dna体外扩增技术总结

dna体外扩增技术总结

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目的的获取及体外扩增技术概述

在基因的研究及体外人工复制过程中，我们通常把需要研究的基因称为目的基因。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,如何获得目的DNA片段就成为基因工程的关键问题。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达，常用的有PCR法、cDNA法及建立基因文库等。

1.PCR法技术及原理

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。它是一种体外酶促合成，扩增特定 DNA片段的方法。1985年由美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制。随着科学技术的

发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。

PCR技术模拟DNA的天然复制过程，基于DNA的半保留复制原理，其特异性依赖于与靶两端互补的寡核苷酸引物，该原理主要包括3个基本反应过程：变性——退火——延伸。变性主要是指双链DNA的变性，即双链DNA经加热至93℃左右，其热稳定性降低，配对碱基之间的氢键断裂，使双链DNA成为单链，以便与引物结合。退火是指单链DNA在温度降低时与引物的复性（称为退火）。在此过程中，引物与单链DNA模板仍然按照碱基互补的方式配对。延伸是指引物与DNA模板按碱基互补的原则配对后，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，进行体外的半保留复制，合成一条新的与模板DNA链互补的新链。经重复循环变性——退火——延伸3个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一次循环需2～3min，2～3h就能将目的基因扩增、放大几百万倍。一般单一拷贝的基因循环25～3O次，DNA可扩增 100万～200万倍。

由于该技术具有较强的灵敏度，由于产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克量级的起始待测模板扩增到微克水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。同时

对标本的纯度要求低，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织

等DNA扩增检测。加之准确度和特异性，又能快速简便进行检测，因而其应用领域也在不断延伸。但由于其复制必须有引物做模板，故只能用于复制扩增及检测已有的DNA片段，使用上具有一定的局限性。

2.cDNA文库法

cDNA为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA 双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA）不同而无内含子；相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及续序列等一起反映出mRNA结构。

由于真核生物基因组DNA非常庞大，而且含有大量的重复序列，很难直接分离得到靶基因片段，而cDNA则反转录的RNA，不含冗余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快的分离得到相关基因。同时由于RNA分子敏感脆弱，自然状态下难以被扩增，因此为了研究mRNA所包含的信息，一般将其反转录为稳定的双螺旋DNA分子（即cDNA）在插到自我复制的载体中即可。

此过程包含5个阶段：

（1）总RNA的提取。细胞中总RNA包含mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA），一个典型的动物细胞总RNA含量中，rRNA占80%～85%，tRNA和sRNA约占15%～20%，而mRNA只占1%～5%。同时由于mRNA为单链，容易受核酸酶攻击被破坏，因此要保证环境和实验器皿没有被RNA酶污染。从而保证被提取物良好的存活率。总RNA抽提方法有很多种，目前实验室常用的方法是用异硫氰酸胍—苯酚抽提法，使用Trizol试剂进行。除此之外还有硅胶模纯化柱法等。

（2）mRNA的纯化。真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端的帽子结构和3’端的polyA尾巴，此结构为真核生物mRNA的提取提供了极为方便的选择性标志。试验中常用寡聚纤维素

色谱柱法获得高纯度的mRNA，在高盐缓冲液下，mRNA被特异性结合到色谱柱上，再用低盐或蒸馏水洗脱，经两次色谱柱纯化后即可得高浓度mRNA。目前许多商业试剂盒也可以用作mRNA的纯化，并且

有相当好的效果。操作简便，快捷

且灵敏度较高。

（3）cDNA的合成。cDNA的合成包括第一链和第二链的合成。第一链是一mRNA为

模版，在反转录酶的作用下反转录成cDNA.该酶和成DNA时需要引物引导，常用的引物为oligodT。第二链cDNA的合成是以第一链为模板，以DNA聚合酶催化。

（4）cDNA文库的构建。由于cDNA的长度一般在0.5～8kb，常用噬菌体类载体和

质粒做载体，将 cDNA 重组到载体上。合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法：

①借助于末端转移酶的 3' -OH 端合成均聚物的能力，双链cDNA 和线性化载体 DNA 的 3' -OH 端分别加上均聚核苷酸链；