绿色荧光蛋白gfp标记方法 ppt课件
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绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物学研究中 的应用课件
3 GFP的稳定性
❖ GFP荧光极其稳定,在荧光显微镜强光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素 (fluorescein)强[19]。特别在450~490 nm蓝光波长下更稳定,但在340~390 nm或395~440 nm范围内,仍会发生光漂白现象。GFP在不同物种中稳定性不同,在果蝇和斑纹鱼(Zebra fish)中极稳定;在大肠杆菌中会有光漂白;在线虫中10 mM的NaN3将加速光漂白。GFP需要 在氧化状态下产生荧光,强还原剂如5 mM Na2S2O4或2 mM FeSO4能使GFP转变为非荧 光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂,如2% 巯基乙醇、10 mM DDT、10 mM还原谷胱甘肽、10 mM半胱氨酸等并不影响GFP荧光。 中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等,但GFP对 某些封片指甲油特别敏感,苯氧丙烷对GFP荧光也有影响。强氧化剂如1% H2O2,或硫氢基 试剂如1 mM DTNB会造成GFP不可逆性破坏[20]。大多数中等浓度的有机试剂不减弱GFP 荧光,但其最大吸收峰值会改变[21]。在高蛋白、高盐条件下,GFP通过疏水反应形成二聚体, 使470 nm吸收峰值下降近4倍。GFP很容易从细胞中分离并结晶[22]。在离体状态下,GFP 蛋白对热(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通蛋白酶(链霉蛋白酶Pronase 除外)有较强抗性[23]。GFP荧光在pH值为7~12时稳定,在pH值为5.5~7.0时开始受影响[24]。 在纳克级水平,SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶中仍能观察到GFP荧光。在高温、极端pH、或胍 基氯化物条件下,GFP会变性,荧光消失。一旦复性,荧光会部分恢复[25],但可能需要某些硫 醇类化合物的作用[26]。GFP在各种生物活体条件下表现稳定。例如氯霉素乙酰转移酶 (CAT)在生物体内很稳定,用35S-甲硫氨酸分别标记CAT和GFP,并转染玉米叶肉原生质体,用 放线菌酮处理原生质体,通过CAT检测,发现5~10μg/ml放线菌酮可完全抑制CAT在玉米原生 质体中的蛋白合成,但通过GFP观察,转染24小时后,仍未发现GFP荧光有明显减弱,仅有部分 GFP被放线菌酮降解。说明GFP在植物活体细胞中比CAT还要稳定[27]。此外,尽管GFP的 消光系数较低,但和荧光素一样,额定含量可高达80%。在荧光显微镜下,GFP融合蛋白的荧 光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。 但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋 白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP 是迄今为止唯一一种活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
绿色荧光蛋白gfp标记方法参考PPT
结果，并记录
2021/5/9
5
二.X-3感受态细胞的制备
1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于 50 ml LB液体培养基中，30℃，170 r/min 振荡 培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液 体培养基中，30℃，170 r/min 振荡培养，每1 h 测定1 次 OD600
3.电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪 4.立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品 5.荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜 6.离心机：EPPENDORF 7.凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging 8.质粒DNA：购自AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA
2
GFP标记
菌落观察
2021/5/9
油镜观察
3
本实验所需的的材料
1.LB培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水 1000ml，pH 7.0 2.抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自Sigma公司 3.PEB洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.4
System
2021/5/9
4
一.gfp质粒的提取
1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验
2.按照AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA说明书上的方法进行相 关操作
3.采用1%琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA检测 a.凝胶制备：琼脂糖 （1g）+TAE（100ml） → 微波滴在制胶板上，同时做mark对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察
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二.X-3感受态细胞的制备
1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于 50 ml LB液体培养基中，30℃，170 r/min 振荡 培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液 体培养基中，30℃，170 r/min 振荡培养，每1 h 测定1 次 OD600
3.电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪 4.立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品 5.荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜 6.离心机：EPPENDORF 7.凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging 8.质粒DNA：购自AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA
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GFP标记
