自由基及检测方法

ESR

电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。

自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。

H：

V：

ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？）

(MGD)2 - Fe2 +,是含有10mmol·L- 1MGD 和2mmol·L- 1FeSO4的溶液。

体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定

体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定

腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。

通用捕获剂

典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基基因给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感，

ESR 技术检测O-2

O-2可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron 半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题

ESR 技术检测·OH

DMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。它与·OH产生的自旋加合物的ESR谱表现出特别容易识别的特征谱线。在溶液中容易形成的自我捕集产物二聚体自由基不会干扰实验结果。

ESR 技术检测血红蛋白结合的一氧化氮

在组织或血液中，一氧化氮大多与氧或过渡金属反应生成了硝酸盐或亚硝酸盐以及一氧化氮与金属的配合物。一氧化氮与血红蛋白的结合速率常数非常高，而且能够得到有特征的ESR 波谱。利用这一性质，我们可以用血红蛋白作为一氧化氮的捕集剂检测一氧化氮自由基。但是，HbNO 极易氧化，这就限制了这种方法在富氧条件下的应用。

ESR 技术检测生物体系产生的一氧化氮

一氧化氮与含金属蛋白反应产生的亚硝酰的金属配合物，往往会抑制细胞中许多重要的酶，对细胞产生毒害作用。目前应用较多的捕集剂的有Fe2+- (DETC)2，它可与一氧化氮形成稳定的单亚硝酰-铁配合物MNIC，给出特征的ESR 波谱。但由于Fe2+-( DETC)2不溶于

水，在一定程度上限制了它的使用。铁配合物捕集一氧化氮的最新进展得益于Komarov等人的研究，他们使用DETC 的衍生物MGD，与亚铁离子合成稳定的亲水性配合( MGD)2- Fe2+，该配合物易溶于水( MGD)2-Fe2+非常适合捕集检测活细胞或组织中放的一氧化氮。但MNIC-DETC为疏水性物质，MNIC-MGD 为亲水性物质; MNIC-DETC 可附着于细胞膜甚至进入细胞，而MNIC-MGD 不能进入细胞。因此，根据其各自的特性，实验中应选取不同的捕捉剂。

分光光度法

概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。

特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。

原理：利用自由基使显色剂发生颜色变化, 根据吸光度的变化值而间接测得自由基的含量1、羟基自由基

1．1 水杨酸法

Fenton 反应产生·OH, ·OH 氧化水杨酸得到2 , 3-二羟基苯甲酸, 用其在510 nm 处的吸光度值表示·OH的多少, 吸光度值与·OH的量成正比。

1．2 细胞色素C 氧化法

其反应机理为·OH能使还原型细胞色素C(浅红色)氧化成氧化型细胞色素C(浅黄色) 通过测定反应体系中吸光度的减少量(550 nm) , 间接测得·OH的含量。

1．3 脱氧核糖法

采用Fe3 +-EDTA-抗坏血酸-过氧化氢体系产生·OH。此方法中脱氧核糖作为·OH的攻击目标。脱氧核糖受·OH攻击后裂解, 在酸性、加热的条件下可与硫代巴比妥酸反应生成红色化合物。可根据在532 nm 处测定的吸光度值来间接反映·OH的含量。

1．4 DMSO

羟自由基氧化DMSO生成的甲醛与2,4-二硝基苯肼（DNPH）反应在碱性条件下生成稳定的酒红色腙类物质，其最大吸收波长为390nm，分光光度法测定其含量可间接测定羟自由基的生成量。

1.5氧化褪色分光光度法

亚甲兰(MB)、二甲基亚砜（DMSO）、溴邻苯三酚红(BPR)、茜素紫、邻二氮菲-Fe2+ Fenton 反应产生·OH, ·OH使邻二氮菲-Fe2+氧化为邻二氮菲-Fe3+, 使邻二氮菲-Fe2+在536 nm 处的最大吸收峰消失。根据536 nm 处吸光度变化判断受试物清除·OH的能力。需要注意的是, 测定时加样方法对结果有重要影响, 需先将邻二氮菲、PBS 及水混匀, 并且每管加入FeSO4后立即混匀, 否则会使局部颜色过浓, 影响结果的重复性。

