辛酸—硫酸铵沉淀法提取免疫球蛋白G
辛酸_硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用_陈丹
５ 结束语 脂质筏结构被人们认识以来， 其确切的生理功能仍然
ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｂｄｏｍａｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｔｏ ｔｈｅ ａｐｉｃａｌ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ， １９９２， ６８（ ３） ： ５３３－ ５４４． ［７］ ＢＲＯＷＮ Ｄ Ａ， ＬＯＮＤＯＮ Ｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ
［９］ ＤＡＮＩＥＬＳＥＮ Ｅ Ｍ．Ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｂｒｕｓｈ ｂｏｒｄｅｒｓ： ａｔｙｐｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， ２００３， １６１７（ １－ ２） ： １－ ９．
［１３］ 杨 福 愉 ．生 物 膜 结 构 研 究 的 一 些 进 展［Ｊ］．生 物 化 学 与 生 物 物 理 进
有待大量研究， 特别是对质膜微囊和脂筏介导的内吞途径
ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ ｒｉｃｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒａｆｔｓ ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２０００， ２７５（ ２３） ：
的分子细节了解， 而脂筏与微生物相互作用为这方面的研 究提供了一个非常好的实验模型。通过对病原微生物如何
１７２２１－ １７２２４． ［８］ ＳＩＬＶＩＵＳ Ｊ Ｒ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ： ｌｅｓｓｏｎｓ
ｆｒｏｍ ｌｉｐｉｄ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， ２００３， １６１０（ ２） ：
利用脂筏介导其内吞及内吞入胞后在胞内的转运的研究，
兔血清免疫球蛋白的非层析法纯化及方法比较
ｐ ．） Ｈ９５ 作系 列稀 释 ， 于酶 标板 中每 孔 加入 １０ ［ ０＃ 不 同稀 释 度 的待 测 样品 ， 夜 ， Ｐ Ｓ洗 涤 液 洗 ３ ４Ｃ过 用 Ｂ
报道“ 用 辛 酸 和硫 酸铵 两 步沉 淀 法提 法提 纯 兔 、 羊
等动物血清中的 ＩＧ， ＩＧ与 Ｄ ＡＥ离子交换纯 ｇ 其 ｇ Ｅ
１ ４ 免疫 球蛋 白 ＩＧ 的收获率 ． ｇ １ ４ １ Ｅ ＩＡ。 ． ． Ｌ Ｓ ’ 法 检 测 ＩＧ 的收 获 率 将 纯 方 ｇ 化后 的 ＩＧ 用 Ｐ Ｓ稀 释到 原血 清体 积 ， ｇ Ｂ 将血 清 及纯 化 的 ＩＧ 用 包 被 缓 冲 液 （０ ｇ １ ０ｍｍｏ 碳 酸 缓 冲 液 ， ｌ
酶 结合物 ，ＡＢ Ｓ Ｃ公 司 ）４ ＂ １ｈ 洗涤 ３次 ， 孔加 ，３ ， Ｃ 每 显 色 剂 Ａ 液 （０ ２５ｍｍｏ 枸 橼 酸 钾 ， Ｈ４ ０ ０ ３ ｌ ｐ ． ，．
Ｈｚ 及 Ｂ液 （ 甲苯试 剂 ） ｊ ｌ室 温显 色 ３ ０ｚ ］ 四 各 Ｏ ， ～
并 与 同样简 便 、 陕速 和 价廉 非 层析 硫 酸铵 沉 淀法 进
作 者 堕 位 ： ３０ Ｏ 武 议 生 物 制 品 研 究 所 （ ４ ０ ６ ｃ 砖、 王翠 任怀 之 ） 湖 ；
北 省 医学 科 学 院 病 毒 所 （爵南胜 ） 、
据， 辛酸硫 酸 铵两 步 法 的 收 获率 为 ７ ． ％ ， １９ 硫酸 铵
四步沉 淀法 的 ＩＧ 收获率 则 为 ４ ． 。 ｇ ００
维普资讯
医
兔 血 清 免 疫球 蛋 白的非 层析 法 纯 化 及 方法 比较
汪 翠玲 潘 南胜 任 怀 之
摘要 ： 辛酸和硫酸铵两步沉淀法对兔血 清免疫球蛋 白 ＩＧ进行纯 化 ． 用 ｇ 并与 硫酸铵 四步 沉淀法 进行 比 较 。结果显示 ． 种方 法都能 或 获得高纯 度 的 ｌＧ， 两 ｇ 而前 者纯 化 ｌＧ的 收获 率约 为 ６ ～ ７ ． 者则 为 ｇ ｏ ｏ 后
IgG的分离与提纯-硫酸铵沉淀法
IgG的分离与提纯-硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。
但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。