菌落观察
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油镜观察
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本实验所需的的材料
1.LB培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水 1000ml，pH 7.0 2.抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自Sigma公司 3.PEB洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.4
System
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4
一.gfp质粒的提取
1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验
2.按照AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA说明书上的方法进行相 关操作
3.采用1%琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA检测 a.凝胶制备：琼脂糖 （1g）+TAE（100ml） → 微波滴在制胶板上，同时做mark对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察
绿色荧光蛋白(GFP)PPT课件
他与Tulle Hazelrigg结了婚。 她后来加入了哥大。她允许他引用 她在"Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression"上的未发表研究，条件 是他在一个月的时间内煮咖啡、做 饭、每晚倒垃圾。
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8
2008年诺贝尔化学奖获得者
C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\钱永健希望更多中 国青年投身基础研究_标清.mp4
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2
2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1928年出生于日本京都市， 毕业于名古屋大学，是日本化 学家、海洋生物学。
1960年开始，在美国普林 斯顿大学学者约翰逊的邀请下 ，前往美国，先后在普林斯顿 大学、波士顿大学和麻省伍兹 霍尔海洋生物实验所工作。
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3
2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1961年，下村修等人从大量的多管水 母属中分离了水母素及腔肠素。他们发现 生物发光是由钙离子引发的。这项研究开 展了对绿色荧光蛋白的研究。
1962年，他从一种水母中发现了荧光 蛋白，被誉为生物发光研究第一人。
维多利亚多管发光水母能够放出蓝色的荧光。这是 透过快速释放与水母素相互作用的钙离子（Ca2+）生 成的。所放出的蓝光会被绿色荧光蛋白转变为绿光。水 母素和绿色荧光蛋白都是生物学研究的重要工具。
C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\机制.mp4 C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\TED.mp4
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20
绿色荧光蛋白的应用前景
肿瘤切除手术的现状： 凭借医生经验，难以根除，容易残留 ，容易转移。
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2008年诺贝尔化学奖获得者
C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\钱永健希望更多中 国青年投身基础研究_标清.mp4
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2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1928年出生于日本京都市， 毕业于名古屋大学，是日本化 学家、海洋生物学。
1960年开始，在美国普林 斯顿大学学者约翰逊的邀请下 ，前往美国，先后在普林斯顿 大学、波士顿大学和麻省伍兹 霍尔海洋生物实验所工作。
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2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1961年，下村修等人从大量的多管水 母属中分离了水母素及腔肠素。他们发现 生物发光是由钙离子引发的。这项研究开 展了对绿色荧光蛋白的研究。
1962年，他从一种水母中发现了荧光 蛋白，被誉为生物发光研究第一人。
维多利亚多管发光水母能够放出蓝色的荧光。这是 透过快速释放与水母素相互作用的钙离子（Ca2+）生 成的。所放出的蓝光会被绿色荧光蛋白转变为绿光。水 母素和绿色荧光蛋白都是生物学研究的重要工具。
C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\机制.mp4 C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\TED.mp4
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绿色荧光蛋白的应用前景
肿瘤切除手术的现状： 凭借医生经验，难以根除，容易残留 ，容易转移。
绿色荧光蛋白PPT模板.ppt
用荧光蛋白在鼠脑中绘制的油画
3.3 小动物体内恶性肿瘤生长过程及药物作用效果 的实时光学成像监测：
No Image
(a) 整体荧光成像系统示意图．(b)整体荧光成像监测2 胰腺癌细胞(表达红色荧光蛋白)的生长以及治疗效果．肿 瘤细胞种植后10，17，24，48 和56 天分别进行成像．粗箭头表示原位灶．细箭头表示转移灶．与对照组进行 比， 药物部分抑制原位灶和转移灶的生长，而 药物则在一个月内大大抑制肿瘤的生长，但是一个月之后，继
2. 发光机制： 生色团是由其中的三件下 不能形成荧光．生色团通过66 的脱质子 (酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射。
生色团的66 和67 相对比较保守，而65相对易变，因此可用其他氨基酸替 换。
3. 典型应用：
3.1 技术 ——活细胞内基因表达及蛋白质-蛋白质相互作用的光学成像与可视化
R
C
Y
C
3.2 不同神经元的多色标记与光学成像:
结合其他颜色荧光蛋白，比如红色荧光 蛋白，可对同一个细胞的不同细胞器和不同 细胞进行标记．其中最具代表性的实验莫过 于2007 年的“脑虹”。
哈佛大学的研究人员通过转基因技术将 不同光谱的荧光蛋白基因整合进实验老鼠的 基因组，并且只让它们在老鼠脑神经元表 达．
谢谢！
绿色荧光蛋白
化 基：张 赫 学 号：2
2008年，诺贝尔化学奖：
Y.