2、超氧自由基

超氧自由基的分光光度法测定, 最常用的方法有细胞色素 C 的超氧自由基还原法和硝基四氮唑蓝(nitro bluetetrazolium , NBT) 还原法。

具有氧化活性的细胞色素C被O2-还原后, 形成了在波长550 nm 处有强吸收的亚铁细胞色素, 可以用于O2-的测定。但是, 细胞色素C还原法的体系中如果存在着其他还原性物质便会对结果造成干扰, 如还原性酶的干扰。

NBT 在O2-的作用下, 还原生成不溶于水、蓝色的二甲臜(Diformazan), 它的最大吸收波长560 nm , 吸光系数达10000 以上, 测定灵敏度相当高。

肾上腺素氧化法以肾上腺素氧化为肾上腺素红作为O2-生成的指标。测定310 nm处肾上腺素红的产量可间接测出反应体系的O2-含量。该法操作简便, 而且灵敏度可以设法增加, 但干扰因素较多。

在羟胺氧化法中O2-可氧化羟胺生成亚硝酸根,在酸性条件下, 亚硝酸与氨基苯磺酸和N2甲奈基二氨基乙烯反应生成红色化合物, 后者在530 nm 处有最大吸收峰,测定在530 nm 处的吸光度变化, 可以间接的反映O2-的含量, 但是该方法存在一定的缺点, 如甲萘胺溶液不稳定、空白值较大等。

3、NO

Griess 试剂由磺酸( sulpheilic acid) 和萘乙二胺组成。在酸性条件，这一试剂可以与亚硝酸盐反应生成红色物质在545 －-555 nm 有一个最大吸收。可以用分光光度计检测。Griess 试剂法最大的优点是简便易行，通常只需要将试剂加入待测的样品中即可。但是这种简单做法在生物体系中却常常不能准确反映一氧化氮的生成量。因为一氧化氮会发生反应，并依环境及时间按一定比例生成亚硝酸盐或硝酸盐。另外，某些生物体系如血液，尿液及体液中本身就存在一定浓度的硝酸盐和亚硝酸盐，这就需要使传统的Griess 法与新的技术相结合，增加灵敏度并同时检测硝酸盐及亚硝酸盐的含量

4、CAT

CAT作用于底物中过氧化氢,使过氧化氢分解成水和氧气,体系中残留的过氧化氢再与钼酸胺作用生成黄色复合物,其呈色的深浅可用分光光度计进行测定,从而反应出过氧化氢酶活性,是一个简易快速及精确的检验方法。

5.SOD

5.1 细胞色素C还原法

细胞色素C还原法(McCord法)：原理是黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的O2-使一定量的氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C，后者在550nm有最大光吸收。在SOD存在时，由于一部分O2-被SOD催化而歧化O2-还原细胞色素C的反应速度则相应减少，即其反应受到抑制。将抑制反应的百分数与SOD浓度作图可得到抑制曲线，由此计算样品中SOD 活性。本法是间接法中的经典方法，但本法灵敏度较低。

5.2 NBT法

O2-可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活力单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所用的酶量。5.3邻苯三酚自氧化法

利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为绿色，最后转变为黄色。黄绿色产物在325nm处测定溶液的吸光度。加入酶液使O2-歧化，产生O2和H2O2,是中间产物不能累积。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加。

6、GSH-Px

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。硒是GSH-Px酶系的

组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。

总体上来说, 分光光度法操作简单, 费用少, 仪器设备价格低廉, 但存在检测的灵敏度较低, 检测限较高, 专一性不强等缺点。

分光光度如何定量

根据朗博（Lambert）-比尔（Beer）定律：A=abc

式中A为吸光度，b为溶液层厚度（cm），c为溶液的浓度（g/dm3），a为吸光系数。

其中吸光系数与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。

化学发光法（CL）

化学发光的原理是发光剂被自由基氧化成激发态，反应物或产物分子从中获得能量的电子激发，形成电子激发态, 当返回基态时, 以发射光子的形式释放能量, 这一过程称为化学发光(CL) 。

常用的发光试剂鲁米诺（氨基苯二酰一肼）和光泽精（N，N二甲基二吖啶硝酸盐）鲁米诺可检测活性氧（氧、H2O2、O-2、·OH）、LPO、NO

在碱性溶液中(p H 10 左右) , 首先形成单价阴离子, 然后在催化剂, 如酶, Fe2 +, Co2 +, Ni2 +和Cu2 +等过渡金属离子或者金属络合物的催化下与溶液中的溶解氧或者过氧化氢发生氧化还原反应, 生成激发态的两价阴离子氨基肽酸盐(APD) ,APD 经非辐射性跃迁回到基态时, 放出光子。检测光的强度就可以确定自由基含量。

