第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产
第五章 动植物细胞培养
◆ 动物克隆技术的建立
1962年，英国学者Grudon 把非洲爪蟾小肠上皮细胞的 核注入同种或异种非洲爪蟾 未受精卵中，约有1%的重组 卵发育成为成熟蛙。 1997年，哺乳动物克隆 羊多利的诞生。 动物器官克隆为生物医 药材料开辟新。
（三） 动物细胞培养的特性 ◆动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能差； ◆生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生
第二节 动植物细胞的培养
5.2.1 动物细胞的培养 （一） 培养方法
非贴壁依赖性细胞的培养：来源于血液、淋巴组 织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些 转化细胞属于这一类型，其可采用类似微生物培养的 方法进行悬浮培养。 贴壁依赖性细胞的培养：大多数动物细胞，包括 非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞属于这一 类型，它们需要附着于适量正电荷的固体或半固体的 表面上生长。
表51动植物微生物细胞的培养特征种类比较项目微生物动物细胞植物细胞大悬浮生长小营养要求生长速率代谢调节环境敏感细胞分化剪切应力敏感传统变异筛选技术细胞或产物浓度110m可以简单快倍增时055小时内部不敏感无低广泛使用较高10100m多数细胞需附着表面才能生长非常复杂慢倍增时间15100小时内部激素非常敏感有非常高不常使用低10100m可以但易结团无单个细胞较复杂慢倍增时间2474小时内部激素能忍受广泛范围有高有时使用低5
（二） ◇
培养方式
分批培养
分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养细胞不断 生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。分批 培养 过程特征如图5-1。
pH、温度、DO 废产物 条件
营养物 时间 图5-1 动物细胞分批式培养过程的特征
◇ 分批补料式培养
分批补料式培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件 下接种细胞，进行培养，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向 系统中补充新的营养成分，直到整个培养结束后取出产物。分批补料式培养 过程的特征如图5-2所示。
次生代谢产物 PPT
大家好
1
植物次生代谢产物的概述 研究现状 植物细胞大规模培养生产次生代谢
产物的基本程序 提高次生代谢物生产效率的途径与
方法 应用实例 前景展望
大家好
2
植物次生代谢产物是指植物中一大类并 非植物生长发育所必需的小分子有机化 合物，其产生和分布通常有种属、器官 组织和生长发育期的特异性。
大家好
22
pH：培养基的pH值与细胞生长繁殖以及次生 代谢产物的生产关系密切，与培养温度相似， 细胞的生长繁殖与次生代谢产物合成时所需 的pH值通常并不一致，需要在不同的阶段控 制不同的pH值。
电场：膜周电泳学说认为对细胞施加稳定的 电场能够导致膜中带电物质的重新分配，最 终导致原生质体生长和分化效应。
大家好
21
合适的培养条件
物理因素：
温度：植物细胞培养的最适温度一般为 25℃，但不同的植物种类略有差异，而 且植物细胞生长和次生代谢产物的合成 所需的温度并不一致，因此选择合理的 培养温度并进行相应的调控对于细胞生 长以及产物合成十分关键。
光照：光强、光质和光照时间对细胞的 生长和次生代谢产物的合成都具有一定 的影响。不同的光照情况要根据不同的 植物细胞来设定。
大家好
16
因此充分利用基因工程的手段，筛选高 产细胞系，深入研究特定代谢产物的生 物合成途径，对培养条件进行优化，研 究和开发适合植物细胞培养的生物反应 器是解决这些问题的根本途径。
大家好
17
提高次生代谢产物生产效 率的途径和方法：
选择合适的外植体 筛选得到高产细胞系（株） 寻求合适的培养条件和培养技术
大家好
10
植物次生代谢产品的市场潜能
大家好
植物次生代谢产物生产.ppt