通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。
因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。
γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75％，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。
纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。
之前根据载量估计一下需要的柱子体积。
实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。
下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。
材料与试剂配制1. 动物血清2. 硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。
如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3. 0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至1 000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。
4. 1％BaCl2溶液5. 纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。
抗血清纯化
辛酸-硫酸铵沉淀法原理简介：辛酸-硫酸铵法分两步进行。
第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀血清或者腹水中的白蛋白或者其他非lg蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将lg沉淀下来。
实验流程：血清或者腹水↓辛酸沉淀（室温）↓→沉淀（白蛋白和其他非lg蛋白质）上清液（lgG）↓硫酸铵沉淀（4度）↓→上清液沉淀↓溶解沉淀↓透析（4度）实验操作：原料：待纯化的血清（-20度长期保存，实验前4度融化暂存）器材：磁力搅拌器、冷冻离心机、低温冰柜、医用纱布、50ml离心管、透析袋、透析夹。
试剂：1.乙酸-乙酸钠缓冲液：60mmol/L,pH4.02.10×磷酸盐-NaCl缓冲液（PBS）：100mmol/LPBS，pH7.4。
称NaCl 80g、Na2HPO412H2O 29g、KCl 2g、KH2PO42g,加蒸馏水溶解，加入100mmol/LEDTA20ml，用去离子水定容至1000ml。
3.硫酸铵4.辛酸实验步骤：（一）辛酸沉淀除杂蛋白1.抗血清用6倍(2-4倍)体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释（确保终PH为4.5）（PH4.5-4.8）2.室温下边搅拌边缓慢滴加辛酸（血清体积的1%）（25ul/33ul辛酸：1ml血清稀释液），滴加完后继续搅拌30min3.离心（10000r/min，30min），收集上清液，弃去沉淀4.上清液用三层纱布过滤（二）硫酸铵沉淀得免疫球蛋白5.按1/10经过滤的上清液体积加入10×PBS，用5mol/L NaOH调至PH7.46.上清液4度预冷，加等体积的过饱和硫酸铵溶液(4度按277g/L硫酸铵粉末)，边加边搅拌，加完后继续搅拌2小时以上或者4度过夜7.离心（8000r/min、20min），弃去上清液，收集沉淀8.沉淀用少量生理盐水（也可用试剂2）（原血清体积的1/10）复溶，50倍体积透析到PBS中，透析后加入0.9‰ NaN3硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。
IgG的分离与提纯
IgG的分离与提纯：硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。
但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。
通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。
因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。
γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。
纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。
