16.1植物基因转移的方法
植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)
一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。
另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。
它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。
其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。
农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。
T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。
1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。
Ti质粒大约在160～240kB之间。
其中T-DNA大约在15kb-30kb。
Vir基因区在36kb 左右。
除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。
植物转基因技术
植物基因工程南京中医药大学药学院陈建伟植物转基因技术植物基因转化方法n植物基因工程实验中，植物细胞只有经过 遗传转化才能获得转基因植株。
n已经发展了许多用于植物细胞的遗传转化 的方法，可分为三大类：n①载体介导法n②基因直接导入法n③种质系统法植物细胞的遗传转化的方法n①载体介导法，即将目的基因插入到根癌农杆菌的 质粒或病毒的DNA分子上，随着载体质粒或病毒 DNA的转移而转移。
共培养法及病毒介导法属于这 类方法。
n②基因直接导入法，指通过物理或化学方法直接将 外源目的基因导入植物细胞的方法。
n物理方法有基因枪法、电击法、超声波法、显微注 射法和激光微束法。
n化学方法有PEG法和脂质体法。
n③种质系统法，包括花粉管通道法、生殖细胞浸染 法、胚囊和子房注射法。
几种常用方法介绍1、花粉管通道法n又称子房注射法、种质系统法。
最早由周光宇 等(1983)建立。
n此法是在植物授粉后，将外源DNA注入植物 子房的胎座位置，使DNA沿花粉管通道进入 胚囊，与受精卵或胚细胞接触而达到转化的目 的。
n这一方法的建立开创了整株活体植物转化的先 例，操作方便易行，避免了组织培养的麻烦， 在改良作物遗传性状的工作中有很大的潜力。
2、PEG介导法n PEG介导法为我国学者高国楠首创，是借助 化合物PEG、磷酸钙及高pH条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。
n PEG是细胞融合剂，可通过引起细胞膜表面 电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞间融合和外源DNA分子进入原生质体。
磷酸钙可与DNA结合形成DNA磷酸钙复合物而被原生质体摄入。
3、电击法n利用高压电脉冲的电击穿孔作用将质粒DNA 导入植物原生质体的方法称电击法。
此法起初 是应用于动物细胞。
n在植物细胞中进行基因转移是李宝健等在 1985年首创。
目前这一方法已广泛应用于双 子叶植物和单子叶植物。
n通过电击技术将基因直接导入带壁的植物细胞 或组织的方法称为电注射法。
植物细胞转基因技术
适用范围广，不依赖组织培养人工再生植株； 可直接获得转基因种子，育种时间短，在鉴定
时可直接针对目的性状的表现型来进行,简单快
捷； 转化速度较快，变异性状稳定较快； 方法简单,不需要复杂昂贵的仪器设备。
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缺点： 转化受体受植物花期的限制，同时必须充分了解 每一种植物的开花受精的时间过程。 在自然田间进行操作，受环境条件的影响很大。 操作的经验性很强,需要一定的技巧。 利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的 转基因植株。
10bp 和4bp 两组,是完全保守的。这两个边界是 T -DNA 转移所必需的。其中尤以右边界最为重
DNA
1
2
3
4
5
6
vir基因
Ti 质粒的 vir 区大小为30kb ,分 VirA 、B 、C 、D 、E 、G 、H 等7 个操纵子,一共有24 个 基因共同控制着 T -DNA 的加工和转移,它们总 称调控子。
4.化学物质诱导法
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优点：
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PEG法操作简单、成本低、结果较稳定、重复性
