慢病毒载体构建和包装操作手册
过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1
过表达慢病毒载体构建和包装手册Version1.0吉凯基因二零一一年五月目录简介 (3)第一部分过表达慢病毒载体的制备实验流程 (4)实验材料 (5)过表达克隆制备 (6)第二部分慢病毒包装与滴度检测实验流程 (17)实验材料 (18)L e n t i v i r u s病毒包装 (21)病毒的收获及浓缩 (22)L e n t i v i r u s滴度测定 (24)参考文献 (33)简介慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。
吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。
慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。
吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。
GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。
通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。
pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。
pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。
吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。
慢病毒(过表达)包装步骤
慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。
转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。
⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。
2.收毒(36—48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。
⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。
4000rpm离心至所需体积。
⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。
由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。
3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。
将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。
4.检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。
如需培养成细胞系,可继续培养。
如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。
慢病毒包装操作说明
Clontech-Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User ManualProtocol No.PT5135-1慢病毒包装操作说明A.用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液，用Lenti-X 293T细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间。
所有的Xfect™转染成份，量和条件最好用Lenti-XVectors，Lenti-XHTX包装混合物，Lenti-X293T细胞。
用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。
所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。
包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。
61.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×10个293T细胞，添加10ml的生长培养基。
在37℃，5%CO2℃条件下过夜。
在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。
2.充分混均Xfect Polymer。
3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)557µlXfectReaction Buffer592.5µl Xfect ReactionBuffer36µl Lenti-X HTX Packaging Mix7.5µl Xfect Polymer7µl Lenti-X Vector DNA(1µg/µl)600µl 总量600µl 总量注意：Xfect Polymer不要在室温下搁置长于30min4.充分混均每个管5.把Tube2添加到Tube1中，中速涡旋10秒。
慢病毒包装步骤
慢病毒包装步骤慢病毒包装步骤慢病毒包装简要步骤：以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。
轻柔混匀，室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。
室温孵育20min4、用胰酶消化并记数293T细胞。
用含血清的培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。
37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。
3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
注意事项1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。
质粒转染的步骤1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~32、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。
3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。
步骤如下：以24孔培养板为例1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。
汉恒生物-慢病毒生产及使用操作手册第二版
2. 感染细胞最佳 MOI 的测定 MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒
数，通常 MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 对于分裂活跃的细胞，比如 Hela、293 细胞，MOI=1～3 时，80%以上的细胞均表 达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行 MOI 梯度摸索实验，选择适合的 MOI 进行实验。
四、慢病毒包装和浓缩 （一）质粒扩增
构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于 1ug/ul,A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进 行质粒的大量去内毒素抽提。 （二）传 293T 细胞
将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4 度冰箱取出的 0.25% 胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于 37 度培养箱中 3-5min，取出，摇晃可发现细胞 于底部脱离，将其全部晃下，加入 3mL 37 度水浴中预热的 10％ DMEM，移液枪 用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打 可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将 所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf
当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢 弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为 37~42℃的水浴。 2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套， 防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在 1~2min 内使细胞溶液完全 溶解。 3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养 基，混匀后离心，1000rpm，5min。 4、去掉上清，加入 5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入 6cm 培养皿。 5、将培养皿平稳放入 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长 情况。
慢病毒(Lentivirus)载体构步骤和方法
一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达.二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体（自己构建）和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组,从而高水平的表达效应分子.大致的实验流程：1. 根据目的基因相关信息（序列,序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；6。
通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7。
用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性.病毒液足够用于一般的动物活体实验。
三、重组质粒构建流程1.基因的获得：shRNA寡核苷酸序列的设计和合成（将正确序列克隆入载体中,退火形成双链，PCR扩增）2。
回收A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系,然后跑电泳回收，回收量一般为30ul. B．PCR扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。
慢病毒包装操作方案
慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenPEG6000溶液50%WakoHBSS溶液Invitrogen3 耗材50 mL离心管15 mL离心管10 cm细胞培养皿μm过滤器2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。
在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。
4)在室温条件下，250 g离心4分钟。
5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。
）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。
1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。
将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册：1 慢病毒使用操作2 慢病毒安全使用规范3 悬浮细胞感染方法概要4 相关专业术语(详情可参考公司网站FAQ)5 细胞培养器皿的相关参数1、慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）A．病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C． Invabio提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
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慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
6)实验完毕用香皂清洗双手。
➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。
b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。
2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。
一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。
该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株：大肠杆菌菌株DH5α用于扩增辅助包装载体质粒；Stbl3用于扩增pHBLV TM 系列质粒，防止病毒载体重组。
三、慢病毒包装和浓缩(一)质粒扩增构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1 μg/μl，A260/280在1.7-1.8间方可用以病毒包装。
推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。
(二)做脂质体转染转染前一天，按照5⨯106/T75的密度铺下293T细胞。
24h后转染。
转染前请把DMEM 和转染试剂LipoFiter TM恢复至室温，使用前需摇匀。
转染每瓶T75的质粒成分如下：psPAX2 10 μgPMD2.G 10 μgpHBLV TM系列载体10 μg请参考LipoFiter TM转染试剂说明书进行转染操作。
转染后6 h换新鲜培养基。
注：LipoFiter TM转染试剂为汉恒生物研制的DNA转染试剂产品，使用说明请参考LipoFiter TM说明书。
(三)病毒收集和离心转染后48h和72h分别两次收集病毒上清(48h收集后置换新鲜培液)，收集后以0.45 μm滤器过滤,于40 ml超速离心管中，4℃，72000⨯g离心120 min。
(四)病毒重悬和保存500 μl 新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80℃甚至液氮保存。
四、感染目的细胞(一)细胞准备将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1×105/ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%之间。
(二)病毒感染1.Polybrene的选择：Polybrene是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10倍。
Polybrene有一定的细胞毒性，有的细胞对Polybrene的毒理反应明显，因此细胞感染时是否适合Polybrene需要摸索；不同细胞对Polybrene的敏感度不同，可以用1～10μg/ml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞无明显毒性反应为佳，可参考文献并进行预实验摸索，Polybrene最常用的工作浓度为6～8 μg/ml。
注：1）汉恒生物的自产的Polybrene 产品，用户可用以进行辅助感染。
提供的Polybrene母液保存在-20℃（可保存1年以上），避免反复冻融3次以上，否则活性受影响。
4℃可保存2周。
2）Polybrene预实验请先使用对照病毒进行摸索，部分细胞系MOI及Polybrene 的使用范围请参见附表3。