诱导子能增强细胞的呼吸作用, 提供产生次生代谢产物的 能量, 使细胞结构发生变化, 利于代谢物的形成、运输和积累。 目前应用最广、研究最多的是真菌诱导子, 如张长平等在红 豆杉细胞悬浮培养体系中加入真菌诱导子, 结果发现, 紫杉醇 的合成被加强, 产量得到了显著提高。 除真菌诱导子外, 目前在提高植物次生代谢产物方面研究得 较多的还包括寡糖素、茉莉酸类、金属离子和紫外光等.金属 离子作为诱导子主要有Cu2+ 、Ca2+ 、Mg2+等。 孙彬贤等以南方红豆杉悬浮细胞为材料, 在悬浮细胞中加入 茉莉酸甲酯, 紫杉醇含量提高了10倍。
产次生代谢产物时, 对光质和光量的要求是不同的, 如玫 瑰茄悬浮细胞合成花青素时, 蓝光是促进玫瑰茄细胞产生 花青素的最有效单色光, 产量为416 mg/ L, 和全色光差 不多, 红光和橙光无效, 其他单色光随其波长接近蓝光, 正 效应增强。
pH值：植物细胞培养的最适宜pH 值在5-6 之间,但也存在
4.3 前体饲喂
前体指处于目标代谢物代谢途径中上游的物质。上游化合 物作为酶的底物，其浓度高低决定了催化反应速度的大小 ，浓度高则反应速度大。加入前体可以消除关键酶的阻碍 或阻断内源性中间体的分隔和有效贮存，利于次生代谢物 的生产。
• 向银杏培养基中添加异戊二烯等前体物质, 有效地提高了 银杏内酯B 的产量.
• 解决植物细胞培养生产次生代谢物含量低的最有效的手段之一是 筛选高产细胞株。用来筛选的细胞来源可以是有足够生理和形态 异质性的细胞群，也可以是通过物理或化学因子诱变处理产生的 突变体群。
• 筛选方法:目测法,放射免疫法、酶联免疫法、流动细胞测定法、 琼脂小块法等。
3. 物理因素
光照：对次生代谢产物的合成有重要影响. 不同植物细胞生
植物细胞培养与次级代谢产物制备
＊ 直线期：细胞分裂旺盛， 数目快速增加；
＊ 减缓期：细胞因营养消耗、 老化，分裂速度减慢；
＊ 平台期：死亡与生成细胞 数目平衡，净增长为零；
1延迟期
＊ 衰亡期：细胞死亡速度加 快，细胞自溶、死亡。
5 平台期
4 减缓期
6 衰亡期
3直线期
2对数生长期
细胞工程
植物细胞培养与次级代谢产物制备
2.4.1 植物细胞悬浮培养的生物反应器
（3）液体浅层静置培养
将一定密度的悬浮细程
Chapter 5
植物细胞培养与次级代谢产物制备
（4）细胞同步化培养
①体积选择法：用大、小孔径筛网过滤、收集单 细胞。 ②冷处理法：4℃低温下处理几天使细胞同步化 后，再添加新的培养液培养。 ③饥饿法：控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达 到同步化，再添加营养液培养。 ④抑制法：使用抑制剂如尿苷、5-氟脱氧尿苷、 秋水仙素等使细胞达到同步化。
加入培养基
特点：
（1）新鲜培养基不断加入， 保证了养分的充分供应； （2）可使细胞保持在增殖 旺盛的对数生长期中； （3）适于大规模工业化生产
排出培养基及其培养物
细胞工程
Chapter 5
植物细胞培养与次级代谢产物制备
2.5 植物细胞固定化培养
细胞固定化培养（Cell immobilization culture） 是指将游离的细胞包埋在支持物内部或表面、培 养液呈流动状态进行培养的一门技术。
植物细胞培养与次级代谢产物制备
2.4.2 植物细胞培养方式
（1）分批培养（Batch culture） 特点：一次性添加和收获培养液体，期间不更换。 缺点：培养后期营养不足，产率降低；
（2）流加式培养： 特点：间歇或连续补加一种或多种营养（细胞初始
植物次生代谢产物生产
优势:
投资小, 成本低; 使用安全, 植物细胞的培养条件简单, 易于成活; 便于进行遗传操作; 经转化后的目的细胞系易于储藏, 方便生产。
主要方法:
土壤农杆菌介导转化法; 重组病毒感染植株; 基因枪转化法; 花粉管通道转化法。
反义技术
• 反义技术：利用现代分子生物学技术, 将人工合成的反义
RNA 导入到植物基因组内, 与要抑制的代谢途径的关键酶基 因RNA 结合形成双链RNA 来阻断基因的正常表达, 进而促 进目的基因的表达。
次生代谢产物(secondary metabolites)是指植物体内的一大
类细胞生命活动或植物生长发育正常运行非必需的小分子 有机化合物，其产生和分布通常具有种属、器官、组织和 生长发育期的特异性，次生产物在植物中的合成与分解过 程称为次生代谢(secondary metabolism) 。
