酶活测定方法

二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定一、目的要求了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。

二、基本原理多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。

在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。

多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。

因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。

三、材料、仪器及试剂（一）材料梨、苹果、马铃薯等。

（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000 mL）。

（三）试剂1．100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液母液A（200 mmol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL。

母液B（200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。

取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1 000 mL。

2．提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1 mL Triton X-100，用100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mL。

3．50 mmol/L邻苯二酚称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mL。

四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

（二）活性测定取一支试管，加入4.0 mL 50 mmol/L、pH 5.5的醋酸缓冲液和1.0 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100 µL酶提取液，同时立即开始计时。

将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。

以蒸馏水为参比，在反应15 s 时开始记录反应体系在波长420 nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1 min 记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。

重复三次。

五、实验结果与计算1．将测定的数据填入下表2．计算结果记录反应体系在420 nm 处的吸光度值，制作OD 420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD 420。

然后以每克鲜重（FW ）果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个PPO 活性单位（U ），则U = △OD 420·min -1·g -1 FW 。

计算公式： WV t V OD U S 420⨯⨯∆⨯∆=）多酚氧化酶活性（式中：△OD 420——反应混合液的吸光度变化值；△t ——酶促反应时间，min ；V ——样品提取液总体积，mL ；Vs ——测定时所取样品提取液体积，mL ；W ——样品重量，g 。

PPO 活性还可以每分钟反应体系在波长420 nm 处吸光度值变化增加1时所需的酶量为1个活性单位（U ），表示为U = △OD 420·min -1·mg -1蛋白质。

酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。

六、注意事项应进行预实验，测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化（初级反应）的时间段。

这样，只测定某一段时间内反应溶液的初始吸光度值（OD 0）和最终值（OD t ）这两个数据，就可以计算每分钟吸光度值变化的增加量。

七、思考题随着反应时间的延长，多酚氧化酶活性将呈现什么样的变化？（四）超氧化物岐化酶活性测定一、目的要求学习果蔬组织中过超氧化物歧化酶活性的测定原理和方法。

二、基本原理超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase ，SOD ）普遍存在于动、植物与微生物体内。

SOD 是含金属辅基的酶。

高等植物有两种类型的SOD ：Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。

SOD 能够清除超氧自由基（O 2-），它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对有机体的毒害。

超氧阴离子自由基（O2-）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。

SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2和O2。

H2O2再由CAT 进一步催化生成H2O 和O2。

超氧化物岐化酶催化以下反应：222222O +O H −→−H +O +-由于超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般利用间接方法测定SOD 活性。

本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。

在有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下被还原。

被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2-。

当加入NBT 后，在光照条件下O 2-又可将NBT 还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm 处有最大光吸收。

当加入SOD 时，SOD 可通过清除O 2-而抑制了NBT 的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。

于是，进行光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性愈高。

抑制NBT 光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。

常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U ）。

三、材料、仪器及试剂（一）材料苹果、梨、番茄等。

（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、光照箱（反应试管处日光灯照度为4 000 LUX ）、指形玻璃管、容量瓶（100 mL 、200 mL 、1 000 mL ）。

（三）试剂1．提取缓冲液：（1）100 mmol/L 、pH 7.8磷酸缓冲液母液A （200 mmol/L Na 2HPO 4溶液）：称取35.61 g Na 2HPO 4·2H 2O 或53.65 g Na 2HPO 4·7H 2O 或71.64 g Na 2HPO 4·12H 2O ，用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL 。

母液B （200 mmol/L NaH 2PO 4溶液）：称取27.6 g NaH 2PO 4·H 2O 或31.2 g NaH 2PO 4·2H 2O 用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL 。

取91.5 mL 母液A 和8.5 mL 母液B 混合后，调节pH 至7.8，然后稀释至200 mL ，即为100 mmol/L 、pH 7.8磷酸缓冲液。

（2）提取缓冲液称取77 mg DTT ，5 g PVP ，加入100 mmol/L 、pH 7.8磷酸缓冲液，定容至100 mL ，摇溶，即得提取缓冲液（含5 mmol/L DTT 和5% PVP ），低温（4℃）贮藏备用。

2．50 mmol/L 、pH 7.8磷酸缓冲液3．130 mmol/L 甲硫氨酸（MET ）溶液称取1.94 g L-蛋氨酸，用50 mmol/L 、pH 7.8磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL ，充分混匀（现用现配）。

低温保存，可使用1~2天。

4．750 µmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液称取61.3 mg NBT ，用蒸馏水溶解，定容至100 mL ，充分混匀（现配现用）。

低温避光保存，可用2~3 天。

5．100 µmol/L EDTA-Na 2溶液称取37.2 mg EDTA-Na 2，用蒸馏水溶解，定容至100 mL ，使用时稀释100倍。

低温避光保存可用8~10天。

6．20 µmol/L 核黄素溶液称取75.3 mg 核黄素，用蒸馏水溶解，定容至100 mL ，使用时稀释100倍。

低温避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，随用随配。

四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0 g 果蔬样品，置于研钵中，加入5.0 mL 提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆。

将匀浆液全部转入到离心管中，于4℃、12 000×g 离心30 min ，收集上清液，低温保存备用。

（二）活性测定用5支指形玻璃管进行测定。

按照表19所列内容加入各种溶液。

注意最后加入核黄素溶液。

其中3支为测定管，2支为对照管。

混匀后将1支对照管置于暗处，其它各管置于4 000 LUX 日光灯下反应15 min 后，立即取出，置于暗处终止反应。

以不照光管做空白参比，于560 nm 处分别测定其它各管的吸光度值。

表19．测定SOD 活性各试剂加入量试 剂（酶） 用量（m L ） 终浓度（比色时） 50 mmol/L 磷酸缓冲液1.7 130 mmol/L MET 溶液0.3 13 mmol/L 750 µmol/L NBT 溶液0.3 75 µmol/L 100 µmol/L EDTA-Na 2溶液0.3 10 µmol/L 20 µmol/L 核黄素溶液0.3 2.0 µmol/L 酶液0.1 对照2支管以缓冲液代替 总体积3.0 五、实验结果与计算2．计算结果显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度值（OD S ）和照光对照管反应混合液的吸光度值（OD C ）。

以每分钟每克鲜重（FW ）果蔬组织的反应体系对氮蓝四唑（NBT ）光化还原的抑制为50%时为一个SOD 活性单位（U ）表示。

Wt V OD 5.0V )OD -OD (U SOD S C S C ⨯⨯⨯⨯⨯=）活性（ 式中：OD C ——照光对照管反应混合液的吸光度值；OD S ——样品管反应混合液的吸光度值；V ——样品提取液总体积，mL ；Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；t ——光照反应时间，min；W ——样品重量，g。

也可以用以每分钟反应体系对氮蓝四唑（NBT）光化还原的抑制为50%时所需的酶量为一个SOD活性单位（U）。

六、注意事项1．需要通过预实验，摸索显色反应所需的时间。

2．当测定样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶液和核黄素除外）按比例混合后一次加入2.6 mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变，其余各步骤与上相同。

4．要求各管受光情况一致，所有反应管应排列在与日光灯管平行的直线上。

反应温度控制在25℃左右，视酶活性高低适当调整反应时间。

温度较高时，光照时间应缩短；温度较低时，光照时间相应延长。