之前根据载量估计一下需要的柱子体积。
实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。
下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。
一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。
如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3、0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至1000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。
4、1%BaCl2溶液5、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。
6、0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液7、洗脱液0.03Mol/L的NaCl液。
抗血清纯化
辛酸-硫酸铵沉淀法原理简介：辛酸-硫酸铵法分两步进行。
第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀血清或者腹水中的白蛋白或者其他非 lg 蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将 lg 沉淀下来。
实验流程：血清或者腹水辛酸沉淀（室温）J 一沉淀（白蛋白和其他非lg蛋白质）上清液（ lgG）硫酸铵沉淀（ 4 度）J -上清液沉淀溶解沉淀透析（ 4 度）实验操作：原料：待纯化的血清（ -20度长期保存，实验前 4 度融化暂存）器材：磁力搅拌器、冷冻离心机、低温冰柜、医用纱布、 50ml 离心管、透析袋、透析夹。
试剂： 1. 乙酸- 乙酸钠缓冲液： 60mmol/L,pH4.02.10 X磷酸盐-NaCl 缓冲液（PBS： 100mmol/LPBS pH7.4。
称 NaCI 80g、NQHP02HO29g、KCI 2g、KHPO2g,加蒸馏水溶解，加入 100mmol/LEDTA 20ml，用去离子水定容至1000ml。
3.硫酸铵4.辛酸实验步骤：（一：辛酸沉淀除杂蛋白1.抗血清用6倍（2-4倍）体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释（确保终 PH为4.5）（PH4.5-4.8 ：2.室温下边搅拌边缓慢滴加辛酸（血清体积的 1% ：（25ul/33ul 辛酸： 1ml血清稀释液：，滴加完后继续搅拌 30min3.离心（10000r/min， 30min），收集上清液，弃去沉淀4.上清液用三层纱布过滤（二：硫酸铵沉淀得免疫球蛋白5.按1/10经过滤的上清液体积加入10X PBS用5mol/L NaOH调至PH7.46.上清液 4度预冷，加等体积的过饱和硫酸铵溶液（4 度按 277g/L 硫酸铵粉末），边加边搅拌，加完后继续搅拌 2 小时以上或者 4 度过夜7.离心（8000r/min、20min）,弃去上清液，收集沉淀8.沉淀用少量生理盐水（也可用试剂 2）（原血清体积的 1/10 ）复溶，50倍体积透析到PBS中，透析后加入0.9 %。
免疫球蛋白G(IgG)三种提取方法比较
ＩＧ 纯度较 高 、 率也 高 ， 时 间较 长 ； 酸一 酸铵 分 步沉 淀法所 得 Ｉ 纯度很 高 ， 所 用时 间较 长 ， ｇ 得 但 辛 硫 ｇ Ｇ 但 得 率也较低 。３种提 取方 法各有特 点 ， 可根 据不 同的 实验 条件 和 目的选择 不 同的提 取方 法。
关键 词 ： 猪血 清 ； 免疫球 蛋 白 ； 取 方法 ； 提 比较
・３ ・ ８
免疫球蛋 白 Ｇ（ Ｇ ＝种提取方法比较 Ｉ ） ｇ
刘生 杰 也， 朱茂 英 ， 顾士彬 。唐 梅 。周 扬 。余为一 ’ ， ， ，
（安徽农业大学生命科学学院， ｔ 安徽合肥 ２ １ ７ ；阜阳师范学院生命科学学 院， ３ ０ ２ 安徽阜阳 ２ ６４ ） ３ ０ １
摘 要： 比较 ３种提 取猪 血清 中免疫球 蛋 白 ＩＧ 方法的提取效 果 。分 别 用辛酸 沉淀 法 ， 酸铵分 步沉淀 ｇ 硫 法． 辛酸一 酸 铵 沉淀 法粗提 猪 血 清 免疫球 蛋 白 ＩＧ， 硫 ｇ 并通 过 Ｓ － ＡＧ ＤＳ Ｐ Ｅ凝胶 电泳 、 ｌ ａ ａ Ｆ Ａｐ Ｅ ｓ Ｃ凝胶 ｈ ｅ 成像分析 软件 、 ｒｄｏｄ 白浓度测 定法等 比较 ３种方 法的提 取 纯度和得 率 ， Ｂ ａｆｒ 蛋 同时比较 ３种 方 法的时效 性和 经济性 。辛酸沉 淀法提取 ＩＧ 所 用时间最短 ， ｇ 只需 １ ， ｈ 得率较 高但 纯度不 高 ； 酸铵 盐析 法提 取的 硫