目录：
发
典
结
光
型
展
构
机
应
望
制
用
1. 绿色荧光蛋白的结构：
: 分子量27 238个氨基酸残基 11个β折叠 位于圆桶中央的α螺 旋含有一个含6肽组 成的发光中心
N端 C端
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位
发 波 长 为
488nm ， 采 取 图 像 。
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":{},"bdText":"","bdMini":"2","bdMiniList
":false,"bdPic":"","bdStyle":"0","bdSize" :"32"},"share":{},"image":{"viewList":["c opy","sqq","qzone","tsina","tqq","renren" ,"weixin"],"viewText":" 分 享 到 ：
内蛋白质、核酸等定位及活体动态研究。二、主
要步骤 1．真核表达载体的构建 引物设计利用引物设计软件，根据 pEGFP-N1 的酶切位点设计目的基因引物：②载体构建将
那里。这个不是木子故意要考的，就像电视剧里那样女主为了男主拼尽全力，努
PCR 产物酶切后插入 pEGFP-N1，得到表达目的基 因与 EGFP 融合蛋白质的真核表达载体。2．转染 真核细胞当细胞生长到对数生长期时，接种到共
","viewSize":"16"},"selectShare":{"bdCont ainerClass":null,"bdSelectMiniList":["cop y","sqq","qzone","tsina","tqq","renren","
GFP功能性包涵体PPT课件
gfp功能性包涵体ppt课件
• 介绍 • gfp的结构和特性 • gfp的表达和检测 • gfp在生物科学研究中的应用 • gfp的未来发展和挑战
01
介绍
gfp的背景和重要性
背景
gfp，即绿色荧光蛋白，是一种重要的生物标记工具，最初是从水母中分离出 来的。它在生物学研究中广泛应用于标记和追踪细胞、蛋白质和基因的表达。
利用GFP标记的生物分子或细胞，实现对疾病发生、发展过程的实 时监测和诊断。
药物筛选与研发
利用GFP报告基因，监测药物对细胞或生物体内特定靶点的作用， 为新药研发提供快速、有效的筛选方法。
生物成像与示踪
利用GFP的荧光特性，实现活体细胞、组织和器官的实时成像和示踪， 为生物学、医学和农学等领域的研究提供有力工具。
gfp研究和应用中面临的挑战和问题
01
荧光共振能量转移（FRET）问题
在荧光蛋白标记技术中，FRET现象可能导致荧光信号的干扰和误差，
需要进一步研究和优化。
02
细胞毒性问题
部分荧光蛋白或其突变体可能对细胞产生毒性，影响实验结果的可靠性
和应用范围。
03
基因编辑技术的限制
目前基因编辑技术仍存在效率和安全性等方面的问题，影响了GFP在某
在适当的诱导条件下，如添加IPTG， 促进目的基因的表达。
检测方法
通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋 白的表达情况，或通过Western blot检测目的蛋白的表达水平。
gfp的表达和检测实例
实验步骤
诱导表达gfp基因，通过荧光显 微镜观察绿色荧光蛋白的表达情
况，并记录实验结果。
结果分析
分析实验结果，得出gfp基因表 达的结论。
由于其高灵敏度，gfp常用于检测低 浓度的蛋白质和核酸。
• 介绍 • gfp的结构和特性 • gfp的表达和检测 • gfp在生物科学研究中的应用 • gfp的未来发展和挑战
01
介绍
gfp的背景和重要性
背景
gfp，即绿色荧光蛋白，是一种重要的生物标记工具，最初是从水母中分离出 来的。它在生物学研究中广泛应用于标记和追踪细胞、蛋白质和基因的表达。
利用GFP标记的生物分子或细胞，实现对疾病发生、发展过程的实 时监测和诊断。
药物筛选与研发
利用GFP报告基因，监测药物对细胞或生物体内特定靶点的作用， 为新药研发提供快速、有效的筛选方法。
生物成像与示踪
利用GFP的荧光特性，实现活体细胞、组织和器官的实时成像和示踪， 为生物学、医学和农学等领域的研究提供有力工具。
gfp研究和应用中面临的挑战和问题
01
荧光共振能量转移（FRET）问题
在荧光蛋白标记技术中，FRET现象可能导致荧光信号的干扰和误差，
需要进一步研究和优化。
02
细胞毒性问题
部分荧光蛋白或其突变体可能对细胞产生毒性，影响实验结果的可靠性
和应用范围。
03
基因编辑技术的限制
目前基因编辑技术仍存在效率和安全性等方面的问题，影响了GFP在某
在适当的诱导条件下，如添加IPTG， 促进目的基因的表达。
检测方法