光泽精对O-2有特异性

在碱性条件下, 光泽精与O-2等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶(N2methylacridan) 。利用光泽精化学发光法也可检测细胞线粒体内特定种类的自由基: 光泽精通过其本身的正电荷与线粒体内膜上负电荷之间的作用通过线粒体膜线粒体内膜后首先被还原成单价光泽精自由基, 然后光泽精自由基与O-2反应生成不稳定的中间物并分解出激发态分子, 激发态分子跃迁到基态的过程中释放光子, 通过微弱发光仪测定发光强度, 以此间接测定O-2的生成及数量。但是在实际应用中, H2O2 的分解过程同样会产生O2- ·自由基, 可能会影响结果的准确性。

臭氧测NO

臭氧与一氧化氮反应速度极快，发光强大。基于一氧化氮和臭氧反应原理的化学发光检测灵敏度高，但是只能检测气相体系的一氧化氮，目前很多实验作了种种改进，也可检测液相中的一氧化氮，甚至将硝酸盐及亚硝酸盐还原为一氧化氮来检测。

NO+O3→NO2·NO2·→NO2+h

化学发光法是一种灵敏、准确检测自由基的方法。与ESR和HPLC法相比，具有操作简便、设备成本较低、测定快速等优点。

化学发光法缺点（评价）

缺点：但是在进行复杂样品分析的时候，由于发光体系的选择性很差，不能对待测组分很好的定性，是其在实际应用中受到了很大限制。

优点：化学发光法是一种简便、快速、灵敏的痕量分析方法。对于成分简单的样品，通过标

准曲线法、标准加入法等可以直接对待测组分进行很好的定量分析。

需要注意的是：不同的反应体系需要不同的PH条件。

荧光分析法

荧光探针法

原理：荧光探针法测定技术的核心是荧光探针, 探针本身应该没有荧光或只有很弱的荧光, 能很容易通过细胞膜, 但在细胞或细胞器内被自由基氧化后发出较强的荧光。

常用的荧光探针有 2 ,7-二氯荧光黄乙酰乙酸（DCFH-DA）、DAF-FMDA 、双氢罗丹明123 (DHR) 、二氢乙锭(DHE) 等

可检测O2- 、· OH 和NO

DCFH-DA具有亲脂性, 很容易通过细胞膜, 进入细胞后在细胞内脂酶的作用下脱去乙酸盐基团成为有极性的DCFH , 但DCFH不产生荧光, 细胞胞浆中的氧化物能够氧化DCFH 为能发出很强荧光的2 ,7-二氯荧光素(DCF) ,激发波长为488nm,发射波长为525nm。DCF 形成量与细胞氧化物水平成正比例关系, 因此, 其荧光强度间接代表细胞内过氧化物的水平。

可检测：O2- ·、OH ·

DAF-FMDA可以穿过细胞膜(cell-permeable)，进入细胞后可以被细胞内的酯酶催化形成不能穿过细胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身仅有很弱的荧光，但在和一氧化氮反应后可以产生强烈荧光，激发波长为495nm，发射波长为515nm。

可检测：NO

DHR本身没有荧光，它被氧化后（与单线态氧结合）就生成具有强荧光性质的RH。

使用DCFH-DA 与DHR 时,仪器的激发波长488 nm , 发射波长在525 或530 nm 左右。测胞浆内自由基, 往往用DCFH-DA 探针; 而测线粒体内的自由基, 则常用DHR 作荧光探针。

可检测：O2-、·OH

DHE能自由透入细胞内被O2-直接氧化成溴化乙锭(EB) , EB 的荧光强度与O2-浓度成正比, 从而间接反映O2-的含量。使用HE时, 仪器的激发波长488 nm , 发射波长在610 或650 nm 左右

可测：O2-

任何可以检测fluorescein的仪器，包括荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计或荧光酶标仪都可以用于该荧光探针的检测。