中图分类号 ： １ ８ Ｑ８ ； ５ ￥ 文 献标识 码 ： Ａ
Ｃｏ ｐ ｒｓ ｎ ｏ ｒ ｅＭ ｅｈ ｄ ｆＰｕ ｉ ｉ ｇＩ Ｇ ｒ ｍ ｗｉ ｅＳ ｒ ｍ ｍ ａ ｉｏ ｆＴｈ ｅ ｔ ｏ ｓｏ ｒｆ ｎ ｇ ｆｏ Ｓ ｎ ｅ ｕ ｙ
ＨｕＳ ｅ ｇ ｅ ， ｈ ｏｉｇ， ｕＳ ｉｉ Ｔ ｎ ｉ Ｚ ｏ ａ ｇ， ｕＷｅ ｉ ｈｎ ｊ Ｚ ｕＭａｙ ２ Ｇ ｈｂｎ， ａ ｇＭｅ ， ｈ ｕＹ ｎ ２Ｙ ｉ ｉ ｎ ｙ
免疫球蛋白G_IgG_三种提取方法比较_刘生杰
１．８ 经济性比较 分别计算 ３ 种方法所用药品价钱的总和，除以所
用血清的量，来比较其经济性效益，所得结果越小，其 经济效益越好。
·４０·
管号 ＢＳＡ／μｌ ＰＢＳ／μｌ 考马斯亮蓝溶液 ／ｍｌ 总量 ／ｍｌ ＢＳＡ 浓度 ／（ｍｇ．ｍｌ－１） ＢＳＡ 吸光度值
总量 ／ｍｌ
血清 １：６４
５０
１００
２．８５
３．００
辛酸沉淀上清 １：５
５０
１００
２．８５
３．００
硫酸氨沉淀 ＰＢＳ 稀释液 １：２０
５０
１００
２．８５
３．００
辛酸 － 硫酸氨沉淀 ＰＢＳ 稀释液 １：１０
５０
１００２．８５３．００１．７ 粗提时效性比较 分别统计 ３ 种方法每一步骤所需时间，最后计算
１３０
１２０
１１０
１００
９０
２．８５
２．８５
２．８５
２．８５
２．８５
２．８５
２．８５
３．００
３．００
３．００
３．００
３．００
３．００
３．００
０
０．００３３３４
０．００６６６７
０．０１
０．０１３３３４
畜牧兽医科学
中国农学通报 第 ２３ 卷 第 １１ 期 ２００７ 年 １１ 月 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．ｃｎ
· ３９ ·
值巨大。但有效利用 ＩｇＧ 的关键是缺乏快速高效的提 取技术，由于血清蛋白种类多，目前还没有技术能实现一 步 提 取 纯 化 ，须 多 种 方 法 结 合 方 能 奏 效 ［１］，但 粗 提 的 效果却制约着纯化的得率和纯度。从血液中提取免疫 球蛋白，常用的方法有盐析法（如多聚磷酸钠絮凝法， 硫酸氨盐析法）、有机溶剂沉淀法（如冷乙醇分离法、 辛酸沉淀法）、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法、纤维 素层析法、凝胶层析法、超滤法等，许多学者对提取免 疫球蛋白作过一些深入的研究［２］，但对抗体纯化的综 合方法比较的较多，而限制纯化纯度和得率的瓶颈阶 段— ——粗提阶段则比较研究较少，尤其是以大量提取 免疫球蛋白为目的的比较研究较少，笔者比较了辛酸 沉淀法、硫酸铵分步盐析法和辛酸 － 硫酸铵盐析法 ３ 种常用提取 ＩｇＧ 方法的效果，以期为猪血清免疫球蛋 白的快速、经济、大量提取和综合利用提供参考。 １ 材料与方法 １．１ 材料
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
辛酸—硫酸铵沉淀法提取免疫球蛋白G
一、实验目的：
1、了解蛋白质纯化的基本技术；
2、学习辛酸—硫酸铵法纯化抗体的方法。
二、实验原理：
根据免疫球蛋白的性质利用生物化学各种纯化方法进行抗体的纯化，主要有常规生物化学和特异性亲和层析两类方法。
本实验采用辛酸—硫酸铵沉淀法从动物血清中纯化抗体，纯度和回收率较高，且抗体活性不被破坏；同时此方法操作简便、周期短、成本低、不需要复杂的仪器设备，不仅使用于小量抗体的纯化，也适合大批量抗体的制备。
三、实验材料试剂和器材：
1、实验材料：兔血清。
2、试剂：乙酸-乙酸钠缓冲液、10×磷酸盐-NaCl缓冲液、透析液、5 mol/LNaOH、0.1mol/L NaOH。
3、器材：电磁搅拌器、离心机、透析袋。
四、操作方法：
1、动物血清用4倍体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，0.1mol/L NaOH调整血清稀释液pH至4.5。
2、室温下用电磁搅拌器边搅拌边缓慢滴加辛酸（加入量为1L血清稀释液加25ml），滴加完
后继续搅拌30min。
3、离心（10000转/分，20分钟）,收集上清液，弃去沉淀，上清液用滤纸过滤除去悬浮物，
量体积。
4、按照10%体积加入10×磷酸盐-NaCl缓冲液，用5 mol/LNaOH调pH至7.4。
5、上清液4℃预冷10min，测量溶液总体积，在4℃按277g/L缓慢加入硫酸铵粉末（终浓
度达到45%饱和度），边加边搅拌，加完后继续搅拌30min。
6、离心（5000转/分，15分钟）,弃去上清液，收集沉淀。
7、沉淀用少量透析液溶解（一般为原血清体积的1/10），透析并更换两次透析液。
8、透析后的抗体溶液在50～55℃水浴中加热20min，离心（5000转/分，20分钟）,上清液于-20℃保存。