通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋 白的表达情况，或通过Western blot检测目的蛋白的表达水平。
gfp的表达和检测实例
实验步骤
诱导表达gfp基因，通过荧光显 微镜观察绿色荧光蛋白的表达情
况，并记录实验结果。
结果分析
分析实验结果，得出gfp基因表 达的结论。
由于其高灵敏度，gfp常用于检测低 浓度的蛋白质和核酸。
大学精品课件：2015年第05讲+GFP绿色荧光蛋白
4
5
下村修从大量的维多 利亚水母中分离出的 蛋白，在UV照射下 发出绿色荧光
水母素与钙离子结合-发出蓝光 蓝光被GFP吸收，发出荧光
6
钱永健，Roger Tsien
Professor，美国科学院院士 Department of Chemistry, UCSD
主要贡献: 系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理， 并对它进行了大刀阔斧的化学改造， 不但大大增强了它的发光效率， 还发展出了红色、蓝色、黄色、青色荧光蛋白
12
Chalfie，查尔非
Professor, Columbia University
线虫体内表达了绿色荧光蛋白
13
14
荧光蛋白的结构解析
15
维多利亚水母GFP由238个AA组成，分子量约27kD
16
17
Topology structure (拓扑结构分析）
18
荧光生色AA为65,66,67
33
GFP用于药物筛选
34
GFP用于肿瘤研究
35
GFP用于细胞定位研究
36
37
利用GFP观察病毒入侵宿主
38
39
40
41
42
43
可用于检测重金属离子污染
44
45
46
中国首例有GFP转基因荧光猪
47
48
能发绿色荧光的油菜(UV light)
49
GFP“调色板”
50
51
“Methods for tumor diagnosis and therapy” US Patent 20030021791
55
计算机辅助设计的探针分子
Extracellular PAP (Prostatic Acid Phosphatase)
5
下村修从大量的维多 利亚水母中分离出的 蛋白，在UV照射下 发出绿色荧光
水母素与钙离子结合-发出蓝光 蓝光被GFP吸收，发出荧光
6
钱永健，Roger Tsien
Professor，美国科学院院士 Department of Chemistry, UCSD
主要贡献: 系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理， 并对它进行了大刀阔斧的化学改造， 不但大大增强了它的发光效率， 还发展出了红色、蓝色、黄色、青色荧光蛋白
12
Chalfie，查尔非
Professor, Columbia University
线虫体内表达了绿色荧光蛋白
13
14
荧光蛋白的结构解析
15
维多利亚水母GFP由238个AA组成，分子量约27kD
16
17
Topology structure (拓扑结构分析）
18
荧光生色AA为65,66,67
33
GFP用于药物筛选
34
GFP用于肿瘤研究
35
GFP用于细胞定位研究
36
37
利用GFP观察病毒入侵宿主
38
39
40
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42
43
可用于检测重金属离子污染
44
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46
中国首例有GFP转基因荧光猪
47
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能发绿色荧光的油菜(UV light)
49
GFP“调色板”
50
51
“Methods for tumor diagnosis and therapy” US Patent 20030021791
55
计算机辅助设计的探针分子
Extracellular PAP (Prostatic Acid Phosphatase)
GFP融合蛋白进行蛋白质的亚细胞定位解析PPT课件
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23
参考文献
[1]崔志芳,邹玉红,季爱云. 绿色荧光蛋白研究三个里程碑—2008年诺贝尔化学 奖简[J]. Chinese Joural of Nature,2008,30(6):324—328.
[2]徐飞虎,龚兴国. 绿色荧光蛋白应用研究进展[J]. 细胞生物学杂志, 2002, 24(6):332—334.
可以在活细胞中进行图像分析，也可以检测固 定细胞中的GFP。
.