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好、无需昂贵的基因转化仪器，且嵌合转化体很
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少产生。
缺点： 原生质体培养再生难度较大； 原生质体再生培养的转化植株变异率高,易产生白 化苗，且由于 PEG法对原生质体活力有害，转化 率低。 应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡 椒等植物的转基因植株。
电击法
DNA 混合入电击缓冲液 幼苗
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优点： 操作简便，可以一次转化许多原生质体，转化效
率较高，特别适于瞬间表达。
缺点： 有原生质体培养的麻烦,电穿孔易造成原生质体损伤使再生率降低。
植物基因是如何转移的？
植物基因是如何转移的？作者：冬雪来源：《百科知识》2014年第18期把一种外源性基因转移到另一种原来并不含这种基因的生物体内是基因的拼接和重组，也就是转基因，这种技术是基因工程的一种形式。
目前的转基因主要分为对植物基因和对动物基因的转移两大类。
本文描述的是植物转基因。
转移植物基因的两种方法一种或多种外源性基因是如何转入另一种植物（作物）体内的呢？可以用一种通俗的比喻来解释。
例如，人类社会是由无数个家庭组成的，每个家庭都有固定的家庭成员，除了血缘的紧密纽带关系外，还有经济和其他的关系把家庭成员固定在一起，家庭成员不会轻易分离，同时一个家庭也不会让陌生人进入。
一旦有另一名成员进入一个稳定的家庭，除非是特别亲近的亲属关系或收养关系，都会受到这个家庭成员的排斥，不可能被这个家庭接受，所以被称为“第三者”。
一种植物体内的染色体（DNA）中的基因也是固定的，轻易不能分开和分解，一个或几个外源性基因就是第三者，一般是不会被一种受体植物所接受的，如果受体植物发现了外源性基因，就会用自身的武器，如DNA酶来降解（杀灭）外来基因。
因此，为了有效转移外源性基因，如将外源性的抗虫基因——苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）转移到棉花中，就得采取两种办法。
一种是载体转移（包装法或间接法）；另一种是直接转移，或强行转移。
用载体作为媒介进行基因转移就是将目标基因连接或包裹于某一载体DNA中，载体通常是微生物，然后通过载体感染受体植物，将外源性基因转入植物细胞。
直接转移是利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源性基因转入植物细胞。
所以，前一种方法是包装法，也是一种蒙蔽或欺骗方法；后一种方法是强硬的，有一点像陌生人或强盗强行闯入别人的家庭，并登堂入室，占据主要位置，或者说反客为主。
载体转移载体转移又称为农杆菌载体转移。
20世纪70年代末80年代初，研究人员发现，野生型Ri（根诱导）和Ti（瘤诱导）质粒可以转化烟草和马铃薯细胞获得再生植株，此后，以Ti质粒为载体的植物转基因技术逐渐得到应用。
植物转基因技术的原理和方法
植物转基因技术的原理和方法
1、植物转基因技术的原理
植物转基因技术是指将外源DNA片段插入到植物细胞的过程，从而改变植物的表型特征。
在植物转基因技术中，将外源DNA插入到植物细胞的过程包括以下几个步骤：
(1) DNA片段的生产和收集：DNA片段的生产和收集是通过一系列的生物技术手段来实现的，比如PCR扩增技术、染色体复制，等等。
(2)特異性克隆：特異性克隆是一种利用抗原受体系统的分子生物学技术，主要是通过聚合酶链反应的方法，将无菌的DNA片段植入到宿主细胞中，从而使改变细胞表型性状的抗原受体获得潜在的克隆特异来源。
(3) 载体特异性转染：载体特异性转染是将DNA片段植入到宿主细胞中的过程，它通常是利用哺乳动物质粒等载体将外源DNA片段植入到宿主细胞中。
(4) 转化：转化是植物细胞在受到DNA片段植入后，能够形成含有外源基因的植物的过程。
2、植物转基因技术的方法
(1) 诱导细胞抗性：植物转基因技术可以利用一些诱导剂，如多聚糖、双链RNA等，通过诱导植物细胞的自然抗性，让其增加免疫反应及抗外源性抗原的能力，从而提高转基因植物的转化效率。
(2) 共价结合技术：共价结合技术是一种利用化学方法将外源DNA植入植物细胞的技术，它通常利用某种活性稀释剂将DNA片段与
植物细胞表面形成稳定的共价结合，从而使外源DNA片段能够植入宿主细胞。
(3) 转化抗性：转化抗性是一种利用抗生素来抑制植物细胞的自然抗性，从而促进植物细胞内部外源DNA的转化。
一般常用的抗生素有青霉素和环丙沙星。
(4) 小麦内含体技术：小麦内含体技术是一种利用小麦内含体将外源DNA植入植物细胞的技术，它通常利用小麦内含体外质壁偶联（ECC）促进外源DNA的转化。
植物转基因技术的几种方法
植物转基因技术的几种方法
