第四章 细胞的破碎与分离
第四章 细胞破碎和分离技术
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
（2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
举例
珠磨法 固体剪切作用 便宜 大规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 适中 大规模处理 超声波法 液体剪切作用 昂贵 小规模处理
（二）物理法 1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
第四章细胞破碎
表 4.0-1. 细胞化学破碎法
方法
技术
原理
效果 成本
举例
化学法
渗透冲击 酶消化法 增溶法 脂溶法 碱处理法
渗透压破坏细胞
温和 便宜
细胞壁被消化，使 细胞破碎
表面活性剂溶解细 胞壁
有机溶剂溶解细胞 壁并使之失稳
碱的皂化作用使细 胞壁融解
温和 温和 适中 剧烈
昂贵 适中 便宜 便宜
血红细胞的破 坏
第四章细胞破碎
※ 4.1 Cell Membranes 细胞膜
第四章细胞破碎
原核生物 细胞结构中没有细胞核：基因物质位于单链DNA上。 典型的生物是大肠杆菌，是生物技术研究的主体。通过这种细胞生产
了很多细胞重组的产物。
第四章细胞破碎
革兰氏阴性细胞结构如图4.1-1 所示。有三层：最外层 约8mm厚，酶大多数镶嵌在这层膜上。 革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构，但有第二层肽聚 糖层和胞浆空间。 第三层为浆膜层或内膜层，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性 都有这一结构，该层主要由磷脂组成，还有分散的蛋白 质分子和金属离子。
第四章细胞破碎
动物细胞
第四章细胞破碎
植 物 细 胞 模 式 图
第四章细胞破碎
真核生物的细胞膜中含有固醇，而原核生物中没有。 除了细胞膜，真核细胞具有一些有特殊作用的细胞器。
第四章细胞破碎
第四章细胞破碎
每个细胞器也都由一层膜包着与原核细胞的内膜浆膜层比较类 似。真核生物的结构复杂并不反映其性质也很复杂。
细胞被玻璃珠或铁 剧烈 珠捣碎
昂贵 适中 便宜
细胞悬浮液小 规模处理
细胞悬浮液大 规模处理
细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理
第四章细胞破碎
第四章 细胞破碎..
层次
单层
主要 肽聚糖(40组成 90%)
多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖(1-4%)
革兰氏 阴性细菌
酵母菌
霉 真菌
10-13 nm
100-300nm
100250nm
多层
多层
多层
肽聚糖 (5-10%) 葡聚糖(30-
多聚糖
脂蛋白
40%)
(80-90%)
脂多糖(11-
甘露聚糖(30%) 脂类
22%)
蛋白质(6-8%) 蛋白质
用超声波的空穴作 适中 用使细胞破碎
须使细胞通过的小 剧烈 孔，使细胞受到剪 切力而破碎
细胞被玻璃珠或铁 剧烈 珠捣碎
昂贵 适中 便宜
细胞悬浮液小 规模处理
细胞悬浮液大 规模处理
细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理
15
※ 2 CHEMICAL METHODS 化学方法
16
n 表4.1-1介绍了主要的几种化学方法，有渗透冲击法， 表面活性剂增溶法、脂溶法。首先简单的介绍一下酶 消化法和碱处理法。
缺点： ➢溶酶价格高， ➢溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶) ➢产物抑制的存在。
22
碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而 且较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种 反应，包括使磷脂皂化。
23
碱处理法
碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组 分从细胞内渗漏出来。
成本低，反应激烈，不具选择性。
38
n 阳离子表面活性剂主要是烷基胺盐。图4.3-1中的十二烷 基溴胺是典型的例子。它有一个长烷烃链（十六烷基）和 三个甲基，都连接在一个带正电的氮原子上，负离子通常 是卤素，市场上常做洗发剂出售。细胞破碎时条件较温和。
生物分离工程细胞分离与破碎课件PPT
固液分离
常规的分离方法：
重力沉降 离心沉降 过滤 生物细胞分离的主要手段
液固体系中的重力沉降
球形粒子Stokes匀速沉降方程：
d u ( s ) g 18
2
细胞悬浮液的基本特性
细胞悬浮液：包含生物细胞、水、细胞代谢物、未消 耗的培养基以及少量的细胞碎片。 细胞悬浮液能否实现理想的分离效果取决于细胞 的种类及表面特性、分泌物的性能等，因为这些特性 决定了细胞在发酵液中的状态、即是自由状态还是絮 凝状态以及悬浮液的黏度等。 发酵液的黏度、细胞的大小、状态决定了固 -液 分离采用的方式、设备。
Fc r 2 4 2 N 2 r
Fc
4 2 N 2 r Z g
离心力或离心加速度
Z
分离因素或离心强度
在科学文献中，常用离心力或离心 强度来表征离心的操作条件
离心设备
Z越大，越有利于分离。常按分离因素Z的大小，对离心机进行分类。
（1） Z 3000，为常速离心机 （2） Z= 3000 ~ 5000，为中速离心机 （3） Z 50000，为高速离心机 （4） Z= 2104 ~ 106， 为超高速离心机 离心沉降设备 瓶式离心机：实验室常用的离心机，低、中速； 工业用无孔转鼓离心机 （1）管式离心机：直径为40-150mm，长径比为4~8，离心强度可达 15000~65000，处理能力为0.1~0.4m3/h, 适合分离 的 固体粒子直径为0.01~100m, 固液密度差大于 0.01g/cm3, 体积浓度小于1%的难分离悬浮液，常 用 于微生物菌体和蛋白质的分离。
絮凝作用：利用含有多个功能基团的线状高分子 聚合物的架桥作用使细胞发生絮凝而 变成粗大的絮凝团。絮凝剂的浓度、 悬浮液的酸度和离子强度都将影响絮 凝的效果。
细胞破碎和生化分离技术-PPT
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法得作用机理不尽相同,有各自得适用范围 (包括菌体细胞、细胞发酵液得特性)和处理规模(实验室或工 业用)
碟片式离心机
• 就是在管式离心机得基础上发展起来得,在转鼓中加入了 许多重迭得碟片,缩短了颗粒得沉降距离,提高了分离效 率。
• 就是生物工业中应用最为广泛得一种离心机 • 有一个密封得转鼓,内装十至上百个锥顶角为60-100゜锥
形碟片。 • 碟片间得距离一般为0、5-2、5mm。
碟片式离心机工作原理
浓度。 • 微滤技术有着广泛应用和众多得优点。
微滤得操作模式
• 无流动操作模式和错流过滤操作模式
微滤设备
• 板框式膜过滤器 • 管式膜过滤器 • 中空纤维式膜分离器 • 螺旋卷式膜分离器
离心技术
• 一、离心分离得基本原理 • 二、离心机得类型 • 三、离心方法 • 四、离心条件得确定 • 五、影响离心效果得主要因素与控制
心机 • 据设备结构特点分:管式、蝶式、螺旋式……
离心机得种类与用途
按速度和离心力: 1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g 以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离; 2、高速(冷冻)离心机 1×104～2、5×104rpm,相对离心力104～ 105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离; 3、超速离心机 转速2、5～8×104rpm,相对离心力5×105g;用于 DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化;检测纯度;沉降系数 和相对分子量测定等。
《细胞破碎分离》ppt课件
法
珠捣碎
细胞的大规模处置
超声波法 使细胞遭到液体剪 适中 昂贵 细胞悬浮液小规模
切力而破碎
处置
2.非机械法
非机械方法很多 1) 生物法-酶溶解〔enzyme lysis〕 2) 化学法溶胞〔chemical treatment〕 3) 物理法 浸透压冲击〔osmotic shock〕 冻结和融化〔freezing and thawing〕 枯燥法 其中酶溶解法和化学溶胞运用最广
大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖 构成，少数含纤维素。
红面包霉菌细胞壁构造： 最外层(a)是α-和β-葡聚糖的
混合物， 第2层(b)是糖蛋白的网状构造 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。
真菌细胞壁的构造表示图
真菌细胞壁的强度：主要决议于聚合物的网状构 造，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维 状构造，所以强度更高。
➢ 缺陷： ➢ 超声波产生的化学自在基能使某些敏感性活性
物质失活。 ➢ 对冷却的要求非常高，所以不易放大，但在实
验室小规模细胞破碎中常用。
不同机械破碎方法的比较
技术
匀浆法 (孔型)
原理
效果 本钱
举例
使细胞遭到液体剪 猛烈 适中 细胞悬浮液大规模
切力而破碎
处置
研磨破碎 细胞被玻璃珠或铁 猛烈 廉价 细胞悬浮液和植物
度，研磨剂量，颗粒大小，以及温度等 相关。
3〕超声波破碎
作用机理：液体剪切力 超声波破碎法
〔Ultrasonication)利用超 声波振荡器发射的15-25kHz 〔千赫〕的超声波探头处置 细胞悬浮液。 超声波的细胞破碎效率与细 胞种类、浓度和超声波的频 率有关。
超声波破碎的机理
第四章细胞的破碎与分离
第四章细胞的破碎与分离第四章细胞的破碎与分离教学基本要求：1. 掌握细胞破碎的概念。
2. 熟悉和掌握细胞破碎的各种方法。
时间安排：3学时。
教学形式：本章以讲授为主，中间部分进行部分提问，采用PPT 课件讲课。
教学内容：由于有许多生化物质存在于细胞内部，必须在纯化以前将细胞破碎，使胞内物质释放到液相中，然后方可进行提取。
细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。
破碎率及其测定方法：破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比。
测定方法：直接测定法和间接测定法。
细胞破碎方法分类1) 机械破碎法（高速珠磨法、高压匀浆法、超声波法等）2) 非机械破碎法（化学法、酶解法、渗透压法、冻融法、干燥法等）机械破碎法：一、固体剪切方法（珠磨）：1、定义—利用由高速转动的珠子所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程2、工作原理：固－固剪切力、液－固剪切力等。
3、影响因素：转盘外缘速度：速度增加，破碎率增加，但功率-，温度-珠粒添量和大小：要适度温度：但研磨产热，功率-，温度-。
如产物热不稳定，必须控温。
细胞浓度x：最佳x由实验确定。
一般产热量随细胞浓度的降低而下降，但单位细胞重量的能耗-。
流量Q：破碎为一级反应。
Q-, E-，Rˉ；Qˉ，Eˉ，R-。
二、高压匀浆法（液体剪切方法）1、定义—利用高压细胞悬浮液因减压所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程2、工作原理：液－液剪切力、压力差等3、影响因素：通过匀浆机的次数温度：高温使破碎率增加但高温使产物变性压力：高压使破碎率增加但高压使能耗增加，且会使机器破损。
在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多; 二者均具有适用对象广，工业化、实验室中应用，细胞完全破碎等优点。
高压匀浆机最适合于酵母和细菌;珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适。
三、超声波法1、定义—利用超频率声波（15-25kHz）在液体介质中传播所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程2、工作原理：空穴现象，空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。
生物分离工程 第4章-细胞的破碎-
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
n
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
8
第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
5
细胞破碎的必要性
表1 胞内酶举例
酶 L-天冬酰氨酶 过氧化氢酶 胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 来源 Eruinia Caratovora Escherichia Coli Aspergillus niger Nocardia hodochrous Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis Aspergillus niger Penicilluim notatum Yeast 应用范围 治疗急性淋巴癌 牛奶灭菌后H2O2的清除 胆固醇浆液分析 在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用 葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除 临床分析
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第四章细胞的破碎与分离
教学基本要求：
1. 掌握细胞破碎的概念。
2. 熟悉和掌握细胞破碎的各种方法。
时间安排：3学时。
教学形式：本章以讲授为主，中间部分进行部分提问，采用PPT课件讲课。
教学内容：
由于有许多生化物质存在于细胞内部，必须在纯化以前将细胞破碎，使胞内物质释放到液相中，然后方可进行提取。
细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。
破碎率及其测定方法：
破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比。
测定方法：直接测定法和间接测定法。
细胞破碎方法分类
1) 机械破碎法（高速珠磨法、高压匀浆法、超声波法等）
2) 非机械破碎法（化学法、酶解法、渗透压法、冻融法、干燥法等）
机械破碎法：
一、固体剪切方法（珠磨）：
1、定义—利用由高速转动的珠子所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程
2、工作原理：固－固剪切力、液－固剪切力等。
3、影响因素：
转盘外缘速度：速度增加，破碎率增加，但功率，温度
珠粒添量和大小：要适度
温度：但研磨产热，功率，温度。
如产物热不稳定，必须控温。
细胞浓度x：最佳x由实验确定。
一般产热量随细胞浓度的降低而下降，但单位细胞重量的能耗。
流量Q：破碎为一级反应。
Q-, E-，R¯；Q¯，E¯，R-。
二、高压匀浆法（液体剪切方法）
1、定义—利用高压细胞悬浮液因减压所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程
2、工作原理：液－液剪切力、压力差等
3、影响因素：
通过匀浆机的次数
温度：高温使破碎率增加但高温使产物变性
压力：高压使破碎率增加但高压使能耗增加，且会使机器破损。
在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多; 二者均具有适用对象广，工业化、实验室中应用，细胞完全破碎等优点。
高压匀浆机最适合于酵母和细菌;珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适。
三、超声波法
1、定义—利用超频率声波（15-25kHz）在液体介质中传播所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程
2、工作原理：空穴现象，空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。
3、特点：
优点：适合于多种细胞的破碎
缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、珠粒体积和直径、被处理悬浮液的体积和流速、探头材料和形状；B、超声产生超氧离子毒害作用；C、有效能量的利用率低；
D、产热大，需控温；
E、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。
非机械破碎法
一、化学（脂溶）法：
1、定义——采用某些化学试剂改变细胞壁和膜的通透性，使内含物有选择性地释放出来的过程。
2、原理：
酸碱：改变溶液pH值，从而改变两性产物蛋白质等的电荷性质
有机溶剂：如甲苯，被细胞壁脂质层吸收后，导致细胞壁膨胀，细胞壁破裂。
表面活性剂：
二、酶解法
1、定义—利用酶促反应分解细胞壁上的化学键而达到细胞破碎的过程
2、原理
外源性酶解—溶菌酶、糖苷酶（β-1,4、β –1,6）、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、α-淀粉酶、纤维素酶、脂酶等。
内源性酶解（自溶）——温度、pH、时间、缓冲液浓度、激活剂等。
3、化学法与酶法的优点：
A、产品释放的选择性；
B、提取速度和收效高；
C、产品的破坏小；
D、对外界环境，如pH和温度等要求低；
E、不残留细胞碎片
三、物理法：
1、渗透压法：细胞经高渗溶液，如一定浓度甘油或蔗糖溶液处理，使之脱水收缩，然后转入水或水溶液，因渗透压突然变化，细胞快速膨胀而破裂，使产物释放到溶液中。
2、冻融法：细胞在低温（-15度）下冷冻，然后在室温下融化，反复多次而使细胞破裂。
3、干燥法：细胞用不同的方法干燥，细胞膜渗透性发生改变而破裂。
然后用有机溶剂缓冲溶液抽提胞内物质。
四、机械法和非机械法的比较
1、机械法法缺点：
A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活；
B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；
C、细胞碎片大小不一，难分离。
2、非机械法缺点：
A、费用高；
B、引起新的污染，尤其是其他化学方法；
C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。
破碎方法的选择
一、选择的一般原则
1、提取产物在细胞质内，用机械法破碎
2、提取产物在细胞膜附近，用化学法
3、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法
二、破碎技术应注意的问题
1、多种破碎方法相结合，杂交技术可产生很大优势。
2、破碎技术对下游分离技术的影响。
破碎颗粒清除，产物的分离纯化
3、破碎技术与上游技术相结合：菌种的培育（过程和环境、胞内产物® 胞外产物）对破
碎难易程度的影响
三、存在的问题
1、包涵体
通过基因工程技术使一些基因在原核细胞表达时，蛋白质常常交联在一起，形成不溶性的聚积物，通常称为包涵体。
2、包含体的解决方法（一般步骤）
1) 包含体的分离：细胞破碎，然后离心。
2) 包含体溶解、变性、还原，一般用尿素、盐酸胍、SDS
3) 变形蛋白质的复性和重新氧化：分子伴侣-催化及维持其它蛋白质正确构象的一类蛋白质分子，它参与许多蛋白质的折叠、聚合及跨膜运输，通过瞬时稳定其它蛋白质折叠中间体，阻止了蛋白质的聚集，帮助其形成正确构象。
4) 一般的分离纯化。