细胞培养核心理论依据：
提高植物细胞培养中次生代谢 产物产量的方法
前言
初生代谢(primary metabolism)是指能使营养物质转换成细
胞结构物质、维持细胞正常的生命活动或能量的代谢，初 生代谢的产物称为初生代谢产物(primary metabolites)， 如糖、蛋白质、脂类、核酸等。它们是维持细胞生命活动 所必需的。
发根培养
发根(hairy root)：是整体植物或其某一器官、组织(包括
愈伤组织)、单个细胞甚至原生质体受发根农杆菌感染所产 生的一种病理现象，它起源于单个细胞，形成多分支、生 长迅速的不定根。
优势：具有生长迅速且无需添加外源激素、拥有亲本植株的
特征次生代谢途径和遗传稳定性、处于分化状态等特点， 尤其是它的生长迅速和稳定性的特点是工业化生产梦寐以 求的，也是细胞培养和一般器官培养所不能兼备的。
植物细胞培养
植物细胞培养方法分类 1、根据培养对象：单细胞培养、单倍体培养、 原生质体培养 2、根据培养系统：悬浮培养、液体培养、固 体培养、固定化培养
单细胞小规模培养
• 液体浅层静置培养：将一定密度悬浮细胞接 液体浅层静置培养： 种于培养皿或三角瓶中封口静置培养。 • 细胞同步化培养：（获得生长周期一致的） 细胞同步化培养： • 1）体积选择法：筛网过滤 • 2）冷处理法：4度处理数天 • 3）饥饿法：控制培养液营养 • 4）抑制法：尿苷，5-氟脱氧尿苷，秋水仙素
后产生荧光
2. 呼吸强度测定：氧电极法测呼吸作用 呼吸强度测定： 3. 细胞生长和分解速率的测定：细胞重量 细胞生长和分解速率的测定：
（五）植物细胞培养生产次级代谢产物
植物细胞培养生产药用代谢产物例子
植物细胞与组织培养比较
• 细胞悬浮培养： 细胞悬浮培养：
植物细胞的保存 1、继代培养保存法：1-2周换液传代 2、低温保存法：5-10度培养换液 3、冰冻保存法：冷定化细胞的活力测定 固定化细胞的活力测定
1. 染色法：二乙酸荧光素可被活细胞吸收，酶解 染色法：
植物细胞培养与次生代谢产物再工业生产方面的前景
植物细胞培养与次生代谢产物在工业生产方面的前景【摘要】许多植物次生代谢产物是常用的药物制品、优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。
本文主要讲述了植物细胞培养产生的次生代谢产物在工业各方面的重要作用、开发以及大规模生产应用。
【关键词】植物组织细胞培养次生产物工业生产【正文】植物细胞培养始于本世纪初，并不可争议地具有工业化潜力。
目前植物细胞培养生产的化合物很多，包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物，而植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。
李时珍（1593）在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。
其药物的有效成分均为次生产物。
这些次生代谢活性物质成分已被人类广泛应用，主要集中在研究制药、食品添加剂、调味剂、食用色素、油料、饮料、树胶、化妆品、生物杀虫剂和农用化学品等方面。
尽管有些植物次生代谢物质并不是很多，但它们与人类健康密切相关，已成为当前生物领域研究关注的重点。
因此许多植物代谢产物以组织细胞培养技术的方法开发利用，进行大规模生产，使植物次生代谢物质产量和活性提高。
一、在制药工业方面的应用药用植物次生代谢物种类繁多，化学结构迥异。
这些次生代谢产物可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、类萜、甾体及其甙、生物碱七大类。
还有人根据次生产物的生源途径分为酚类化合物、类萜类化合物、含氮化合物(如生物碱)等三大类，据报道每一大类的已知化合物都有数千种甚至数万种以上。
在次生代谢产物的生产中, 药用植物细胞培养技术是通过给予体外生长的植物细胞一定的营养条件, 使其生长, 并根据植物或植物不同组织的细胞调节生长条件来获取所需的次生代谢产物的生物技术。
由于植物体内的任何一个细胞都包含有整体植物全部的遗传信息, 在一定条件下具有发育成一个完整植株的能力, 所以通过细胞培养技术可得到药用植物的次生代谢产物。
药用植物细胞培养的最初目的是为了研究植物的生理和生化代谢。
第5 章植物细胞培养与次生产物生产