2.感染细胞最佳MOI的测定MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。
对于分裂活跃的细胞，比如Hela、293细胞，MOI=1～3时，80%以上的细胞均表达目的基因。
而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。
需要进行MOI梯度摸索实验，选择适合的MOI进行实验。
3.感染步骤按实验需要将细胞铺板（比如12孔板）。
细胞数以第2天密度约50%为宜。
37℃培养过夜。
对于Polybrene可施加的细胞：准备完全培养基和Polybrene混合物，Polybrene 终浓度为摸索得到的最适终浓度。
移去培养基并添加0.5 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于24 孔板，其他孔板请相应调整体积。
）注：对于不适用Polybrene的细胞，以上步骤省略，直接进入下面步骤。
感染前，从冰箱取出并在冰上慢慢融化病毒，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，再将病毒原液加入细胞中，轻轻混匀。
（具体加入的病毒数可参考附表1）37℃小体积感染4 h，4 h后补齐培养基至正常体积。
（感染时培养基体积表格如下）病毒小培养体积感染表培养皿类型表面积/cm2培养基体积病毒体积96-well 0.3 cm2100 µl 50 µl24-well 2 cm2500 µl250 µl12-well 4 cm2 1 ml 500 µl6-well 10 cm2 2 ml 1 ml 慢病毒感染4 h后补足至培养体积，感染24 h后换液，腺病毒感染4-8 h后直接换液感染后第二天（约24 h），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。
感染后48 h，对于带GFP报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测GFP表达效率，对于携带Puromycin抗性基因的病毒，换上含适当浓度Puromycin的新鲜完全培养液，筛选稳定转导的细胞株（详见下方）。
注意：融化的病毒置于冰上。
反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。
4.Puromycin抗性筛选Puromycin标准的施加终浓度范围为1～10 μg/ml，不同细胞puromycin的工作浓度不同，请查找相关文献（部分细胞参考用量见下图），另外请设不感染筛选对照（未经过病毒感染的野生型细胞），加入等量等浓度的Puromycin。
部分细胞Puromycin参考值：Cell line Species Puromycin (µg/ml)293系列Human 3HeLa Human 3B16 Mouse 1-3PC1.0 Hamster 10MC3T3-E1 Mouse 10H9C2 Rat 1MCF-7 Human 1-3 MDA-MB-×××Human 1-3HepG2 Human 2HT1080 Human 1A549 Human 1.5H1299 Human 2Human embroyonic stem cellsHuman 1 （Human ESCs）更多Puromycin使用浓度更新中，详情请参考公司网站.每2-3天更换一次含有Puromycin的完全培养液，直至没有感染病毒的对照组细胞被Puromycin杀光，然后可进行以下两步操作（依照具体实验需要选择）。
1)不挑取单克隆将感染并筛选后的细胞进行传代，并继续施加Puromycin进行维持性筛选培养。
连续筛选并传3代后，冻存保种细胞Mixture（这种Mixture由于各个细胞的不均一性，有时候表型可能不是太好，建议做单克隆挑取）。
2)挑取单克隆将感染并筛选后的细胞挑选至少5个克隆进行细胞扩增，并继续施加Puromycin进行维持性筛选培养。
扩增完毕后Western blot或者qPCR检测目的蛋白或基因的表达。
挑取表达量适中的稳定细胞株，连续筛选并传3代后，冻存保重稳定细胞株。
5.感染悬浮细胞感染悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速（200 g）离心1 h，然后放入培养箱中正常培养即可。
若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置15 min（尽量不要超过30 min），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜后换液即可。
6.对于极难感染的细胞对于极难感染的细胞，如DC（树突状细胞）等，可采用多次感染的方法，即感染24 h 后，更换新鲜病毒进行二次感染，可显著提升感染效率。
7.传代能力较差的原代细胞对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用滴度更高的腺病毒进行感染。
附1：汉恒生物慢病毒质粒列表（质粒图谱请登陆汉恒官网查询）载体名称用途启动子容量抗药标记荧光标记pHBLv-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-puro过表达CMV 2.5kb Puromycin RFP pHBLv-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro过表达CMV 2.5kb Puromycin ZsGreen pHBLV-CMV-MCS-EF1-Luc-T2A-Puro过表达CMV 2.0kb Puromycin Luc pHBLV-CMV-MCS-EF1-Puro 过表达CMV 3.0kb Puromycin 无pHBLV-CMV-MCS-T2A-Puro 过表达CMV 3.0kb Puromycin 无pHBLV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen过表达CMV 3.0kb 无ZsGreen pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro过表达CMV 3.0kb Puromycin RFP pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro过表达CMV 2.5kb Puromycin GFPpHBLV-Tet-on-SV40-puroTet-on过表达TRE3G1.5kb Puromycin 无pHBLV-CMV-crRNA-EF1-GFP-T2A-puro 环状RNA过表达CMV 2.5kb 无GFPpHBLV-U6-MCS-EF1-mCherry-干扰U6 shRN Puromycin mCherryT2A-puro A pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-Puro 干扰U6shRNAPuromycin ZsGreenpHBLV-U6-MCS-EF1-Luc-T2A-Puro 干扰U6shRNAPuromycin LucpHBLV-U6-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-Luc 干扰U6shRNA无ZsGreen/LucpHBLV-U6-MCS-EF1-RFP-T2A-Luc 干扰U6shRNA无RFP/LucpHBLV-U6-MCS-EF1-Luc-T2A-Bla 干扰U6shRNABlasticidin LucpHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen 干扰U6shRNA无ZsGreen pHBLV-U6-MCS-PGK-puro 干扰U6shRNAPuromycin 无pHBLV-EF1α-cas9-U6-gRNA-puro Cas9/gRNAEF1α/U6Cas9/gRNAPuromycin 无pHBLV-EF1α-cas9-CMV-puro cas9 EF1αCas9 Puromycin 无pHBLV-U6-gRNA-EF1a-puro gRNA U6 gRNA Puromycin 无附2：慢病毒滴度测定方法简介(表达荧光的慢病毒)Day 0：将生长状态良好的293T 细胞消化计数后稀释至1⨯105/ml, 加入96孔板，100 μl/孔(1⨯104个细胞)，每种病毒需要6个孔。