MALBAC单细胞扩增技术简介
单细胞测序新技术-MALBAC简介
随着第二代测序平台的大规模普及，人类单倍型计划、千人基因组计划、癌症基因组计划、Meta-Hit计划等重大国际合作项目相继开展，将基因组研究日渐推向高潮。然而，迄今为止使用的测序材料无一例外都是大量细胞的混合DNA样本。一方面，在微生物生态学、癌症基因组、法医学、微量诊断、遗传印记等研究中，显然无法满足测序的mg级样品量需求；另一方面，细胞之间存在很大的异质性，对群体样品或混合样品进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息。而单细胞全基因组扩增技术为解决以上难题打开了一扇崭新的大门。
全基因组扩增（Whole Genome Amplification, WGA）技术是一种对全部基因组序列进行非选择性、均匀扩增的技术，其目的是在没有序列偏向性的前提下大幅增加DNA的总量。
常用的WGA技术主要分为两种类型：
1.基于热循环以PCR为基础的WGA技术,如简并寡核苷酸引物PCR (Degenerate oligonucleotide primer PCR, DOP-PCR)、连接反应介导的PCR (ligation mediated PCR, LM-PCR)、扩增前引物延伸反应(Primer extension preamplification, PEP)等；
2.基于等温反应不以PCR为基础的WGA技术，如多重置换扩增(Multiple displacement amplification, MDA) 和基于引物酶的全基因组扩增(Primase-based whole genome amplification, pWGA)。
上述技术可以对少量样品进行扩增，但对于极微量样品进行全基因组扩增时往往会产生非特异的扩增假象，影响实验结果。为此，亿康基因（https://www.360docs.net/doc/509656070.html,/）基于哈佛大学谢晓亮院士研究组研发的一项专利技术——多次退火环状循环扩增技术（Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles,简称MALBAC）推出了单细胞全基因组/转录组测序服务，解决了基因组扩增对微量初始模板过大的扩增偏倚，使基因组测序的模板需求量从μg级降至单细胞水平。该技术及其在研究人类精子重组方面的独特应用已在顶级科学期刊《Science》公开发表。
单细胞测序新技术—MALBAC技术：
C. Zong*, S. Lu*, A.R. Chapman*, X.S. Xie Genome-Wide Detection of Single Nucleotide and Copy Number Variations of a Single Human Cell Science .338:1622 (2012)
https://www.360docs.net/doc/509656070.html,/content/338/6114/1622.abstract https://www.360docs.net/doc/509656070.html,/
使用MALBAC技术首次绘制高覆盖度单精子基因图谱：
S. Lu*, C. Zong*, W.Fan*, M. Yang*, et al., Probing Meiotic Recombination and Aneuploidy of Single Sperm Cells by Whole Genome Sequencing using MALBAC Science. 338:1627 (2012) https://www.360docs.net/doc/509656070.html,/content/338/6114/1627.abstract https://www.360docs.net/doc/509656070.html,/
单细胞藻类
、单细胞藻类 单细胞藻是海洋植物中结构最简单、但在海洋生态系统中最具重要意义的一群生物，它们是许多水生动物的直接饵料。而那些不是直接摄食单细胞藻类为生的动物，也大都是间接地以它们作饵料，经过一次或多次转换才成长起来的。据初步估算，自然界要生产出一公斤的鱼肉，约需数百公斤至上千公斤的单细胞藻类。因此，可以说：海域单细胞藻类的丰富程度是该海域渔业丰歉的一重要决定因素。当然，这里也应指出，如果某海域有机污染严重，造成水体富营养化，那么，在温、盐等环境条件适宜的情况下，可能会形成‘赤潮’(有关‘赤潮’的问题将在第五章海洋灾害加以叙述)。此外，有些单细胞藻类在研究海流与水团的动态方面有重要意义；有些种类可附着于大型海藻体表，成为藻类养殖的害藻；有些还附生于船底，能降低船的航速。 单细胞藻类在硅藻门、甲藻门、裸藻门、金藻门、黄藻门、蓝藻门、红藻门、绿藻门中都有它们的存在。其中，种类最多、数量最大的是硅藻门和甲藻门。 福建海域地处台湾海峡西部，是东海和南海的过渡区，常年受南海暖流和闽浙沿岸流的交错影响，况且还接纳许多河川输入的大量营养盐，水体肥沃，单细胞藻类非常丰富，调查记载的种类近千种，数量常年平均每立方米水体有单细胞藻类1340万个左右。近岸、港湾区的数量还要大得多，如：厦门西港区1987年调查时，年平均竟高达每立方米水体1.8亿个。 (一)硅藻门(Bacillariophyta) 硅藻为单细胞生活或借助胶质连成群体。细胞具有特殊的壳壁，壳壁主要成分是由果胶质和硅质组成。壳壁由两瓣套合，分为上、下壳，上壳稍大、下壳较小。壳面有各种花纹。根据花纹排列，分为中心纲和羽纹纲。福建省沿海(包括台湾海峡)共已记录了784种，其中，中心纲308种，羽纹纲476种。现将最主要属种简介如下： 1.中心纲(亦称辐射纲)(Centricae)
全基因组扩增