第5章植物细胞培养与次生产物生产（5学时）教学目的与要求：深入了解植物细胞在离体条件下的生长特性，掌握植物细胞悬浮系的建立以及种细胞的筛选方法。
第一节、悬浮培养(suspension culture)一、悬浮培养悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
1．起始培养物的建立●选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。
●选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度；必要的附加物质。
●愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强2．悬浮系的建立3．悬浮细胞的生长与增殖悬浮培养与固体培养比较有三个优点：一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换。
影响悬浮细胞生长的因素：●起始愈伤组织的质量●接种细胞密度●培养条件：方式、温度、●继代周期一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：●悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
●均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。
悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
●细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。
第三节、植物细胞大规模培养与次生代谢产物生产一、概述植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化和物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。
次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。
1．植物产生代谢产物的类型植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种），根据分子结构不同大致分为：酚类化合物－黄酮类单酚类醌 类（苯醌、萘醌、蒽醌）萜类化合物－三萜皂甙甾体皂甙单萜、倍半萜、二萜含氮化合物－生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱）胺类（伯、仲、叔、季胺）非蛋白质氨基酸生氰甙多炔类、有机酸等2．植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
产物产量：每升培养基生产的产物量（mg)。
悬浮培养细胞的同步化
1、分选法 梯度离心；Ficoll；流式细胞仪 2、饥饿法 3、抑制剂法 FdU，HU 4、低温处理 低温处理抑制细胞分裂，再把温度提高到正常的
培养温度，也可达到部分同步化。
第二节 单细胞培养
1、平板培养（plating culture)：将一定密度 悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进 行培养的技术。
2、看护培养（nurse culture) 3、微室培养（micro-chamber culture) 4、其它：饲养层培养技术、双层滤纸植板
培养技术
第三节 植物细胞的规模培养
20%左右的药物由植物衍生 已有30多种化合物在培养物中积累接近或超
前体及诱导子的作用
• 前体作用：细胞培养物中加入前体，可 减弱限速酶作用，促进次生代谢物生产。
• 诱导子（elicitor):一类能引起植物细胞代 谢强度改变或代谢途径改变的物质，主 要指生物来源的化合物，如寡糖、多糖 等。
常用诱导子：真菌诱导子、茉莉酸及其甲 酯、水杨酸等。
培养物最佳转移时间和采收时间
20世纪50年代—— 德、美、英、加拿大 由烟草、蔬菜细胞培养开始，80年代后集 中于药用植物的组培、药用成分的研究。
日本：80年代末，Nitto Denko公司在20kl生物反 应器中实现紫草和人参的大规模细胞培养，以 获得紫草素和人参皂苷，首先作为天然食品添 加剂进入市场。
