实验结果更加客观和真实。
抗氧化活性实验方法
抗氧化活性实验方法（体外实验） 1、清除DPPH自由基能力的测定 称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。分别取2mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。取上清液于517nm处测吸光值。用Vc作为阳性对照。样品对DPPH 自由基的清除率用以下公式计算： DPPH () 12 1100% A A A - =-? 清除率 A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值； A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值； A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。 2、总还原能力的测定 在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。取出后加入2.5mL 10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL 蒸馏水和0.5mL FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。Vc作为阳性对照。 3、对Fe2+离子螯合能力的测定 分别取1mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。EDTA为阳性对照。样品对Fe2+的螯合率计算公式如下： Fe2+ () 12 1100% A A A - =-? 螯合率 A0—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值； A1—样品溶液反应后的吸光值； A2—0.1mL的蒸馏水代替反应体系中FeCl2溶液后的吸光值。 4、超氧自由基（O2-）清除率的测定 采用邻苯三酚自氧化法测定。取50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）4.5mL，置25℃水浴中保温20min，分别加入1mL样品溶液和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1mL 8mmol/L HCl终止反应，于299nm处测定吸光度（A x），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。按下式计算O2-清除率：
细胞因子检测方法综述
细胞因子检测方法综述 细胞因子(cytokine)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称[1]。在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。细胞因子的检测不仅是基础免疫研究的有较手段，同时在临床疾病诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。 但是，由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困维，细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采用的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异较大，给临床诊断与治疗带来一定的困难。因此，有必要了解各种检测方法的特性及影响因素[2]。 目前，细胞因子生物学活性检测和浓度测定方法主要有以下几类 一.生物学检测法 生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSF刺激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测[2]。生物活性检测法又可分为以下几类： 1．细胞增殖法 许多细胞因子具有细胞生长因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2刺激t细胞生长、IL-3刺激肥大细胞生长、IL-6刺激浆细胞生长等。利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依赖株ctll-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况（如使用3h-tdr掺入法、MTT法等）鉴定IL-2的含量。除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。 2．靶细胞杀伤法 是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。 3．细胞因子诱导的产物分析法 某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。 4．细胞病变抑制法 病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。 二、免疫学检测法 细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。随着重组细胞因子的出现，可较方便地获得细胞因子的特异性抗血清或单克隆抗体，因此可利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。尽管细胞因子种类繁多，只要获得了针对某一因子的特异性抗体（包括多克隆抗体或单克隆抗体）均可采用相似的技术开展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印迹法。目前，几乎所有常见细胞因子的检测试