全基因组扩增——微量DNA分析的金钥匙 来源：青年人(https://www.360docs.net/doc/509656070.html,) 更新时间：2010/3/8 19:51:27 【字体：小大】 聚合酶链反应(PCR)技术的发展和应用使得微量甚至单个细胞DNA的分析成为可能，极大地促进了法医学、古生物学、分子诊断学和分子病理学的发展。但即便是对于非常敏感的PCR技术，许多材料所能提供的DNA量也只能用于一次或几次PC R反应。为能从少量细胞中最大限度的获取信息，全基因组扩增技术应运而生。 一、全基因组扩增的概念 全基因组扩增（whole genome amplification, WGA）是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。常用的方法有IRS-PCR（interspersed repeat sequence PCR）［1］、LA-PCR（linker ada ptor PCR）［2］、T-PCR（Tagged-PCR）［3］、DOP-PCR（degenerate oligonucleotide pr imed PCR）［4］、PEP-PCR（primer extension preamplification PCR）［5］等。其中最具代表性方法是DOP-PCR和PEP-PCR。 DOP-PCR和PEP-PCR的基本原理都是通过其随机引物与基因组DNA多处退火从而使大部分基因组序列得到扩增。DOP-PCR的引物是由其3′和5′端的特异核苷酸序列和中间的6个核苷酸构成的随机引物组成。其PCR程序是先在低退火温度下进行几个循环的低严谨扩增，然后再提高退火温度，进行几十个循环的严谨扩增。由于DOP-PCR的引物3′端设计的是在基因组中高频出现的序列，因此，在首轮的低严谨扩增条件下能与基因组多处退火，从而将基因组普遍扩增。然后下一轮的严谨扩增中又将低严谨扩增的产物再次放大［4］。与DOP-PCR不同的是，PEP-PCR的引物是由15个随机核苷酸组成的完全随机引物。PCR由50个循环组成，每个循环的退火温度都是由37℃连续升温至55℃，从而确保不同组成的引物与尽可能多的基因组序列退火，使整个基因组得到放大［5］。 二、全基因组扩增的质量控制 全基因组扩增的主要目的是在如实反映基因组原貌的基础上最大限度地增加DNA 量。因此，扩增效率和保真性是衡量全基因组扩增技术优劣的主要标准，此外，扩增片段的大小对于序列较长的基因片段分析来讲也是一个重要因素。 （一）扩增效率 DOP-PCR和PEP-PCR均能较大幅度地扩增模板DNA的量。据Cheung等［6］报道，DOP -PCR可将原模板扩大12至2万倍，而且，模板量越少，扩增倍数越高，这主要是由于
单细胞测序技术
单细胞测序技术 单细胞测序技术是一种能够在单细胞水平上对基因组或转录组进行高通量测序和分析的新技术。与传统的高通量测序相比，单细胞测序不仅可以分析相同表型细胞的异质性，还可以获得难培养微生物和有价值的临床样本的遗传信息，具有广阔的应用前景。 细胞是生命的单位。目前，基因检测主要是从组织中提取DNA进行测序。实验结果通常是细胞群体中信号的平均表达，是细胞群体的整体表征，或仅代表在数量上占优势的细胞信息。单个细胞的独特细胞特征往往被忽略。 大量研究发现，在同一器官或组织中，同一类型的细胞也表现出明显的异质性，而且每个细胞都有自己独特的表达模式。例如，实体肿瘤样本中超过一半的RNA来自非癌细胞(成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等)，这使得癌细胞的信号被隐藏。因此，不可能使用单个单元来表示关键信息。 另一方面，传统高通量测序方法，难以应用在对自然界中难培养的微生物的研究、罕见循环肿瘤细胞的转录组分析、胚胎发生最早期的分化特征研究、肿瘤的非均质性和微进化研究等精确程度较高的研究领域[1]。随着细胞分选和测序技术进步，单细胞测序技术应运而生。 （一）单细胞测序技术颇受关注 《Nature Methods》杂志将单细胞研究方法列为未来几年最值得关注的技术领域之一。《Science》杂志将单细胞测序列
为年度最值得关注的六大领域榜首。 （二）单细胞测序技术流程 1. 单细胞分离 针对单个细胞研究时，首先将单个细胞进行分离，并确保其生物完整性不被破坏。目前常用的单细胞分离方法有连续稀释法、显微操作法、激光捕获显微切割术、拉曼镊子技术、荧光激活细胞分选术和微流控技术等。 2. 细胞溶解与基因组获取 对细胞进行溶解来获取基因组（DNA或RNA），这步骤非常关键，应尽量保证基因组的完整性。目前细胞溶解的方法可以分为3大类: 物理法、化学法和生物酶降解法。 3. 全基因组扩增 由于单个细胞中的基因含量无法达到测序仪的检测线，因此需要对基因组进行扩增，目前方法都是利用DNA 聚合酶和不同形式的引物来进行扩增的，包括特异性的、简并的或杂合的引物。 4.测序与数据分析 对单个细胞进行测序，并对所得的数据结果进行分析。 二 单细胞测序技术应用现状 单细胞测序技术能够快速确定成千上万个细胞的精确基因表
藻类培养论文 牛浩
吉林化工学院 环境科学与工程专业 环境生物学设计性实验 院系:资源与环境工程学院 班级：环境科学与工程1301 姓名：牛浩 指导老师：邹继颖 学号：1310338102
天然藻类培养和应用 （吉林，吉林，吉林化工学院，牛浩，132022） 摘要：藻类植物是自然界中非常重要的一大类生物类群，它们不仅是用于科学研究的良好材料，在医药、食品、精细化工、环境保护、水产养殖等方面都有着广泛的应用，研究观察藻类不但有一定的理论意义，也具有重要的应用价值[1]。藻类应用技术在国内外一直是研究的热门，藻类大量培养技术是一切的基础。本实验重点探讨藻类培养的一般步骤和前景。 