国内研究成果
国内研究集中于药用植物 20世纪60年代，罗士韦首先开展人参的组培。 1980年起，植物所叶和春主持国家攻关植物
悬浮细胞系的建立
成功的悬浮细胞系： 1、悬浮培养物分散性良好，细胞团较小。 2、均一性好：细胞形状和细胞团大小大致
相同。 3、生长迅速
几个重要的生长、生产衡量指标
绝别对为生培长养速物率的：最Ra终=(和w起2-w始1)干/(t·重v)(,gw)2，、t为w1培分 养时间(d), v为培养基体积(L)。
• 愈伤在生长高峰时转到生产培养基上 • 产物含量最高时采收
2、种子细胞系的增殖与放大培养 3、大规模培养体系的建立
成批培养（batch culture)、饲喂批；半 连续培养
利用生物反应器进行细胞大量培养
1、搅拌式：可直接借用微生物培养的经验。但剪 切力高。
2、气动式：反应器内传热、传质良好。 但驱除了CO2 C2H4等有利气体，能量利用率低。 3、固定化细胞反应器： 优点：⑴固定化细胞易回收
第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产
第一节 悬浮培养
愈伤组织的诱导和悬浮细胞系的建立
Cell suspension culture: 将单个游离细胞或小细胞 团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
愈伤组织诱导和培养条件优化 1、愈伤诱导（紫草为例）
先获得无菌苗 外植体诱导愈伤 注意：2，4－D的合理使用 2、培养条件优化 在系列单因子比较试验基础上，获得最合适 的培养条件组合。
第二步，细胞生长通过指数生长期后，转移到生产 培养基上进行第二步培养，以获得最高次生产物 产量。
紫草两步培养的经验
促进愈伤快速生长的因素：
较高浓度生长素、分裂素
较高浓度NH4+ 25℃ 黑暗 促进紫草宁快速合成的因素：
降低生长素、分裂素浓度或不加激素
较低浓度NH4+ 较高浓度Cu2+ 25℃ 黑暗
植物细胞培养生产次生代谢物的意义
Plant cell culture: 在离体条件下对植物单个 细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的 技术。
• 植物资源短缺：滥采滥挖 • 资源植物栽培的缺陷：占用耕地、受地
域气候限制 • 植物细胞培养的优势：可摆脱对植物资
源的依赖，保护物种多样性和生态环境。
植物细胞培养生产次生代谢物的研究历史
1、根据细胞表型进行筛选 2、根据单细胞克隆次生代谢产物产量筛选。
两步培养法
1、药用植物组培中为何经常采用两步法？
许多植物组培研究表明，促进细胞生长的条 件和促进次生代谢物生产的条件并不相同，一些 促进细胞生长的因子往往抑制次生代谢物的合成 和积累。因此宜用两步法。
2、何为二步法？ 第一步，愈伤培养在生长培养基上使细胞快速增殖。
过原植物含量 日本三井石油化学公司 产业化生产紫草宁
植物细胞规模化培养需满足的条件
1、培养的细胞遗传上稳定，得到产量恒定 的产物；
2、细胞生长及生物合成的速度快，短时间 内得到较高产量的终产物；
3、代谢产物要在细胞内积累而不被迅速分 解，最好释放到培养基中。
植物细胞规模化培养体系的建立
1、种子细胞的选择 单细胞克隆结合诱变和压力筛选
细胞大量培养方面的专题：紫草、新疆紫草、 人参、三七、红豆杉、青蒿。与化工冶金 （现过程工程）研究所合作进行小试和中试。 建立了新疆紫草高产细胞系。
药用植物细胞大量培养的三个步骤
1、诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬 浮细胞系
2、筛选高产细胞系 3、生物反应器中大量培养细胞或细胞团。
高产细胞系的筛选
⑵固定化细胞有一定程度分化，利于次生代谢 ⑶环境条件易控制，细胞稳定 ⑷适于进行生物转化 缺陷：代谢产物必须是分泌到胞外的
第四节 培养细胞的次生代谢及产物积累
• 初生代谢产物：淀粉、糖类、脂肪、蛋白质、氨基酸、 维生素等
• 次生代谢产物：由初生代谢产物经过一些独特的代谢 途径派生出来的小分子化合物，种类繁多，结构各异， 包括酚类、黄酮类、香豆素、木质素、生物碱、有机 酸、糖苷、萜类等。不是植物有机体最主要的成分， 但在保持植物抗逆性、抗病性和抗虫性及担当信号分 子方面起重要作用。 植物次生代谢产物一直是药物和工业原料的重要来 源。