2-吡啶甲醛苯并噻唑啉只能被O2-氧化，而共存的双氧水和羟基自由基都不能使其在测定波长下的荧光发生变化，所以探针试剂对O2-具有专一性。

激光诱导荧光成像法是目前惟一的·OH直接检测方法,它是利用激光照射· OH使其发出特征荧光,用特殊相机记录荧光密度,从而测算被测分子基团浓度。

荧光光度法

用荧光光度法来检测自由基的含量时, 使用的捕获剂在捕获自由基后会发生荧光强度的变化。

利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。可以从发射光谱或激发光谱进行分析。

可以检测：·OH、LPO

在常见的捕获剂中, 荧光强度减弱的捕获剂有Ce3 +、罗丹明6G、水杨基荧光酮, 而荧光增强的有苯甲酸、Hantzsch 反应等, 下面就分别从这两方面介绍常见捕获剂的应用。1．1 荧光减弱的捕获剂

方光荣等研究了OH ·与Ce3 +的反应, 表明在酸性条件下, 有强荧光的Ce3 +被氧化生成无荧光的Ce4 +。测定反应前后荧光强度的下降可间接测定羟基自由基的含量, 该方法可作为筛选抗氧化剂的方法。

碱性介质中罗丹明6G能产生特征荧光, 其最大激发波长和发射波长分别为350和550 nm , Mn2 +-H2O2体系在碱性介质中产生的羟自由基可以迅速氧化罗丹明6G使其荧光猝灭, 如果存在抗氧化物质可以清除羟自由基, 便会使溶液的荧光猝灭程度降低, 据此建立了测定抗氧化活性的方法。

任凤莲等人的实验发现Co2 +与H2O2反应生成羟自由基的产率比Fenton 试剂高100 倍以上。采用水杨基荧光酮(SAF)-Co2 +-H2O2荧光法测定羟自由基的新体系, 激发波长和发射波长为510 和500 nm , 测定体系在反应前后的荧光变化,可间接测定羟自由基的产生量。

除了这几种常见的捕获剂外, 还有一些研究者采用了其他的试剂, 荧光素钠本身能产生特征荧光, 其激发波长和发射波长分别为491 和512nm。

在碱性介质中, Mn2 +-H2O2体系产生的羟自由基可以迅速氧化荧光素钠使荧光猝灭。张爱梅等提出检测Fenton 反应产生羟自由基的方法。羟自由基与吖啶红发生反应后, 吖啶红的荧光强度减弱, 测定其荧光强度的变化, 可间接测定羟自由基的产生量。

1．2 荧光增强的捕获剂

谷学新等利用Fenton 反应产生的羟基自由基氧化DMSO 生成的甲醛与乙酰丙酮、氨发生Hantzsch 反应, 产物 3 ,5-二乙酰-1 ,4-二氢吡啶产生特征荧光, 其最大激发波长和最大发射波长分别为491 和512 nm。通过测定荧光强度的变化可以间接定量测定羟基自由基的产生量。

荧光光度法可以定量

A=εcl ε、l为常数，可以根据所得的A计算出c

激发波长，荧光波长

激发波长：仪器给出的激发光波长

荧光波长：样品被激发光照射后，发出荧光的波长

CE 铈shì

HPLC

HPLC法测定需要先用捕捉剂捕获自由基，捕捉剂应能与自由基反应形成稳定的结合物，且易于分离与检测。一般的·OH捕捉剂是安息香酸/水杨酸(SA)、苯二甲酸、二甲亚砜(DMSO)等。·OH与二甲基亚砜反应生成甲磺酸,可以通过HPLC来测定其含量,从而推测·OH 的含量。

这种方法具有测量方便,高效,灵敏度高,检测限可达10-9~10-11g等优点，但是,又因为它需要昂贵的设备并且反应过程比较复杂,有很多的中间产物与支线产物,所以在自由基的准确定量检测上,仍显不足。

HPLC定性定量

定性：用“标样”的保留值定出被测组分的位置。

定量：定量分析的具体内容：确定样品的类型，主要成分/痕量成分；使分析条件的分离度（R）大于1.5；色谱峰的定性，峰一致性测定；检测限及定量限（确定灵敏度及线性范围）；用标样建立标准曲线