关键词：藻类；材料；应用价值；培养；前景 Natural algae cultivation and application (Jilin, Jilin, Jilin institute of chemical industry, NiuHao, 131022) Abstract:the algae is a very important categories of organisms in nature, they are not only used in scientific research of good material, in food, fine chemical, pharmaceutical, environmental protection, has been widely used in such aspects as aquaculture, algae research to observe not only has certain theoretical significance, also has important application value. Algae application technology at home and abroad has been a research hot, plenty of algae cultivation technology is the foundation of all things.This study focuses on the general steps of algae cultivation and prospect. Keywords:algae, materials, application value, cultivation,prospects 前言：多数的单细胞藻具有生长繁殖快、环境适应力强、培养周期短等特点。可实现在人工控制条件下大量培养获得高产的目[1]的而藻类中含有丰富的蛋白质、油脂、糖类、色素等可供人类利用，加之藻类本身适应环境的能力极强，繁殖速度快，占地面积小等优势使得藻类在解决资源枯竭、人口压力、环境污染等方面具有独特的优势。产油藻作为生物燃料的原料，成为可以满足不断增长的能源需求的一条解决途径；藻类提供的营养物质可以有效的缓解人口和土地方面的压力；在水环境方面，藻类可以用来净化水质，治理水体污染。 1.材料与方法 1.1实验用具 显微镜、显微图像采集系统、采集瓶、培养瓶、吸管、镊子、刀、标签、记
微电子技术及其发展
微电子技术及其发展 1200240227 杨晓东21世纪是高新技术时代的高速发展时期，随着科技不断进步与创新，电子行业逐渐占据重要地位。科学家们逐渐发现了微电子行业的巨大作用。那么什么是微电子呢？微电子在现代化进程中有哪些应用呢？它对一些科技发展是否起着不可或缺的作用呢？我们国家对于微电子的发展到了哪一步呢？国家又采用了什么政策呢？微电子是否和我们大学生青年息息相关呢？带着这些疑问，我们一同去探讨。 首先，到底什么是微电子呢？微电子学是研究在固体（主要是半导体）材料上构成的微小型化电路、电路及系统的电子学分支。尽管只是作为电子学的分支学科，它主要研究电子或离子在固体材料中的运动规律及其应用，并利用它实现信号处理功能的科学，以实现电路的系统和集成为目的，实用性强。微电子学又是信息领域的重要基础学科，在这一领域上，微电子学是研究并实现信息获取、传输、存储、处理和输出的科学，是研究信息获取的科学，构成了信息科学的基石，其发展直接影响着整个信息技术的发展。微电子科学技术的发展水平和产业规模是一个国家经济实力的重要标志。微电子学是一门综合性很强的边缘学科，其中包括了半导体器件物理、集成电路工艺和集成电路及系统的设计、测试等多方面的内容；涉及了固体物理学、量子力学、热力学与统计物理学、材料科学、电子线路、信号处理、计算机辅助设计、测试和加工、图论、化学等多个领域。 可见微电子是一门极其复杂的电子科学。因为其广泛的应用，近年来在军事科技，通信及太空探索等方面得到迅速发展。微电子技术是高科技和信息产业的核心技术。微电子产业是基础性产业，之所以发展得如此之快，除了技术本身对国民经济的巨大贡献之外，还与它极强的渗透性有关。另外，现代战争将是以集成电路为关键技术、以电子战和信息战为特点的高技术战争。几乎所有的传统产业只要与微电子技术结合，用集成电路芯片进行智能改造，就会使传统产业重新焕发青春。例如微机控制的数控机床己不再是传统的机床；又如汽车的电子化导致汽车工业的革命，目前先进的现代化汽车，其电子装备已占其总成本的70%。进入信息化社会，集成电路成为武器的-个组成单元，于是电子战、智能武器应
单细胞测序
单细胞测序-I 单细胞测序（single cell sequencing）被《自然-方法》（nature method）杂志评为了2013年度生物技术。2017年10月美国政府启动了以单细胞测序为基础的“人类细胞图谱计划”，这是可以与“人类基因组计划”相媲美的又一个伟大工程。 要了解单细胞测序，我们首先需要了解下何为测序？ “单细胞测序技术”是基于“第二代测序技术” 上世纪70年代末，Sanger发明了双脱氧链终止法也叫做Sanger测序法，Sanger测序法为基础的DNA测序技术我们把他称作“第一代测序技术”。“人类基因组计划”就是基于“第一代测序技术”完成的，共花费了30亿美元和耗时15年的时间。“第一代测序技术”成本高和低通量的问题，逐渐满足不了生命科学领域发展的需求。经过不断的技术开发和改进，以Illumina公司为代表的“第二代测序技术”大大降低了测序的成本并且大幅度提高了测序通量，所以也被称作“高通量测序技术”。 过去10几年“第二代测序技术”得到了快速发展，甚至突破“摩尔定律”的发展规律，如今完成一个人类的全基因组价格只需要1000美元和几个工作日。随着“第二代测序技术”的迅猛发展，使得对于每个细胞单独测序成为了可能。正是“第一代测序技术”的技术革命完成了“人类基因组计划”，同样的“第二代测序技术”掀起的技术革命正在推动着“人类细胞图谱计划”的进行。 当我们了解了“单细胞测序”就是以“二代测序技术”为基础的测序技术，那么下一步就需要了解下什么是细胞？为什么我们要进行单细胞测序？ 人体的每个细胞都是独一无二的 细胞是人体结构和功能的基本单位，每个人大约有40亿-60亿个独立的细胞。如果把一个人体全部细胞比作地球上的所有人类的话，那么我们的细胞就像地球上每个独立的个人，正如地球上的每个人都是独一无二的，人体的每个细胞也是独一无二的。人类生命最初只有一个受精卵细胞，从胚胎发育到个体成熟，人体内的细胞数量增加的同时，细胞与细胞间的差异也越来越大，即使来自同一个组织的细胞，最终有的分化成了神经元而有的细胞则变成了神经胶质细胞。单细胞测序技术就是通过测序技术获得不同细胞间的遗传信息，从基因遗传水平解开细胞与细胞间的遗传信息异质性问题。 根据上面的对介绍，我们可以对“单细胞测序技术”下一个定义：单细胞测序技术是通过“第二代测序技术”对每个单独的细胞进行测序，获取每个独立细胞的遗传信息。
