超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧阴离子清除能力邻苯三酚法
超氧阴离子清除能力邻苯三酚法1 超氧阴离子的来源超氧阴离子(O2•-)是一种高活性自由基，是氧气分子失去一个电子后产生的。
在生物体内，超氧阴离子通常由线粒体电子传递链产生，同时也可以由细胞质中的NADPH氧化酶生成。
2 超氧阴离子的损害超氧阴离子是一种极其活泼的氧化剂，可以与细胞内的脂质、蛋白质和核酸等大分子发生氧化反应，并引起细胞的损害。
长期以来，科学家们一直在研究如何有效地清除超氧阴离子，以保护细胞免受其损害。
3 邻苯三酚法的原理邻苯三酚法是一种用于清除超氧阴离子的方法，该方法利用邻苯三酚的还原能力，将超氧阴离子还原成氧气分子，以达到清除超氧阴离子的目的。
邻苯三酚法的原理如下：① 邻苯三酚在氧气存在下被氧化成半醌，1C6H5-1C(OH)2-2C6H4 +O2 →C6H5-1C(O)2-2C6H4+H2O2② 半醌进一步被氧化成互相联结的二聚体，1C6H5-1C(O)2-2C6H4+C6H5-1C(O)2-2C6H4→(C6H5-1C(O)2-2C6H4)22③ 该反应同时产生超氧阴离子，1O2 +e-→O2•-2导致增加超氧阴离子的浓度。
④ 当邻苯三酚浓度超过一定程度时，它具有还原能力，可以将超氧阴离子还原为氧气分子，1O2•- + 2C6H5-1C(O)2-2C6H4→2C6H5-1C(OH)2-2C6H4 +O24 邻苯三酚法的应用邻苯三酚法已被广泛用于生物学、医学和环境科学等领域。
在生物学中，这种方法被用于研究超氧阴离子在细胞中的作用。
在医学中，邻苯三酚法被应用于治疗一些慢性气道疾病，如支气管哮喘。
在环境科学中，邻苯三酚法也被用于去除环境中的有害物质，如重金属离子。
5 邻苯三酚法的不足虽然邻苯三酚法是一种有效清除超氧阴离子的方法，但它也存在一些不足之处。
一方面，邻苯三酚的使用受到其毒性和生物可降解性的限制；另一方面，邻苯三酚的还原能力相对较弱，反应速度较慢，因此需要较长时间来消除超氧阴离子。
DPPH自由基清除测定
DPPH法测定黄苓黄酮的抗氧化活性抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。
目前对自由基清除剂的研究方法主要有2类，一类是体外模型，另一类是体内模型，其中DPPH法是体外模型中最常用的方法。
DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。
它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。
向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH •使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。
即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH •的效果，来计算抗氧化能力。
实验研究表明，黄苓黄酮中清除DPPH自由基活性的主要成分是黄苓苷[1]，黄苓苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应，反应式如下：O2NN02 NO2DPPH与抗氧化剂反应原理材料：DPPH（ 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）；无水乙醇;仪器：分光光度计1. DPPH贮备液的制备准确称取DPPH试剂3 . 5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol / L DPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。
2. 试液的制备（只作参考）准确称取5.2mg干燥的黄酮提取物（32.75%）,用无水乙醇溶解，并定量转入50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0233mmol/L 试液。
3. DPPH-清除率的测定在10mL比色管中依次加入 4.0mLDPPH溶液和黄酮提取液，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值（A），吸光值记为Ai，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。
超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)
超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)简介：超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。
Leagene 超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)又称超氧阴离子清除能力检测试剂盒，其检测原理是利用羟胺氧化的方法可以检测生物体系中超氧阴离子自由基(O 2-)，即超氧阴离子自由基(O 2-)与羟胺反应生成NO 2-，在一定范围内颜色深浅与超氧阴离子自由基(O 2-)成正比，根据NO 2-反应的标准曲线将A 530换算成NO 2-浓度，再依据上述关系式即可计算出O 2-浓度。
该试剂盒主要用于测定植物组织中的超氧阴离子自由基含量或超氧阴离子清除能力。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、 蒸馏水2、 实验材料：植物组织(大豆、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等3、 研钵或匀浆器4、 离心管或试管5、 低温离心机6、 恒温箱或水浴锅7、 比色杯8、 分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号 名称TO1123 50T Storage试剂(A): NO 2-标准(1mM) 1ml RT 试剂(B): O 2- Lysis buffer 125ml RT 试剂(C): 羟胺溶液30ml RT 试剂(D): 氨基苯磺酸显色液 30ml 4℃ 避光 试剂(E): 萘胺显色液 30ml4℃ 避光 使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取预冷的O2-Lysis buffer后冰浴条件下匀浆或研磨，4℃离心，上清液即为超氧阴离子自由基提取液，4℃保存备用。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，4℃保存，用于超氧阴离子自由基的检测。