(1)农杆菌介导转化法将外植体放入含有外源基因的农杆菌(Agrobacteriumtume／ociens)菌液中浸泡，然后转入共培养基，再转入筛选培养基诱导抗性愈伤组织和抗性芽，生根后的抗性植株移栽至营养钵生长。
(2)基因枪法又称微弹轰击法。
其基本原理是将外源DNA黏附在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下，微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得以表达，从而实现基因的转化。
(3)花粉管通道法在植物授粉时将含目的基因的DNA溶液涂于柱头上，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为含转基因的新个体。
该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出。
我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。
该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。
(4)微注射法首先制备植物原生质体，游离出细胞，在倒置显微镜和显微操作器的帮助下，将目的基因DNA通过微管注射到受体细胞中。
(5)电穿孔法在短时间的高压直流电脉冲的冲击下，可以使原生质膜的分子疏松，形成暂时性的直径为3～4nl-n的小孔，但对原生质体生活力影响不大。
这时，存在于原生质体周围溶液中的外源DNA，就可以通过这种小孔进入原生质体，实现基因的直接转移。
(6)微束激光打孔法原生质体在短时间的微束激光照射下，可在质膜表面形成面积约0．25Pm2左右的小孔，使DNA分子进入细胞。
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基因转移的三种方式
基因转移的三种方式
基因转移是指将一个或多个基因从一种生物体中移植到另一种
生物体中，使得受体生物体也能表达新的基因。
基因转移有三种方式： 1. 体细胞核移植：这是一种将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中的技术。
这种方法已被用于动物的克隆，以便复制一个完整的动物。
在这种方法中，一个成熟细胞的核被提取，然后被移植到一个无核的细胞中。
这个受体细胞被激活，以便成为一个新的个体。
2. 病毒载体：这种方法利用病毒将基因载入目标细胞。
这种方法已被广泛用于研究和治疗人类疾病。
病毒可以被改造成携带目标基因，并将其引入人体细胞中。
这种方法可以用于治疗某些遗传性疾病，例如血友病和免疫缺陷病。
3. 基因枪：这种方法使用高速粒子束将DNA导入目标细胞。
这种方法已被用于转化植物和动物。
在这种方法中，基因被粒子束“发射”到目标细胞中。
这个过程被称为基因枪法，因为它使用的仪器类似于一把枪。
这些方法都具有独特的优点和限制，但它们都为基因转移提供了重要的工具和资源。
随着基因技术的不断发展，基因转移将继续为医学、农业和工业领域带来新的发展机会。
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植物转基因方法
植物转基因方法
1. 农杆菌介导法知道不？那可是个超厉害的植物转基因方法呀！就好比快递员把包裹准确送到收件人手里一样，农杆菌能把基因送到植物细胞里呢！比如把抗虫基因转到棉花里，棉花就不怕虫子啦！
2. 基因枪法也很牛呀！就像射击比赛一样，“砰砰”就把基因打入植物细胞啦！像把耐旱基因打入玉米里，玉米就能在干旱环境下好好生长咯！
3. 花粉管通道法也很有趣呢！就像是给植物开了个特别通道，基因可以通过这个通道进去。
好比给小麦开了个秘密入口，把优良基因送进去，小麦能长得更好呀！
4. 原生质体融合法呢，就好像把两个不同的东西融合在一起变成新的宝贝！把两个不同植物的原生质体融合，哇，会产生新的特性呢！像把茄子和辣椒的原生质体融一融，说不定会有超级特别的东西出来呢！
5. 直接导入法，简单又粗暴呀！直接把基因丢给植物细胞，嘿，就转进去了！比如给水稻直接导入营养增强基因，那水稻不就更有营养啦！
6. 病毒介导法就像搭便车一样呢！病毒带着基因进入植物细胞，多聪明呀！像让病毒带着增甜基因进入西瓜，那西瓜得更甜了吧！
7. 脂质体介导法，就如同给基因包上一层保护套，然后送进植物细胞。
比如给大豆用这个方法转个基因，让它更能抗病害呀！
8. 电击法也挺绝的！给植物细胞来点电击，基因就趁机进去了。
就好像给植物细胞来个刺激，把好基因塞进去，让植物变得更棒呢！
我觉得这些植物转基因方法都好神奇呀，能让植物变得更好，为我们的生活带来很多好处呢！。
植物遗传学中的基因转移技术
植物遗传学中的基因转移技术植物遗传学是研究植物的遗传性状和基因机制的学科。