单细胞藻类
单细胞藻类之--微绿球藻 微绿球藻（Nannochloropsis oculata），或叫眼状微绿球藻。本属还有其它几种培养作为水产动物的活饵料的。在分类上属于绿藻门，绿藻属，四胞藻目，胶球藻科。 一、形态特 征：细胞为 球形，直径 为2—4微 米，单独或 集合，色素 体一个，淡 绿色，侧生， 仅占着周 围的一部 分，眼点圆 形，淡橘红 色。在活泼 生长的情 况下，色素 体颜色很 深，不容易 观察到眼点，在氮缺乏的培养中，色素体变淡，眼点明显。没有蛋白核。有淀粉粒1—3个，明显，侧生。细胞壁极薄，幼年细胞看不到，在分裂之前才变得明显。分裂进行时，细胞壁扩大，与细胞之间形成空隙。 二、繁殖方式：微绿球藻进行二分裂繁殖，细胞分裂成为2个子细胞，细胞分裂后，子细胞由母细胞的细胞壁裂开处脱出，子细胞附着在细胞壁上，互相连结成为一个松散的树枝状群体。 三、生态条件： 1、盐度：微绿球藻对盐度的适应范围很广，在盐度为4—36的范围内均能正常生长繁殖，并可保养在2—54的盐度范围内。江西省宜春高新技术专利产品开发中心提供光合细菌培养基配方技术。 2、温度：微绿球藻在10--36℃的温度范围内都能比较迅速的繁殖，最适温度为25--30℃。 3、光照：在适温条件下，最适光照强度为10000勒克斯。 4、酸碱度：适宜的酸碱度范围为：PH7.5—8.5。 微绿球藻在有机质多，特别是氮肥多，氨盐丰富的水体中，生长特别繁茂。 单细胞藻类之--塔胞藻 塔胞藻（Pyramimonas sp.）分类上属于绿藻门，绿藻纲，团藻目，衣藻科，塔胞藻属。可以用于海湾扇贝幼体的饵料。 一、形态特征：单细胞，不具细胞壁，多数呈梨形、侧卵形，少数呈半球形。细胞长12—16
基因组步行法扩增3'及5'侧翼序列
一．原理 基因组步行技术是一种新发展的利用已知序列(cDNA或基因组DNA)从基因组中获得基因的上游(如启动子) 或下游序列的方法。 其原理如下：首先利用不同的具有平末端的 DNA 限制性内切酶消化基因组 DNA，然后将预先设计好的 DNA 接头连接在 DNA 的两端, 这样的一组两端带有接头的 DNA 片段就称为所谓的无载体的 DNA 文库；根据接头和目的基因的序列设计两组引物，以上述的DNA为模板，先以外侧的一组引物进行第一轮 TD-PCR ( touchdownPCR ) 扩增，然后以内侧的一组引物进行巢式 TD-PCR 扩增，扩增产物即为所需的DNA片段。在接头中，由于2条链中较短的一链的3’末端被 2NH2 封闭，使得引物 AP1 在第一次 PCR 之前没有结合位点，在 PCR 的第一循环过程中只能从 GSP1 延伸，没有 AP1 的延伸产物。而GSP1 的延伸产物产生了 AP1 的结合位点，在第二循环就开始从两端进行延伸反应。这样，就减少了非特异性扩增，从而提高了 PCR 的特异性.基因组步行由 2 轮 TD-PCR 反应组成。在 TD-PCR 的初始循环中，所采用的退火和延伸温度比引物的 Tm 值略高，在这种情况下引物退火的效率会下降，但是特异性将增加；另外，在极少数情况下接头的 2NH2 也会延伸，补平接头，这样也产生了 AP1 的结合位点，从而增加了非特异性扩增，但在高温下，接头的自我退火比引物与接头退火的效率高，就提高了针对于 AP1 的 PCR 抑制效应，减少非特异性扩增。在随后的循环中，退火和延伸温度比 Tm 值略低，有利于特异性产物的指数增长。基因组步行技术主要应用于一些只知部分 cDNA 序列的基因的启动子或其他上游调控序列的快速克隆，该技术也可用于确定内元/外元的连接以及从任何序列标签位点(Sequence2tagged site, STS) 或 EST 两端进行扩增获得相应的序列。尽管一次步行获得的片段长度短于 6 kb，但可通过多次反应获得更长的片段。该方法对于填补基因组中的一些间隙，特别是当这些缺失的克隆通过常规的筛选文库很难得到时非常有 一、高质量基因组DNA 的提取 1 材料 实验鱼，尾静脉取血100 μl(含抗凝剂) 2 试剂 QIAGEN Genomic 20/G；Tip Holders；Buffer C1；Buffer QBT；Buffer QF 抗凝剂 : 0.48%柠檬酸，1.32%柠檬酸钠，1.47%葡萄糖 3. 方法 1）样品的处理和裂解 (1) 将100μl鱼血用PBS稀释至1ml (2) 加入1倍体积冰冷的Buffer C1，3倍体积（3ml）的ddH O 。 2 (3) 翻转数次至悬冷液成半透明 (4) 冰浴10min。 (5) 4℃，1300g离心15min，弃上清液。 (6) 加入250μl冰冷的Buffer C1，750μl冰冷的ddH2O。 (7) 轻弹，溶解沉淀。 (8) 4℃，1300g离心15min，弃上清液（如沉淀不是白色，重复洗涤步骤）。 (9) 加入1ml Buffer G2，最大速漩涡10-30s，充分重悬核酸沉淀物（时间要控
光学膜简介
光学膜会议纪要 一、冰箱面板膜IMD膜 该膜为三层结构，将薄膜放入注射成型模腔内，使薄膜紧贴注射的塑料外面热熔合，形成光洁漂亮的面板。 二、隔热膜 对基膜的要求是高透光率和低雾度，涂布后绝对不能有划痕。在PET上涂布隔热涂层后贴在汽车窗和建筑玻璃上用于吸收、反射近红外线（波长600~2300纳米），起隔热防爆作用。 结构是36μm隔热膜和23μm离型膜，揭去离型膜后直接贴在玻璃上。 目前主要有两种技术路线： ⑴、干法：以美国3M为代表，先在PET薄膜表层涂防刮伤层，再真空溅射吸收、反射近红外线材料（共7种材料） ⑵、湿法：以美国龙膜为代表，将纳米分散的材料一次性涂在PET 薄膜上。主要成分氧化锆、氧化铟锡。 湿法是DOCRIV推销的技术。 DOCRIV在中恒合作生产了隔热膜PET基膜，雾度0.8%，在保定乐凯进行涂布，据DOCRIV介绍说隔热效果和美国龙膜效果相当。但存在的问题是①采用的是微凹版涂布，不能保证无划痕；②空气净化程度达不到要求。 热隔膜结构：