21
GFP融合蛋白的检测
注意事项： 以gfp作为报告基因研究蛋白亚细胞定位，必
须做对照。由于某些细胞本身也有自发荧光， 必须识别自发荧光与GFP的绿色荧光，以免假 象干扰实验，避免得出错误结论。 并不是所有的构建正确的融合基因都能正常表 达，因此要尽可能多的获得转基因细胞，如果 数目较少，可能会检测不到荧光。
.
15
GFP的改进
除去GFP基因中隐蔽型内含子 消除编码蛋白的积累 将GFP定位到特定细胞器中 改变碱基组分 更换GFP生色团氨基酸 插入植物内含子 增加增强子和更换强启动子
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16
GFP的应用
蛋白质定位 作为报告基因 药物筛选 融合抗体 生物传感器 其他方面
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17
GFP融合蛋白的构建
真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大 部分蛋白是在胞浆或糙面内质网合成，最终运至不同 地点，形成成熟的蛋白质并行使功能。
译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有 蛋白分子定位信号，可引导蛋白质在胞内定位。
蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中 心问题，也是分子生物学研究的热门话题。理解某些 蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能，意义重大。
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14
GFP的改进
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3
本实验所需的的材料
1.LB培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水 1000ml，pH 7.0 2.抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自Sigma公司 3.PEB洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.4
System
4
一.gfp质粒的提取
1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验
2.按照AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA说明书上的方法进行相 关操作
3.采用1%琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA检测 a.凝胶制备：琼脂糖 （1g）+TAE（100ml） → 微波加热
至透明倒 入制胶板中 b.2 μl质粒+2 μl单染料滴在制胶板上，同时做mark对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察
纤维素降解菌X-3的GFP标记
1
试验路线
gfp质粒的提取
X-3感受态细胞的制备
gfp质粒+X-3感受态细胞 电击转化
X-3-gfp标记菌
经过传代培养验证其稳定性，同时检测其 相关理化特性（ph，温度，含氧量，转 速等）是否受到影响，确定gfp标记的细 菌可以用于进一步研究
2
GFP标记
菌落观察
油镜观察
结果，并记录
5
二.X-3感受态细胞的制备
1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于 50 ml LB液体培养基中，30℃，170 r/min 振荡 培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液 体培养基中，30℃，170 r/min 振荡培养，每水浴中放置20 min 后，用PEB洗涤液冲洗细胞4 次 。具体过程： 用50ml PEB洗涤液冲洗离心过的菌体，轻轻混 匀，然后放于离心机（8000r,5min）离心，重 复四次。这些过程都需要随时放在冰盒上，保 持冷却。
6
3.电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪 4.立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品 5.荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜 6.离心机：EPPENDORF 7.凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging 8.质粒DNA：购自AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA
本实验所需的的材料
1.LB培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水 1000ml，pH 7.0 2.抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自Sigma公司 3.PEB洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.4
System
4
一.gfp质粒的提取
1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验
2.按照AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA说明书上的方法进行相 关操作
3.采用1%琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA检测 a.凝胶制备：琼脂糖 （1g）+TAE（100ml） → 微波加热
至透明倒 入制胶板中 b.2 μl质粒+2 μl单染料滴在制胶板上，同时做mark对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察
纤维素降解菌X-3的GFP标记
1
试验路线
gfp质粒的提取
X-3感受态细胞的制备
gfp质粒+X-3感受态细胞 电击转化
X-3-gfp标记菌
经过传代培养验证其稳定性，同时检测其 相关理化特性（ph，温度，含氧量，转 速等）是否受到影响，确定gfp标记的细 菌可以用于进一步研究
2
GFP标记
菌落观察
油镜观察
结果，并记录
5
二.X-3感受态细胞的制备
1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于 50 ml LB液体培养基中，30℃，170 r/min 振荡 培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液 体培养基中，30℃，170 r/min 振荡培养，每水浴中放置20 min 后，用PEB洗涤液冲洗细胞4 次 。具体过程： 用50ml PEB洗涤液冲洗离心过的菌体，轻轻混 匀，然后放于离心机（8000r,5min）离心，重 复四次。这些过程都需要随时放在冰盒上，保 持冷却。
6
3.电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪 4.立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品 5.荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜 6.离心机：EPPENDORF 7.凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging 8.质粒DNA：购自AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA