MALBAC单细胞扩增技术简介
单细胞测序新技术-MALBAC简介
随着第二代测序平台的大规模普及，人类单倍型计划、千人基因组计划、癌症基因组计划、Meta-Hit计划等重大国际合作项目相继开展，将基因组研究日渐推向高潮。
然而，迄今为止使用的测序材料无一例外都是大量细胞的混合DNA样本。
一方面，在微生物生态学、癌症基因组、法医学、微量诊断、遗传印记等研究中，显然无法满足测序的mg级样品量需求；另一方面，细胞之间存在很大的异质性，对群体样品或混合样品进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息。
而单细胞全基因组扩增技术为解决以上难题打开了一扇崭新的大门。
全基因组扩增（Whole Genome Amplification, WGA）技术是一种对全部基因组序列进行非选择性、均匀扩增的技术，其目的是在没有序列偏向性的前提下大幅增加DNA的总量。
常用的WGA技术主要分为两种类型：
1.基于热循环以PCR为基础的WGA技术,如简并寡核苷酸引物PCR (Degenerate oligonucleotide primer PCR, DOP-PCR)、连接反应介导的PCR (ligation mediated PCR, LM-PCR)、扩增前引物延伸反应(Primer extension preamplification, PEP)等；
2.基于等温反应不以PCR为基础的WGA技术，如多重置换扩增(Multiple displacement amplification, MDA) 和基于引物酶的全基因组扩增(Primase-based whole genome amplification, pWGA)。
上述技术可以对少量样品进行扩增，但对于极微量样品进行全基因组扩增时往往会产生非特异的扩增假象，影响实验结果。
为此，亿康基因（/）基于哈佛大学谢晓亮院士研究组研发的一项专利技术——多次退火环状循环扩增技术（Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles,简称MALBAC）推出了单细胞全基因组/转录组测序服务，解决了基因组扩增对微量初始模板过大的扩增偏倚，使基因组测序的模板需求量从µg级降至单细胞水平。
该技术及其在研究人类精子重组方面的独特应用已在顶级科学期刊《Science》公开发表。
单细胞测序新技术—MALBAC技术：
C. Zong*, S. Lu*, A.R. Chapman*, X.S. Xie Genome-Wide Detection of Single Nucleotide and Copy Number Variations of a Single Human Cell Science .338:1622 (2012)
/content/338/6114/1622.abstract /
使用MALBAC技术首次绘制高覆盖度单精子基因图谱：
S. Lu*, C. Zong*, W.Fan*, M. Yang*, et al., Probing Meiotic Recombination and Aneuploidy of Single Sperm Cells by Whole Genome Sequencing using MALBAC Science. 338:1627 (2012) /content/338/6114/1627.abstract /。
malbac技术原理
malbac技术原理MALBAC技术，即多重位点扩增基因组单细胞测序技术，是一种单细胞测序技术，可以将单个细胞的基因组DNA进行扩增和测序，从而实现单细胞基因组测序的目的。
它的原理可以分为以下几个步骤。
第一步：单细胞分离MALBAC技术的第一步是将单个细胞分离出来，可以采用常规的离心分离、粘贴分离或者微流控芯片分离的方法。
分离出来的单细胞需要进行后续的扩增和测序。
第二步：整体细胞溶解和逆转录将单细胞放入含有整体细胞裂解缓冲液的96孔板中，同时加入逆转录酶和随机引物进行逆转录反应。
整体细胞裂解缓冲液和随机引物的作用是获得来自单细胞不同位点的DNA模板。
第三步：MARS-MALBAC扩增MARS-MALBAC是MALBAC技术的关键步骤，它可以扩增单个细胞的全基因组DNA。
MARS-MALBAC包括：首先，将逆转录反应得到的cDNA进行首轮线性扩增，并加入含有一定比例略微含有错误的引物；第二，将首轮扩增产物作为后续扩增的模板，进行数轮指数扩增，以产生大量cDNA；最后，进行线性扩增，得到适量的扩增产物。
第四步：测序最后，对MARS-MALBAC扩增产物进行测序，得到单细胞基因组DNA的序列信息。
这个过程中需要将扩增产物用PCR产物纯化试剂进行纯化，去除空间和杂质的DNA，并进行校验、定量、文库构建和测序。
综上所述，MALBAC技术的原理基于MARS-MALBAC扩增法，其主要思想在于通过多次扩增，产生足够的扩增产物，并引入略微有误的引物，减少扩增的偏好性，并避免某些基因组区域的扩增优先。
通过MALBAC技术，可以对单个细胞的基因组进行全基因组扩增和测序，为单细胞研究提供了有力的工具。
世界首例MALBAC试管婴儿诞生,亿康基因提供PGD检测
世界首例MALBAC试管婴儿诞生，亿康基因提供PGD检测2014年9月19日，世界首例经MALBAC（multiple annealing and looping-based amplification cycles，是目前最先进的单细胞全基因组扩增技术）基因组扩增高通量测序进行单基因遗传病和染色体异常同时筛查的试管婴儿在北京大学第三医院诞生，这标志着我国胚胎植入前遗传诊断（PGD）技术已处于世界领先水平。
其中的PGD检测由亿康基因完成。
图为研究人员与MALBAC新生儿合影婴儿的父母，男方为单基因显性遗传病患者，经历了多次手术治疗，非常痛苦。
该疾病主要是因为基因序列上发生了单个碱基的缺失，后代中无论男孩女孩都有二分之一概率患同样的疾病。
为了能够拥有一个健康的宝宝，夫妻二人2013年5月来到北医三院生殖医学中心就诊，期望通过胚胎基因诊断，帮助他们挑选正常胚胎，不要让自己的孩子也患上同样的疾病。
通过辅助生殖技术，首先获得了18枚质量好的胚胎。
研究人员随后利用显微操作技术从中获得极少量细胞，采用合作单位亿康基因的MALBAC单细胞基因组扩增技术，将这些极少量胚胎细胞中的DNA均匀扩增上百万倍以满足基因分析的需求。
然后采用高通量测序技术，经低深度测序，检测基因突变，同时观察全部染色体数目及结构是否异常。
最后，北医三院研究人员根据亿康基因提供的PGD检测报告，发现这18枚胚胎中只有3枚既不包含致病位点又不包含新发现的突变位点，同时染色体正常的胚胎。
2013年12月29日，3枚胚胎中质量最好的1枚，被移植到女方子宫内，胚胎成功着床，发育正常。
经羊水细胞基因验证，染色体以及该遗传病基因均正常，2014年9月19日，顺利分娩。
婴儿体重4030克，身长53厘米。
随后的脐血基因检测再次证实，婴儿不含致病位点。
借助胚胎植入前遗传学诊断，夫妻二人终于拥有了一个健康的宝宝。
胚胎植入前遗传诊断（PGD）是一种更早期的产前诊断技术，是指在体外受精过程中对有遗传风险的胚胎进行遗传学分析，选择基因正常的胚胎移入宫腔，对预防单基因遗传病的发生和传递具有重要的科学及社会意义。
单细胞全基因组扩增技术
单细胞全基因组扩增技术全基因组扩增技术（whole genome amplification，WGA）是一种对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA 的总量。
WGA主要有以下几种类型：1、DOP-PCR简并寡核苷酸引物PCR（degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR）是一种基于PCR技术的全基因扩增方法。
主要原理使用部分简并寡核苷酸引物进行PCR反应（引物中间含6个随机碱基），首先使用较低的温度（～25℃）进行退火，随后再缓慢升温至引物延伸温度进行引物延伸，完成最初几个循环后，再使用较高的退火温度（～55℃）进行多循环常规PCR 反应，从而实现对全基因组的扩增。
优点：•操作简单。
•产物产量较高。
缺点：•起始模板量低时，扩增偏差大。
•引物与模板间的不确定性以及引物间的相互作用均可能导致较低的全扩增灵敏度及较高的错误率。
•聚合酶及引物浓度需要进行优化。
2、LM-PCR连接反应介导的PCR（ligation mediated PRC，LM-PRCR）指的是有接头连接过程参与的PCR反应。
主要步骤1.模板DNA的片段化处理：物理剪切或限制性内切酶处理使DNA裂解成小片段。
2.模板片段与接头连接：根据酶切片段类型设计可与之连接的接头，在DNA连接酶的作用下，与模板片段两端连接，接头中含有一段外源通用引物序列，用作下一步PCR反应中的引物。
3.全扩增PCR反应：连接成功的模板片段经引物延伸后两端形成了通用引物结合位点，因此可以外源引入的通用引物进行PCR反应，包括接头在内的模板片段可同时得到扩增。
优点•灵敏度高。
•使用通用引物扩增均匀。
•产物产量高。
•对模板DNA质和量要求低。
缺点•操作繁琐。
•多步操作易丢失模板DNA。
3、PEPPEP扩增前引物延伸反应（primer extension pre-ampification，PEP）是基于PCR 技术发展而来的全基因扩增方法。
不同单细胞全基因组扩增方法的比较及MALBAC在辅助生殖中的应用
Hereditas (Beijing) 2018年8月, 40(8): 620―631 收稿日期: 2018-04-07; 修回日期: 2018-06-09基金项目:国家自然科学基金项目(编号：31772580，31472078)，国家肉羊产业技术体系专项(编号：CARS-38)，中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(编号：Y2017JC24)，中国农业科学院科技创新工程(编号：ASTIP-IAS13)，农业科研杰出人才及其创新团队项目和国家万人计划科技创新领军人才项目资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31772580, 31472078), Earmarked Fund for China Agriculture Research System (No. CARS-38), Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund (No. Y2017JC24), Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (No. ASTIP-IAS13), China Agricultural Scientific Research Outstanding Talents and Their Innovative Teams Program, China High-level Talents Special Support Plan Scientific and Technological Innovation LeadingTalents Program]作者简介: 姚雅馨，博士，助理研究员，研究方向：动物遗传育种。
E-mail: yaoyaxin0602@喇永富，博士研究生，专业方向：动物遗传育种。
单细胞测序,你为何如此令人痴迷？
单细胞测序 ,你为何如此令人痴迷？最近几年 ,关于单细胞测序的报道日益增多。
事实上 ,单细胞测序是一个新兴的领域。
据了解 ,单细胞测序萌芽于2019年 ,2019年是单细胞基因组学突飞猛进的一年。
2019年谢晓亮教授哈佛大学课题组与北京大学BIOPIC李瑞强研究员小组合作 ,将创立的MALBAC技术应用于人类单个精子基因组的测序研究中。
2019年12月10日 ,解放军总医院诞生了一对特殊的双胞胎—国内首例应用单细胞扩增技术〔MALBAC〕同时进行PGD/PGS 阻断了遗传性耳聋的健康双胞胎。
单细胞测序分为单细胞转录组测序和单细胞基因组测序。
单细胞转录组测序分为：单细胞DGE、单细胞polyA测序、单细胞lncRNA测序。
单细胞基因组测序分为：单细胞外显子组测序和单细胞全基因组重测序。
单细胞开展的历史据了解 ,1990年 ,NormanIscove的课题组首次证实对单细胞进行转录组分析是可行的 ,他们用PCR技术实现了对cDNA分子的指数级扩增。
2019年7月 ,来自斯坦福大学的StephenQuake在Cell上发表了一篇文章?Genome-wideSingle-CellAnalysisofRecombinationActivityandDeNo voMutationRatesinHumanSperm? ,研究采用单细胞测序的方法 ,测定了来自一项研究的100个精子的重组率 ,发现了许多新的重组热点和与间接方法发现的相一致的比率。
同年 ,纽约冷泉港实验室的研究生TimourBaslan 正利用单细胞技术来研究癌细胞。
2019年1月?自然—方法学?〔NatureMethods〕上发表年度特别报道 ,将“单细胞测序〞〔Singledoutforsequencing〕的应用列为2019年度最重要的方法学进展。
2019基因组学前沿研讨会将单细胞组学单独列为一个单元 ,可见单细胞测序在当前基因组学前沿研究中的热度。
简述单细胞抗体基因扩增技术
简述单细胞抗体基因扩增技术
单细胞抗体基因扩增技术是一种将单个B细胞的抗体基因扩增和分析的方法，可以用来研究单个B细胞的抗体多样性和功能。
该技术主要包括以下步骤：
1. 单细胞分离：将单个B细胞分离到单个孔中，可以通过细胞分选技术（如流式细胞术）或微流控芯片实现。
2. 抗体基因扩增：通过PCR扩增单个B细胞的抗体基因，通常包括抗体轻链和重链的变异区域。
3. 序列分析：对扩增得到的抗体基因序列进行测序，可以使用常规的测序方法或高通量测序技术。
4. 序列分析：对序列进行分析，包括序列比对、序列注释和序列特征分析等。
通过单细胞抗体基因扩增技术，可以获得单个B细胞的抗体基因序列信息。
这些序列可以用于研究抗体的多样性、亲和力和功能特性等，也可以用于克隆重组抗体或设计人工抗体。
此外，单细胞抗体基因扩增技术还可以用于研究免疫应答过程中单个B细胞的演化轨迹和克隆分布等。
单细胞建库方法范文
单细胞建库方法范文单细胞基因组学和转录组学已经成为研究生物体的基本单位的重要工具。
随着高通量测序技术的快速发展，研究人员能够对数百万个单细胞进行同时测序和分析。
然而，单细胞建库是进行单细胞测序的关键步骤之一，它旨在通过将单个细胞的DNA或RNA扩增到可检测的水平来获得单细胞测序所需的足够的材料。
本文将介绍几种常用的单细胞建库方法。
1.单细胞DNA建库方法单细胞DNA建库方法包括以下几个关键步骤：单细胞分离、DNA提取、DNA扩增和建库。
在单细胞分离步骤中，可以使用流式细胞术或显微操作仪将单个细胞分离并收集到独立的反应管中。
这可以通过细胞排序（如流式细胞术）或微操作仪（如荧光显微镜）来实现。
单个细胞通常在一个特殊的反应管中进行处理，以防止污染和杂交。
在DNA提取步骤中，可以使用商业化的DNA提取试剂盒或手动进行DNA提取。
DNA提取方法的选择取决于细胞类型、细胞数量和研究目的。
常见的DNA提取方法包括化学酶消化、热裂解和磁珠寡核苷酸结合。
DNA扩增是建库的关键步骤，可通过多个技术实现，如PCR（聚合酶链式反应）、MDA（多位点扩增）和MALBAC（多位点保拷）等。
PCR是最常用的方法之一，它使用特异性引物扩增单细胞DNA的目标区域。
MDA和MALBAC是在一个细胞中多次扩增DNA的技术，以获得足够的材料进行测序。
在建库步骤中，扩增后的DNA需要进行片段化、末端修复、连接适配体和标记化处理。
这些步骤通常使用商业化的建库试剂盒和相关酶来完成。
2.单细胞RNA建库方法与DNA建库方法类似，单细胞RNA建库方法也包括单细胞分离、RNA提取、cDNA合成和建库等关键步骤。
单细胞分离和RNA提取的方法与DNA建库类似。
RNA提取的方法种类更多，包括直接裂解法、酚/氯仿法和磁珠寡核苷酸结合法等。
cDNA合成是RNA建库的核心步骤。
在此步骤中，单细胞的RNA将被逆转录为cDNA，这将成为测序的模板。
常用的cDNA合成方法有一步法和两步法。
实验生物学考试整理：单细胞测序技术
细胞种群中每个基因的表达量分布
10 x Genomics 测序 10x Genomics公司的ChromiumTM系统是通过微流体“双十字”系统，将含有barcode 信息的凝胶珠与样品和酶的混合物混合，然后与油表面活性剂溶液结合，形成油包水 的微液滴结构，称为GEMs。 每个液滴里包含一个细胞，一个凝胶珠及相应的反应液。磁珠上偶联4080万条 oligo，每条oligo上包括22 nt 测序引物结合位点，16 nt 10x Barcode序列，10 nt UMI 及30 nt 与mRNA poly A 尾结合的Poly(dT)随机引物。其中一个凝胶珠对应一种 Barcode，用以标记细胞，UMI标记基因并记录表达量。 其工作流程是：首先通过消化，洗涤重悬，过滤，细胞计数及活力检测制备符合要求 的细胞样本，然后，在10x Genomics 平台的双十字交叉系统制备油包水的微液滴结 构，即GEMs。 GEMs形成后，细胞被裂解，凝胶珠自动溶解释放大量含barcode，UMI及oligo dT的 序列，随后mRNA逆转录产生带有Barcode和UMI信息的cDNA。随后油滴破碎，以 cDNA为模板进行PCR扩增，然后进行cDNA打断、加测序接头P5及测序引物R1等传 统二代测序的建库过程，得到双链PCR产物。双链PCR产物可以通过质检后于 illumina平台测序。
Cell Barcode：基于标签（barcode）的单细胞识别。它的核心思想是：在对每个细胞 的mRNA测序前做逆转录时，为其加上独一无二的标签序列。这样即便是混合起来测 序，我们也可以把携带相同标签序列（barcode）的RNA片段视为来自同一个细胞。 通过这种策略，我们可以通过一次建库，测得上万个单细胞的信息 Spikein RNA：已知浓度的外源RNA，用于测量方法用于减少扩增时的不一致性则主要是通过减少反应体系，通过使用 nanoliter 级别的反应体系，增加有效的模板浓度，这类技术被称为 MIDAS 技 术。 3. 单细胞RNA测序 过程：1）单细胞分离; 2) 保留mRNA的细胞裂解；3) mRNA捕获；4）RNA反转 成cD）；8）生物信息学工具进行质控；9）专业的工具进行分析和结果展 示； 考虑：灵敏度、准确度、精确度、成本、偏向性扩增 UMI：通过UMI可以解决PCR扩增的偏向性问题的影响，去除测序结果中的假阳 性重复。UMI是410的随机核苷酸序列，可保证每一条cDNA都带上不同的UMI标 记。扩增后带有相同UMI的则说明来自一个相同分子。
MALBAC单细胞全基因组测序详细解析
单细胞全基因组测序一直是生物学家梦想得到的结果。
但是其中必须解决的矛盾：1. 线性扩增。
如果用全基因组 PCR 扩增，因为PCR 的扩增偏向性（bias ），再加上PCR 过程 中较小的偏向性通过指数放大，其结果就会是严重的覆盖不均一， 导致在许多地方只有很低的覆盖、甚至没有覆盖。
所以，保证模板被线性地扩增，是首要问题。
2. 全基因组覆盖。
常规的建库方法，因为补平、加 A 、接头连接效率的问题，起始 DNA 中 有很大一部分会被浪费，没有形成有效文库分子（也就是两头都接好引物的 DNA 片段）。
在单细胞测序中，这是不可接受的。
3. 高扩增效率。
单细胞中的每个基因位置理论上都只有 2个拷贝，而要从2个拷贝扩增到足够建立文库的 DNA 量，要经过许多次的扩增。
这就需要很高的扩增效率。
而一般的线性扩增很难有好的扩增效率谢晓亮教授创新的 MALBAC 方法（multiple annealing andlooping-based amplification cycles ）， 一举解决了上述3个问题，达到：1.线性扩增，2.近乎全覆盖，3.高扩增效率（高产量）， 并且最终可以用于检测单细胞的 CNV 。
原理： 1.第一步Erien at 65 C Matingar94'C fc' A. 用5'端有27个统一序列，而 3'端是8个随机序列的引物，作为扩增引物。
用随机引 物保证可以在模板链上的各处随机结合 B. 0C 淬火，再65C 等温扩增，得到第一轮的复制的产物 a. n 个扩增产物（在图中标成蓝色），这些扩增产物都有在 5'端有一个统一的引物b. 1个原来的模板（在图中标成黑色）C. 用有前链移开功能的聚合酶（？ 29聚合酶）来进行扩增，这种酶的特点是会把酶前行方 向上的前链从原来的模板链上进行解链、 移开。
利用这种特点，可以让模板上的每个点在第一轮反应中，都有机会得到 n 个拷贝 D. 巧妙之处：a. 0 C 淬火，在延伸开始之前，就把 n 个引物杂交到模板上b. ? 29聚合酶可以把前面的链给推开，结合前面的淬火步骤，一次复制出 n 个扩增子2.第2轮起的m 轮扩增Quenching at OG nnmofGeronix Oi 科Di wirKsol I IVMnFull-amplicon乍厂完整扩増产物与旷増引物统一 底列互补的序列A. 每个循环a. 先0C 淬火，再65C 扩增b. 粘到第一轮所产生的扩增产物上的引物，又会产生一轮扩增。
单细胞全转录组扩增总结
1、多重退火环状循环扩增技术MALBACMALBAC single cell whole genome amplification. A single cell is picked and lysed.First, genomic DNA of the single cell is melted into single-stranded DNA molecules at 94°C. MALBAC primers then anneal randomly to single-stranded DNA molecules at 0°C and ar e extended by a polymerase with displacement activity at elevated temperatures, creating semi-amplicons. In the following five temperature cycles, after the step of looping the full amplicons, single stranded amplicons and the genomic DNA are used as template to produce full amplicons and additional semi-amplicons, respectively. For full amplicons, the 3′ end is complementary to the sequence on the 5′ end. The two ends hybridize will form the looped DNA, which can efficiently preventsthe full amplicon from being used as template, therefore warrant a close-to-linear amplification. After the five cycles of linear preamplification, only the full amplicons can be exponentially amplified in the following PCR using the common 27-nucleotide sequence as the primer. PCR reaction will generate microgram level of DNA material for sequencing experiments.MALBAC覆盖率高、扩增均一，目前MALBAC试剂盒已经做到单管操作，经细胞裂解、MALBAC预扩增、指数式扩增三步，4小时内获得约2-4μg产物2、SMART-seq2TSO (5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′) Oligo-dT30VN (5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′) ISPCR oligo (5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)3、MDAMDA的扩增效率比MALBAC方法高，但各个片段的扩增倍数一致性则没有MALBAC 方法好。