隔热防雾膜——既隔热又防雾 三、光学膜 1、IMO膜触摸屏膜 在PET薄膜表面涂布上抗划伤、抗静电（106~108Ω）涂层，背面真空溅射导电膜(共三层，且透明)，再在导电层上印刷电路，再蚀出多余的导电层。 目前IMO只用日本生产，技术封锁。对基膜的要求非常高，雾度≤1%，透光率≥92%，厚度平整性非常高，175μm，宽度125cm。 在基膜达不到要求下，可以用作液晶屏保护膜(不加导电层)。2、光扩散膜 主要功能是提升光线亮度，并将导光板射出之光线柔散化，提供均匀的面光源；通常做法是在PET基材上，涂布光学粒子颗粒/玻璃微珠。扩散膜是通过在光学膜片材料上的微细颗粒（beads）实现光的扩散。 扩散膜要求颗粒涂布均匀，颗粒不能脱落，目前合肥乐凯生产光扩散膜，但在颗粒脱落上还未很好解决。
单细胞测序技术概览
单细胞测序技术概览 2013年，单细胞测序技术开始成为科研界主流关注的焦点。 前言 2013年，单细胞测序技术（single-cell sequencing）荣膺《自然-方法》年度技术。单细胞测序技术有助于我们剖析细胞的异质性。它可以揭示肿瘤细胞基因组中发生的突变及结构性变异，而这些突变和变异往往有着极高的突变率。有了这些信息，我们就可以描述肿瘤细胞的克隆结构，并追踪疾病的进展及扩散范围。本文将介绍2013年单细胞测序技术在人类早期发育、癌症以及神经科学研究等几个重点领域的最新应用成果。 1. 单细胞测序技术简介 本节将概述如何获得一个单细胞的基因组及转录组。 单细胞基因组及转录组测序所需要的测序样本量要比单细胞中本身所含有的基因组及转录组分子高出好多个数量级，所以这对核酸扩增技术（amplification technology）也是一大考验。面对如此微量的分子，任何降解、样品损失、或者污染都会对测序质量带来非常严重的影响。而且多重扩增又容易带来试验误差，比如基因组或转录组覆盖不均一、背景噪声以及定量不准确等问题。 最近所取得的技术进步有望部分解决上述问题，使单细胞测序技术能够走进更多的实验室，解决更多领域的科学问题。比较罕见的细胞、异质性的样本、与遗传嵌合或突变相关的表型、不能人工培养的微生物，这些都是单细胞测序技术能够一展所长的研究平台。使用单细胞测序技术能够发现克隆突变（clonal mutation）、隐藏的细胞类型，或者在大块组织样品研究工作中被―稀释‖或平均掉的转录特征。
1.1 选择恰当的细胞 说到分离单细胞，显微操作（micromanipulation）无疑是一项非常精确的技术，而且利用毛细管（microcapillary）可以直接吸取细胞内容物，但是这项操作也需要耗费大量人力。很多组织解离之后都能够制成单细胞悬液，这种单细胞悬液很容易操作，而且可以用细胞分选器（cellsorter），根据细胞表面表达的特异性分子标志物对细胞进行分类富集操作。这种策略也被用来分离非常微量的循环肿瘤细胞。 1.2 单细胞转录组策略 现在有很多单细胞RNA测序操作流程可供选择，不过不管采用何种策略，首先都需要通过逆转录反应，利用RNA合成出cDNA。然后才会有所区别，比如有一些方法是对整个转录子进行测序，有一些方法只针对转录子的5'和3'端进行测序。不论采用何种方法，目的都只有一个，那就是捕获原始的RNA分子，然后均一的、准确地对其进行扩增。核酸的捕获效率主要受到逆转录反应的影响，不过我们可以使用更小的反应体系，选择更好的逆转录酶来进行改善。另外，采用模板转换技术（template switching）也能够保证被捕获的绝大部分转录子都是全长片段。减少反应循环数也能够改善核酸扩增反应，还可以借助―抑制PCR （suppression PCR）‖技术减少引物扩增，或者将取自不同样品的cDNA（这些cDNA都是分别做好标记的）混合到一起，提高起始反应模板浓度，用体外转录技术进行线性扩增（linear amplification）。另外，还可以利用特有的分子识别序列（molecular identifier sequences）对每一个RNA分子进行标记，这样即便在经历了非均一的扩增之后，我们还是能够对原始的RNA分子数量进行绝对定量。 1.3 单细胞基因组策略 全基因组扩增（whol e-genome amplification）的起始反应产物更少，只有一个DNA分子。这样在扩增反应时就难免出现不均一的问题，即可能在基因组中某些位点会扩增多次，而另外一些位点则无法扩增。解决这个问题最常用的办法就是多重置换扩增技术（multiple displacement amplification, MDA），即使用随机引物，让这些引物与基因组广泛结合，同时使用一种特定的聚合酶，这种聚合酶能够置换与它自身附着在同一模板上的DNA链片段，形成一种反复分支结构（iterative branching structure），扩增出大段的DNA。早期循环对整个扩增反应的均一性起到了决定性作用。有一种扩增技术采用了一种独特的引物，这样能够生成闭合环状的扩增子（amplicon），而且这种扩增产物不会再进一步复制，等于是在进行PCR扩增反应之前先进行几轮线性扩增反应。将反应按比例扩大，同时对反应情况进行实时监控都有助于改善基因组扩增成功率低的问题，另外减少扩增次数，准备更少模板的测序文库也是一个比较值得发展的方向。
全基因组扩增技术