在植物遗传学中，基因转移技术是一种重要的工具，它可以将外源基因导入植物细胞中，从而改变植物的遗传特征。
本文将探讨植物遗传学中的基因转移技术，包括其原理、应用和挑战。
一、基因转移技术的原理基因转移技术的原理是通过改变植物细胞壁的通透性，使得外源基因能够进入细胞，并被植物细胞所接受。
以下是一种常用的基因转移技术：农杆菌介导的基因转移。
农杆菌介导的基因转移是利用土壤中一种叫做农杆菌的细菌，将需要转移的基因载体导入农杆菌中，并利用其天然的寄生特性，在植物伤口处将基因载体转移到植物细胞中。
这种方法具有可选择载体和寄主、转移效率高、能直接转移到植物细胞染色体等优点，因此被广泛应用于植物遗传学研究中。
二、基因转移技术的应用基因转移技术在植物遗传学研究中有着广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 增加抗性：通过转移具有抗病性或抗虫性的基因到植物中，可以增加植物的抗性，提高农作物的产量和品质。
例如，转基因玉米通过转移昆虫抗虫基因，能够减少农药使用，提高玉米的产量。
2. 提高耐逆性：通过转移具有耐旱、耐盐等耐逆基因到植物中，可以增强植物对逆境环境的适应能力，提高植物的生存能力。
3. 改良品质：通过转移具有丰富营养成分或改善风味特性的基因到作物中，可以改善农作物的营养价值和口感，满足人们对食品的不同需求。
4. 创造新品种：通过基因转移技术，可以跨越物种间的基因障碍，实现不同物种的基因组合，创造出新的植物品种。
例如，转基因番茄中成功转移了来自非植物物种的基因，使其抗病能力大幅增强。
三、基因转移技术面临的挑战虽然基因转移技术在植物遗传学研究中有着广泛的应用，但也面临一些挑战。
1. 安全性问题：基因转移技术引起了许多关于安全性的争议，人们担心转基因植物可能引发生态环境和健康方面的不确定风险。
2. 遗传污染问题：基因转移技术可能会导致转基因植物与野生植物杂交，从而导致基因流动和遗传污染。
将基因导入植物细胞的方法
将基因导入植物细胞的方法
将基因导入植物细胞主要有以下几种方法：
1. 农杆菌转化法（Agrobacterium-mediated transformation）：这是一种常用的植物基因转化技术。
首先，将目标基因通过重组DNA技术导入到农杆菌的转化质粒中，并将转化质粒引入农杆菌细胞中。
然后，利用农杆菌的自然感染能力，将转化质粒中的目标基因转移到植物细胞中。
最后，通过适当的选择压力来筛选出含有目标基因的转化植物细胞。
2. 生物颗粒枪法（Biolistic particle bombardment）：这是一种将基因导入植物细胞的物理方法。
将目标基因包裹在微小金属颗粒或微小DNA颗粒上，并将这些颗粒射击到植物细胞中。
这些颗粒能够穿透植物细胞壁和细胞膜，并将目标基因导入植物细胞核。
最后，通过适当的选择压力来筛选出含有目标基因的转化植物细胞。
3. DNA化学转化法（Chemical transformation of DNA）：这是一种利用化学物质将目标基因导入植物细胞的方法。
首先，将目标基因与转化载体进行连接，并将连接后的DNA分子与一些化学物质混合。
这些化学物质能够破坏植物细胞壁和细胞膜的完整性，并促使DNA分子进入细胞。
最后，通过适当的选择压力来筛选出含有目标基因的转化植物细胞。
这些方法都可以在实验室中进行，并且在不同的植物种类中都有应用。
不同的方法适用于不同的植物种类和目标基因，选择合适的方法可以提高基因导入的效率。
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植物基因转移的方法
化学的方法植物基因转移的方法
物理学
的方法
生物学的方法
脂质体法显微
注射法基因枪法
电击法
物理学
方法
物理学方法
化学的方法PEG 磷酸钙
农杆菌介导的基因转移法
病毒介
导的基
因转移
法
生物学的方法
一、脓杆菌介导的基因转移-生物法
●土壤农杆菌有2种
根瘤农杆菌(Ti质粒）、发根农杆菌(Ri质粒)●根瘤农杆菌的质粒DNA转入植物细胞后，会导
致植物产生冠瘿瘤，这是由于Ti质粒上有一
段T－DNA，能转移并整合进入植物基因组中，导致冠瘿瘤形成。
Ti质粒的结构
●两个重要的功能区
①T－DNA区
（转移DNA区）
②Vir区（毒性区）
●右边界和Vir 区是必须的
二、基因枪介导的基因转移
●基因枪法最早是1987年由美
国康奈尔大学的Sanford最先
设计的。
●同年Kliein等首次用基因枪
将从烟草花叶病毒分离的RNA
及携带有基因的质粒DNA导入
洋葱表皮细胞。
击发装置枪管
基因枪介导的基因转移的特点
1、优点：
•操作简单、效率高、周期短。
•经金属微粒包裹后的DNA不影响其生物活性。
•受体选择的余地大，不受物种限制。
2、缺点
•转移的外源基因往往是多拷贝的，可能会影响植物内源基因的表达。
思考题
1、植物基因转移的方法有哪些？
2、简述脓杆菌介导的基因转移的原理。
3、简述基因枪介导的基因转移的优缺点。
Thank You!。