植物超氧阴离子自由基含量的测定
植物超氧阴离子自由基含量的测定一、实验目的学习测定植物组织中超氧阴离子自由基含量的方法二、实验原理进入生物体内的一些分子氧（O2），可经单电子还原转变为超氧阴离子自由基，特别是在逆境条件下这种单电子还原的几率更大。
超氧阴离子即可直接作用于蛋白质和核酸等生物分子，也可衍生为羟自由基、单线态氧、过氧化氢及脂质过氧化物自由基等活性氧，引起对细胞结构和功能的破坏。
因此测定逆境条件下植物组织中超氧阴离子自由基产生及清除速率，可间接了解组织细胞受损状况和抗性强弱。
超氧阴离子自由基（O2−·）能与羟胺反应，生成N O2−，N O2−能与对氨基苯磺酸和а-萘胺反应生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm波长处具有显著光吸收。
因此利用羟胺氧化的方法可以测定植物组织中超氧阴离子自由基（O2−·）的含量。
三、器材与试剂1．实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（10mL）、分光光度计2．实验试剂65mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.8）；提取缓冲液；10mmol/L盐酸羟胺溶液；标58mmol/L对氨基苯磺酸溶液；7mmol/L а-萘胺溶液；50μmol/LKNO2准溶液3．实验材料小白菜、小麦四、实验步骤1.制作标准曲线取7支试管，编号，按表1分别加入各种试剂，摇匀。
置25℃保温箱20min。
分别加入1mL 58mmol/L 对氨基苯磺酸溶液和1mL 7mmol/Lа-萘胺溶液，混匀。
25℃保温20min，以0号管为对照进行调零，立即在波长530nm处测定吸光度。
以吸光度值为纵坐标，N O2−物质的量（5μmol）为横坐标，制作标准曲线。
表1 标准曲线试剂表2.提取取逆境处理的小白菜或者小麦叶片，正常条件下生活的叶片作为对照，剪碎混匀，分别称取1g样品，加入3ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆，于8000r、4℃离心10min，收集上清液，此液为植物O2−提取液。
中药对超氧阴离子自由基清除率的测定
第１ 期
林祥 潮等 ：中药对 超氧 阴 离子 自由基 清 除率 的测 定
３ ３
在表 ｌ 示 的光度 法 中，羟 胺氧 化法 由于 甲萘 胺溶 液不 稳定 ，因而 线性相 关性较 差 ；氯 所 化硝 基 四氮 唑蓝还 原法 和 四 甲基 偶氮 唑盐还 原法 都 需要 昂贵 的氮 唑类 化合 物 ； 照核黄 素法 光 中硫 代碳 酰腙 类化 合物 需要 合成 ；酶催 化法 需要 昂贵 的酶试 剂且 测定 条件 苛刻 ；而本 方法 只 需 用天 青 Ｉ 为指 示物 质 ，指示 反应简 单直 接 ，且指 示物质 易得 价廉 ，体 系稳 定性好 ，能快 作
液后 ， 向其 中一 支加 入 ０８ ０ｍｍｏ Ｌ的邻 苯三 酚溶 液 ，另一支 不加 。分 别用水 稀释 至 ．０ ３ ｍＬ ｌ ／
刻度 ，在 室温 下反应 １ ｎ ５ ｍｉ，以水 为参 比，用 １ ｍ 比色皿在 ６ ２ ｌ 波长 处测 定体 系 的吸光 ｃ ０ Ｙ ｎｌ
度 。设不加 邻苯 三酚 时体 系 的吸光度 为 ｏ ，加 入邻 苯三 酚后 体系 的吸光 度 为 １ ，则超氧 自
超氧 阴离 子 自由基 （ ２・ ０ 。）作 为生物 体所产 生 的一种 自由基 ，大 量研 究证 明 ， 自由基 的
作用 与 生物 衰老 、某些 疾病 的发病 机制 密切相 关 。关 于它 的清 除方法 ，光度 测 定 已有 一些报 道 【 ］ 以天青 Ｉ为指示 物质 ，褪 色光 度法 测定 中药 清 除超氧 阴 离子 自由基 未见 报 道 。本 １ ，但 文研 究发现 ，在一 定条 件下 ，天 青 Ｉ 能被超 氧 阴离子 自由基氧 化而褪 色 ，中药提 取物 可 以清
度值 记为 ２ 。 超氧 自由基清 除率 Ｒ ％ ： 二 × ０ ／ １０ ４
A清除自由基实验方法
1、DPPH 自由基清除实验取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL 乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。
同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度A b。
4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。
自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。
2、ABTS 自由基清除实验20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。
该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。
加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。
ABTS 溶液作空白吸光度为Ar，样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。
ABTS＋自由基清除率(%)＝[1-(At-A0)/Ar]×100式中：At 为样品的吸光值；Ar 为空白的吸光值。
3、超氧阴离子清除实验采用邻苯三酚自氧化法，取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL，混匀后在25 ℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液2 mL，取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制，空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液)，摇匀后倒入比色皿，325 nm下每隔30 s 测定吸光度，连续测定4 min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。
在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。
植物组织超氧阴离子自由基含量测定
植物组织超氧阴离子自由基含量测定一、实验原理超氧阴离子是植物体内重要的信号分子，同时，在逆境环境或细胞衰老时，氧作为电子传递的受体，易得到单电子而形成超氧阴离子。
它是细胞内生成的第一个氧自由基，能启动自由基连锁反应，经过一系列反应转化生成过氧化氢、羟自由基、单线态氧等其它的氧自由基，最后导致植物细胞的氧化损伤。
利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中超氧阴离子含量。
超氧阴离子与羟胺反应生成亚硝酸根，亚硝酸根在对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对-苯磺酸-偶氮-α-萘胺）。
取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值可以算出样品中超氧阴离子含量。
二、实验仪器高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；洗耳球等。
三、实验试剂0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；10mmol/L盐酸羟胺；17mmol/L对氨基苯磺酸；7mmol/L α-萘胺；5µg/mL亚硝酸钠标准液四、实验材料小麦叶片五、实验步骤1、亚硝酸根标准曲线制作按照下表分别加入亚硝酸钠标准液和蒸馏水：氨基苯磺酸和α-萘胺各1mL），置于25℃显色15min，然后以1号管调零，在530nm波长处测定其余管的吸光值。
最后以1-9号管亚硝酸根含量为横坐标，吸光度值作纵坐标，求出方程式标准曲线回归直线。
2、超氧阴离子含量测定（1）提取液制备：称取1g小麦叶片放入研钵中，加入少许预冷的50mmol/L 磷酸缓冲液（PH7.8），研磨成匀浆，最后定容至5mL，摇匀后，在4℃，3000r/min 下离心10min，取上清液，在4℃,12000r/min下离心20min，取二次上清为提取液。
（2）取4支试管，按下表加入溶液各1mL混匀，置于25℃下显色15min，最后以1号管调零，在530nm波长处测定其余管吸光值。
六、实验结果及计算求平均值得A530为0.073。
通过标准曲线回归方程求得亚硝酸根含量为2.36nmol/mL ，反应体系中提取液为1mL，故反应体系中中亚硝酸根含量为2.36nmol。
清除氧自由基
1、超氧负离子黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统产生超氧负离子产生超氧负离子黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、清除超氧自由基负离子O2-徐艳,曲婷婷. 甘草消除氧自由基的体外研究[J]. 食品研究与开发,2006,(8).2、1.2.2NBT 光还原反应中主要试剂的配制1.2.2.1 测试缓冲液:0.026 mol/LMet- 磷酸钠缓冲液具体配制方法:首先配制0.1 mol/LpH7.8Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液a 称取Na2HPO4·12H2O( MW=358.14) 3.581 4 g 于100 mL 小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。
b 称取NaH2PO4·2H2O(MW=156.01)0.780 g 于50 mL小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。
c 量取91.5 mL a 液与8.5 mL b 液混合后, 该液即为0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液。
d 称取L- Met( MW=149.2) 0.194 1 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液定容至刻度。
1.2.2.2 NBT( 氯化硝基四氮唑蓝) 的配制(7.5×10-4mol/L)称取NBT( MW=817.7) 0.061 3 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。
1.2.2.3 核黄素溶液(2×10-5 mol/L)a.称取EDTA( MW=292) 0.002 92 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。
b.称取核黄素( MW=376.36) 0.073 5 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧
化法）
（适用于：SOD及各种抗氧化剂）
操作图解
具体方法
1 溶液配制
1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）
40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH
计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）
取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液
2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
（空白参比：Tris-HCl 缓冲液）
ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。
由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。
此时的ΔA为ΔA0。
3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。
（空白参比：Tris-HCl缓冲液）
ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。
此时的ΔA为ΔA样。
3 计算公式
清除率＝(ΔA0-ΔA样)/ΔA0 *100
4 注意事项
由于连苯三酚自氧化反应对温度和pH值很敏感，而pH值又受温度的波动而变化。
因此，实验过程中，要严格控制温度。
缓冲液宜多，比色皿用3.5mL规格。
这样数据才比较稳定。
5 实验结果（以原儿茶酸为例）
采用文献[1]的改进方法，测原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力，结果如图2（pH7.4）。
用旧方法，在pH8.2时测量，结果有很大误差，是不可取的。
图2 原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力的对比（pH7.4 vs pH8.2）
参考文献:
[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.
致谢：本文由广州中医药大学李熙灿教授依据其发表的论文[1]，整理而成。