全基因组扩增(whole gemome amplification，WGA)是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增 的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。其基本原理为：采用 的多重置换扩增（MDA）技术，能对基因组DNA进行稳定的扩增。利用随机六碱基引物在多 个位点与模板DNA退火，接下来在高扩增效率和保真性的Phi29 DNA聚合酶在DNA的多个位 点同时起始复制，它沿着DNA模板合成DNA,同时取代模板的互补链。被置换的互补链又成为 新的模板来进行扩增，因此最终我们可以获得大量高分子量的DNA。 全基因扩增中使用独特的Phi 29 DNA聚合酶，该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100Kb的DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’—5’外切酶活性，可以保证扩增的高保真性。目前市场上普遍采用Qiagen公司的Repli-g Mini Kit 系列全基因组试剂盒。本试剂盒的开发对国内用于全基因扩增领域有着广泛的应用前景。 可以从少量样本中稳定扩增全基因组DNA。该试剂盒的开发过程包括分离和扩增DNA的试剂，适用的样本广泛，包括已纯化的基因组DNA、全血、组织培养细胞、显微切割得到的细胞、速冻的组织切片、血浆血清中的细胞、口腔细胞、血斑。具有以下特点： 1.产物应用途径广阔 PCR（包括多重PCR、长片段PCR以及定量PCR）、克隆、文库构建、单倍型确定、测序、基 因芯片、遗传分析（片段差异、微卫星差异、单碱基差异、SNP、STR等）。 2、高产量 10ng基因组DNA经扩增后可产生〉15ug（20ul反应体系）的DNA反应产物，扩增倍数可达上 万倍。 3、扩增产物长度以及覆盖率有保证 这是我们公司全基因组扩增技术（多重置换扩增技术），这不是一个PCR过程。目前这个 技术比较流行，之前的技术已经有些过时。我们试剂盒里的BUFFER已经包含了引物，客 户无需另外购买。
单细胞测序技术
单细胞测序技术： 单细胞测序技术自2009年问世，2013年被Nature Methods 评为年度技术以来，越来越多地被应用在科研领域。 2015年以来，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技术的出现，彻底降低了单细胞测序的成本门槛。 自此，单细胞测序技术被广泛应用于基础科研和临床研究。单细胞在许多领域都占有一席之地，对于癌症早期的诊断、追踪以及个体化治疗具有重要意义。 1 为什么要做单细胞测序？ 初次听说单细胞测序技术，单细胞测序又是什么噱头？如果单细胞测序就能测一个细胞或几个细胞的话，这有什么意义？特别是对异质性高的肿瘤组织来讲，测一个细胞能代表什么？ 无论是蠕虫，蓝鲸，还是人类，自然界所有的多细胞生命都是从单个细胞发育而来开始。 这样一个单细胞，鬼斧神工地构建出有机生命体所需的各种组织、器官、系统。每个新细胞在正确的时间，在正确的地方分裂、分化，并与相邻细胞协调精准发挥功能。 多细胞生命的发育过程，是自然界中最引人注目的壮举之一。尽管经过数十年的研究，生物学家仍然无法完全理解这一过程。 2018年4月26日，Science杂志发表三篇超重磅研究，来自哈佛医学院和哈佛大学的研究人员使用多种技术组合，包括对发育中
斑马鱼和青蛙胚胎数千个单细胞的基因测序，以精确的方式跟踪和描绘了组织和整个机体从单细胞发育的完整历程。 哈佛大学分子和细胞生物学教授Alexander Schier表示，“这几乎就像通过几颗星星看到了整个宇宙。” 使用单细胞测序技术，研究团队在胚胎发育的最初24小时内追踪单个细胞的命运，揭示出单个细胞基因开启或关闭的综合景观，以及胚胎细胞何时何地转变为新的细胞状态和类型。 这些发现就好比是勾勒出胚胎发育过程中产生不同细胞类型的遗传“配方”目录，为发育生物学的深入研究和疾病的认识，提供了前所未有的资源。 图|斑马鱼受精卵在4、6、8、10......小时（hpf）时的发育过程中不同器官细胞形成，最中心的深蓝色为受精卵，以时间为单位向外辐射。 “通过单细胞测序，我们可以在一天的时间里概括数十年来对细胞在生命早期阶段分化的艰苦研究。”哈佛医学院系统生物学助理教授Allon Klein表示，“通过我们开发的方法，我们正在绘制我们认为发育生物学的未来，发育生物学将会转变为定量的、大数据驱动的科学。” Alexander Schier表示，除了对生命早期阶段有所了解之外，这项工作还可以为大量疾病的新认识打开大门。“我们预见，任何复杂的生物学过程，只要是细胞随时间改变了基因表达，都可以使用这种方法重建，不仅仅是发育中的胚胎，还有癌症发生或大脑退化。”
绿藻栅藻培养
绿藻栅藻培养 藻类，特别是单细胞藻类的营养丰富，含有动物和人生长发育所必需的营养物质。自上世纪四十年代以来,各国学者都试图用藻类这一资源解决人类食物和动物饵料的缺乏问题。另一方面，藻类可直接或间接的作为鱼类及其他水生动物的饵料。 1 藻类的培养方式 藻类的培养方式，以藻类培养的目的要求而各种各样。但可分为密闭式培养和开放式培养两大类。 1.1密闭式培养 密闭式培养的目的是不使外界杂藻、菌类及其他有机体混入培养物中。将培养液密封在与外界完全隔离的透明容器中，由此通气，搅拌，输送培养液及调节水温和取样等设备，也都要与外界隔离。培养容器多为管状，也有池状，用有机玻璃或透明的聚乙烯所料做成水平管道，直立或斜立在地上，暴露阳光或人工光照下。这种培养方式，成本高，好控制，产量亦稳定。 1.2开放式培养 将藻类培养于敞开的容器(如水泥池、管道、木盆等)中。方法设备较简便，可进行小量或大面积的培养。该法培养物中易发生敌害生物污染，但成本低，使用较普遍，也是今后藻类培养所应采取的方式。开放式可分如下几种类型： (1) 开放循环培养：其特点式培养液借助循环水泵而不断循环流动。培养物能循环，就可省却搅拌工作。 (2) 开放非循环培养：其特点是培养液不循环流动，而定时由小管通入CO2和空气到培养液中；同时也起搅拌作用。此法在大面积培养中使用较普遍。优点是设备简单，无需动力，水泵及大量的CO2及通气设备。 (3) 半开放循环培养：半开放培养是指培养容器或池，槽等场所虽仍敞开，但有些部分密闭，或用塑料布覆盖。这种培养方式，利用管道，依靠动力，使培