常用的定量方法：

1.峰面积百分比法：由于检测技术的影响，在液相色谱中不常

公式：C%=（A i/∑A i）*100%

特点：各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点；与进样量无关；不需标样；简单

2.外标法：在液相色谱中用的最多

配制一系列已知浓度的标样

计算公式：校正因子：RF（xi）=标样浓度C（X i）/ 标样响应值R（X i）

未知组分的浓度：C i=RF（Xi）* 样品响应值A i

特点：无需各组分都被检出、洗脱；需要标样；标样及样品测定的条件要一致；进样体积要准确

3.内标法：准确，但是麻烦；在标准方法中用的最多

配制一系列浓度的标样，其中加有内标样

计算公式：

校正因子：RF（xi）=内标样响应值R（I.S）/标样响应值R（X i）*标样浓度C（X i）

未知组分的浓度：C i=RF（Xi）*（样品峰面积A i/内标峰面积A i.s）

特点：无需各组分都被检出、洗脱；需要标样，需要内标样；结果与进样体积无关

自动电位滴定法

电位滴定法与直接电位法的不同在于，它是以测量滴定过程中指示电极的电极电位（或电池电动势）的变化为基础的一类滴定分析方法。滴定过程中，随着滴定剂的加入，发生化学反应，待测离子或与之有关的离子活度（浓度）发生变化，指示电极的电极电位（或电池电动势）也随着发生变化，在化学计量点附近，电位（或电动势）发生突跃，由此确定滴定的终点。

在滴定管末端连接可通过电磁阀的细乳胶管，此管下端接上毛细管。滴定前根据具体的滴定对象为仪器设置电位（或pH）的终点控制值（理论计算值或滴定实验值）。滴定开始时，电位测量信号使电磁阀断续开关，滴定自动进行。电位测量值到达仪器设定值时，电磁阀自动关闭，滴定停止。

现代的自动电位滴定已广泛采用计算机控制。计算机对滴定过程中的数据自动采集、处理，并利用滴定反应化学计量点前后电位突变的特性，自动寻找滴定终点、控制滴定速度，到达终点时自动停止滴定，因此更加自动和快速。

其原理是: 以过量的Fe2+与羟基自由基反应, 然后用重铬酸钾返滴剩余的Fe2+, 进而可以计算出羟基自由基浓度。自动电位滴定法以铂电极为指示电极, 双盐桥饱和甘汞电极作为参比电极, 根据滴定过程中化学计量点附近的电位突跃来确定电位滴定终点, 并记录化学计量点电位值E0。锁定此电位值后, 由仪器完成待测样品的自动滴定过程。

滴定过程中的主要反应式:

H++Fe2++·OH→Fe3++H2O

Cr2O72-+6Fe2++14H+→6Fe3++2Cr3++7H2O

由于电位滴定中所测得是相对电位变化, 而不是绝对值, 所以在直接电位法测量中的一些影响因素,可以忽略不计, 另一方面由于终点电位突跃变化大,测定中标准电位不稳定所引起的滴定误差是很小的,这就容易得到准确的结果, 特别是对测定较高浓度的样品, 其优点更为明显。

自动电位滴定法评价

将电化学分析和氧化还原法结合起来，与氧化还原滴定相比，自动电位滴定由于不受指示剂以及人为判断滴定终点的影响，操作过程中误差小，分析结果准确度高、稳定性好。该方法终点判断简单、操作简单、测定快速、成本低廉，可作为一种简便易行的测定羟自由基浓度的方法。

极谱法

极化电极（滴汞电极）通常和极化电压负端相连，参比电极（甘汞电极）和极化电压正端相连。当施加于两电极上的外加直流电压达到足以使被测电活性物质在滴汞电极上还原的分解电压之前，通过电解池的电流一直很小（此微小电流称为残余电流），达到分解电压时，被测物质开始在滴汞电极上还原，产生极谱电流，此后极谱电流随外加电压增高而急剧增大，并逐渐达到极限值（极限电流），不再随外加电压增高而增大。这样得到的电流-电压曲线，称为极谱波。极谱波的半波电位E1/2是被测物质的特征值，可用来进行定性分析。扩散电流依赖于被测物质从溶液本体向滴汞电极表面扩散的速度，其大小由溶液中被测物质的浓度决定，据此可进行定量分析。

·OH氧化二甲亚砜（DMSO），生成的甲醛和乙酰乙酯和氨发生Hantzsch反应，反应产物3,5-二乙氧基羰基-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶在-1.09V（对饱和甘汞电极）处有一灵敏的二阶导数极谱峰。通过电流变化可间接测定·OH产量，可用于筛选自由基清除剂和在线测定·OH。此法灵敏度高、操作简便。