养液流动和通入含二氧化碳的空气。该方式设备复杂，但效果较好。 2 藻种的分离 为了要进行某种藻类的科学研究活大量培养，有必要把某种藻类与其他生物分离。分离培养藻种，可分为两大类，一为单种培养，即藻类虽只有一种，但还混杂细菌。另一为纯培养，即不仅藻类只有一种，亦无其它任何生物。纯培养比较困难，一般的分离培养往往只能做到单种培养。 主要根据培养的目的要求，及某一种类的生物学特征。藻类的分离主要有以下几种常用方法。 2.1 离心法 将混合液用离心机离心，水中不同藻体及细菌就以不同的速度下沉，因此得以分开。这样将不同时间下从导管底的藻体取出，经镜检选定某种藻类最多的沉积物，再加清水，继续离心，如此反复就可得到比较单纯的藻体，在接种相应培养液中培养。该法可消除细菌，并增加纯粹分离的可能性，至少可作为藻种平板培养的准备工作。另外，在水液中藻体含量较少时，可用此法集中藻体。但此法不能做到使不同藻类完全分离。 2.2 稀释法 该方法用已消毒试管5只，在第一管盛蒸馏水10mL，第2～5管都装5mL，用高压蒸汽消毒，待冷却后，第1管用滴管滴入混合藻液1～2滴，充分振荡，使均匀稀释。每次用消毒吸管，从第1管中吸取5mL滴入第二管中如前振荡，使均匀稀释。以后依次同样滴入第3～5 管，并都充分均匀稀释。然后把五个已盛又消毒的琼胶培养基培养皿，加热使之溶解，待冷却而尚未凝固时，分别滴入五个试管的藻液各一滴，用力振荡，使藻液充分混乳培养基中。待冷凝后，把五个培养皿放在受着漫射光窗口，一直到出现藻群时为止，在20℃左右时，约10天即出现藻群。用消过毒的白金丝取些藻群，进行琼胶固体培养基的不通气培养。此过程反复多次，直至得到完全分离的纯藻种群为止。此法稀释要使用较多容器分组培养，比较麻烦，但较易成功。
你该知道的微电子技术知识
你该知道的微电子技术知识 二大爷公司笨笨收集 微电子技术是十九世纪末,二十世纪初开始发展起来的以半导体集成电路为核心的高新电子技术,它在二十世纪迅速发展,成为近代科技的一门重要学科。微电子技术作为电子信息产业的基础和心脏,对航天航空技术、遥测传感技术、通讯技术、计算机技术、网络技术及家用电器产业的发展产生直接而深远的影响。尤其是微电子技术是军用高技术的核心和基础。军用高技术的迅猛发展，武器装备的巨大变革，在某种意义来说就是微电子技术迅猛发展和广泛应用的结果。微电子技术的渗透性最强，对国民经济和现代科学技术发展起着巨大的推动作用，其发展水平和发展规模已成为衡量一个国家军事、经济实力和技术进步的重要标志。正因为如此、世界各国都把微电子技术作为最要害的技术列在高技术的首位，使其成为争夺技术优势的最重要的领域。 一、基本概念 简介：微电子技术是随着集成电路,尤其是超大规模集成电路而发展起来的一门新的技术。它包括系统电路设计、器件物理、工艺技术、材料制备、自动测试以及封装、组装等一系列专门的技术,是微电子学中的各项工艺技术的总和。微电子技术是在电子电路和系统的超小型化和微型化过程中逐渐形成和发展起来的,其核心是集成电路,即通过一定的加工工艺,将晶体管、二极管等有源器件和电阻、电容等无源器件,按照一定的电路互联,采用微细加工工艺,集成在一块半导体单晶片(如硅和砷化镓)上,并封装在一个外壳内,执行特定电路或系统功能。与传统电子技术相比,其主要特征是器件和电路的微小型化。它把电路系统设计和制造工艺精密结合起来,适合进行大规模的批量生产,因而成本低,可靠性高。
图1 微电子技术中元器件发展演变 特点：微电子技术当前发展的一个鲜明特点就是：系统级芯片（System On Chip，简称SOC）概念的出现。在集成电路（IC）发展初期，电路都从器件的物理版图设计入手，后来出现了IC单元库，使用IC设计从器件级进入到逻辑级，这样的设计思路使大批电路和逻辑设计师可以直接参与IC设计，极大的推动了IC产业的发展。由于IC设计与工艺技术水平不断提高，集成电路规模越来越大，复杂程度越来越高，已经可以将整个系统集成为一个芯片。正是在需求牵引和技术推动的双重作用下，出现了将整个系统集成在一个IC芯片上的系统级芯片的概念。其进一步发展，可以将各种物理的、化学的和生物的敏感器（执行信息获取功能）和执行器与信息处理系统集成在一起，从而完成从信息获取、处理、存储、传输到执行的系统功能，这是一个更广义上的系统集成芯片。很多研究表明，与由IC组成的系统相比，由于SOC设计能够综合并全盘考虑整个系统的各种情况，可以在同样的工艺技术条件下实现更高性能的系统指标。微电子技术从IC 向SOC转变不仅是一种概念上的突破，同时也是信息技术发展的必然结果。目前，SOC技术已经崭露头角，21世纪将是SOC技术真正快速发展的时期。 微电子技术的另一个显着特点就是其强大的生命力，它源于可以低成本、大批量地生产出具有高可靠性和高精度的微电子结构模块。这种技术一旦与其他学科相结合，便会诞生出一系列崭新的学科和重大的经济增长点。作为与微电子技术成功结合的典型例子便是MEMS（微电子机械系统或称微机电系统）技术和生物芯片等。前者是微电子技术与机械、光学等领域结合而诞生的，后者则是与生物工程技术结合的产物。 应用领域：
20170301CTC单细胞mRNA测序技术路线
CTC单细胞mRNA测序技术路线 从这里之后的数据分析部分都没有哦~ 单细胞转录组mRNA测序 一、技术简介 单细胞转录组是指某个细胞在某一生理功能状态下所有转录的mRNA产物的集合，是基因组遗传信息传递和表达的重要步骤和过程。 单细胞转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一单个细胞在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。 转录组测序针对的是有参考基因组的物种。与参考基因组比较，可以得到基因表达差异、可变剪接、融合基因等遗传调控信息。 二、MALBAC技术 1.运用Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles, MALBAC多重退火环状循环 扩增技术，精确反转录某一单个细胞在某一状态下的几乎所有转录本序列信息mRNA并进行扩增。 解决了扩增对微量初始模板过大的扩增偏移，使得单细胞中90%的基因组能够被测序，样品起始量可低至0.5pg； 2.无物种的限定；要求mRNA有Poly A尾结构，GC％为35％-65％。 3.分辨率高：单碱基分辨率； 4.覆盖度高：能覆盖到几乎所有转录本片段序列；
5.检测范围广：从几个到数十万个拷贝精确计数，可同时鉴定及定量正常和稀有转录本； 三、技术参数 1.样品要求 样品类型：已分离的单细胞样本或去蛋白并进行DNase处理后的完整Total RNA； 样品需求量（单次）：使用MALBAC进行微量扩增，样品建议为单细胞或总量≥10pg，最低起始量≥0.5pg； 2.测序策略 PE151。 推荐数据量 6G clean data以上。 3.项目执行周期 每个样品数据量6G以下，样品量小于10个，标准流程的执行周期约为50 个工作日； 样品数量多于10个时，项目的执行周期需根据项目的规模而定。 4.项目合格指标 产生不低于合同规定的clean data。 四、主要技术流程 单细胞裂解-MALBAC扩增-文库构建-高通量测序-数据处理-生物信息分析 五、信息分析 标准信息分析： 1.对原始数据去除接头序列、污染序列及低质量reads； 2.测序数据统计； 3.对于有参考基因组的转录组分析，须明确具体物种，因为即使有参考，很多物种SNP或Indel等注 释信息也不像人的那么全、那么规范。生物信息部需确定特定物种的某些分析是否可做。 单细胞转录组建库其实是：单细胞转录组扩增+基因组建库（扩增后产物是DNA）。单细胞不能做链特异性转录组测序。
单细胞测序
第一章单细胞测序技术概览 摘要: 2013年，单细胞测序技术开始成为科研界主流关注的焦点。前言2013年，单细胞测序技术（single-cell sequencing） 荣膺《自然-方法》年度技术。单细胞测序技术有助于我们剖析细胞的异质性。它可以揭示肿瘤细胞基因组中... 2013年，单细胞测序技术开始成为科研界主流关注的焦点。 前言 2013年，单细胞测序技术（single-cell sequencing）荣膺《自然-方法》年度技术。单细胞测序技术有助于我们剖析细胞的异质性。它可以揭示肿瘤细胞基因组中发生的突变及结构性变异，而这些突变和变异往往有着极高的突变率。有了这些信息，我们就可以描述肿瘤细胞的克隆结构，并追踪疾病的进展及扩散范围。本文将介绍2013年单细胞测序技术在人类早期发育、癌症以及神经科学研究等几个重点领域的最新应用成果。 1. 单细胞测序技术简介 本节将概述如何获得一个单细胞的基因组及转录组。 单细胞基因组及转录组测序所需要的测序样本量要比单细胞中本身所含有的基因组及转录组分子高出好多个数量级，所以这对核酸扩增技术（amplification technology）也是一大考验。面对如此微量的分子，任何降解、样品损失、或者污染都会对测序质量带来非常严重的影响。而且多重扩增又容易带来试验误差，比如基因组或转录组覆盖不均一、背景噪声以及定量不准确等问题。 最近所取得的技术进步有望部分解决上述问题，使单细胞测序技术能够走进更多的实验室，解决更多领域的科学问题。比较罕见的细胞、异质性的样本、与遗传嵌合或突变相关的表型、不能人工培养的微生物，这些都是单细胞测序技术能够一展所长的研究平台。使用单细胞测序技术能够发现克隆突变（clonal mutation）、隐藏的细胞类型，或者在大块组织样品研究工作中被―稀释‖或平均掉的转录特征。 1.1 选择恰当的细胞 说到分离单细胞，显微操作（micromanipulation）无疑是一项非常精确的技术，而且利用
单细胞藻类的培养
第六章单细胞藻类的培养 一、名词解释 1，生物饵料2，纯培养3，单种培养4，混合培养5，开放式培养 6，封闭式培养7，饱和光照强度8，补偿光照强度 9，一次性培养10，半连续培养11，连续培养 12，一级培养13，二级培养14，三级培养 15，倍增时间 二，选择题 1，下列哪种藻的最佳培养条件为高温、强光和强碱性？ A．钝顶螺旋藻B．湛江等鞭金藻C．中肋骨条藻D．小球藻 2，下列哪种藻是目前单细胞藻类中产业化程度最高的一个微藻？ A．微绿球藻B．等鞭金藻C．三角褐指藻D．钝顶螺旋藻 3，下列哪些金属元素为藻类生长繁殖必须的常量元素？ A．K，Mg，Zn B．K，Mg，Fe C．Mg，Fe，Cu D．K，Cu，Zn 4，实验室小型培养单胞藻，海水的消毒通常采用下列哪种方法？（C） A．烘箱干燥消毒B．有效氯消毒C．煮沸消毒D．高锰酸钾消毒 5，下列哪种藻类具有厚的细胞壁，一般不直接作为饵料投喂？ A．小球藻B．湛江等鞭金藻C．角毛藻D．微绿球藻 6，下列哪种藻类的形态随培养条件的改变会发生明显的变化？ A．小球藻B．三角褐指藻C．中肋骨条藻D．巴夫藻 7，下列哪种藻类的最佳培养生态和应用途径与三角褐指藻相似？ A．亚心形扁藻B．等鞭金藻C．小新月菱形藻D．巴夫藻 8，下列哪种藻类主要用作鲍鱼育苗中匍匐幼虫和稚鲍的饵料？ A．亚心形扁藻B．等鞭金藻C．小新月菱形藻D．舟形藻 9，藻类培养过程中，一般选择在什么时间接种？ A．清晨5~8点B．上午8~10点C．下午4~6点D．晚上 10，按接种后藻液中藻细胞浓度算，金藻和硅藻的接种密度最好应控制在什么浓度？ A．在500万细胞/毫升以上B．在10万细胞/毫升以上 C．在100万细胞/毫升以上D．在50万细胞/毫升以上 11，标准的血球计数板盖上盖玻片后，一个中央大格所在区域的体积是 A．1mm3B．10mm3C．0.1mm3D．0.1mL 12，单细胞藻类培养池的设计上要求： A．面积相对小，池子浅，光照充足，最好内壁贴白色瓷砖 B．面积相对大，池子深，光照充足，最好内壁贴白色瓷砖 C．面积相对小，池子深，光照充足，最好内壁贴白色瓷砖 D．面积相对大，池子浅，光照充足，最好内壁贴白色瓷砖 13，下列哪种藻类在南方甲壳动物育苗中广泛应用？ A．亚心形扁藻B．中肋骨条藻C．小新月菱形藻D．三角褐指藻 14，在藻类培养中，充气可促进藻类生长。但为了预防敌害生物通过空气污染藻液，空气在注入藻液之前最好经过洗气装置，下列哪种溶液最适宜作为洗液？ A．氢氧化钠溶液B．次氯酸钠溶液C．硫酸铜溶液D．盐酸溶液 15，不同的光波长，对同一种藻类的生长效能的影响不同。三角褐指藻在哪种色光下生长最