人增生性瘢痕成纤维细胞的分离、培养
病理性瘢痕组织内不同部位成纤维细胞的异质性
病理性瘢痕组织内不同部位成纤维细胞的异质性聂芳菲;张哲【摘要】病理性瘢痕主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,成纤维细胞是其发生、发展的主体细胞.正常皮肤、增生性瘢痕真皮浅层和真皮深层的成纤维细胞以及瘢痕疙瘩组织中不同层次、不同部位的成纤维细胞在细胞形态、功能、分子表型等方面均具有异质性.真皮深层的成纤维细胞可能是形成增生性瘢痕的主要细胞来源;而瘢痕疙瘩的形成则包含了真皮浅层和深层成纤维细胞的共同作用,并与其组织内不同部位成纤维细胞的异质性有关.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2014(020)016【总页数】3页(P2892-2894)【关键词】瘢痕疙瘩;增生性瘢痕;成纤维细胞;异质性;不同部位【作者】聂芳菲;张哲【作者单位】北京大学第三医院成形外科,北京100191;北京大学第三医院成形外科,北京100191【正文语种】中文【中图分类】R622;Q291病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。
两者的实质都是以成纤维细胞为主的细胞增殖、活性增强，产生大量的胶原蛋白，使细胞外基质成分在组织中大量沉积，而难以被机体吸收或重塑的病理状态。
增生性瘢痕表现为高出正常皮肤、质地较硬的皮肤纤维化疾病。
瘢痕疙瘩更是瘢痕形成机制的代表性病变，是整形外科和皮肤科在临床治疗中面临的重大难题。
与增生性瘢痕相比，瘢痕疙瘩的临床特点为创伤诱因不明显、增长速度过快、不易退化、向周围正常皮肤浸润扩散，并超出原皮损范围。
早期常伴有炎性浸润带，手术切除后易复发，且复发范围可超过原瘢痕范围[1]。
在病理性瘢痕发病机制的基础研究中，许多研究者发现，不同层次、不同部位的瘢痕组织在临床表现、病理改变、细胞生物学和分子生物学特性等方面的差异较大，因此采取分层和(或)分部位研究，如真皮浅层和真皮深层；浸润部、增生部和老化部；中央部和周边部[2]。
该文就病理性瘢痕基础研究中关于正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩不同层次、不同部位成纤维细胞的细胞及分子生物学差异作一综述，并探讨瘢痕组织内部成纤维细胞的异质性与病理性瘢痕发病机制的关系。
脂肪源性干细胞影响增生性瘢痕的机制研究
脂肪源性干细胞影响增生性瘢痕的机制研究作者：陈俊男李治桦赖琳英周桂文梁黎明陈敏亮来源：《中国美容医学》2021年第10期[摘要]目的：本研究旨在观察乳糜化脂肪来源干细胞条件培养液（Chyle fat derived stromal/stem cells-conditioned medium，CFSCs-CM）对增生性瘢痕成纤维细胞（Hypertrophic scar fibroblasts，HSFbs）在细胞增殖、凋亡等的影响，为乳糜化脂肪改善增生性瘢痕奠定实验基础。
方法：采用酶消化法从健康人腹部抽吸脂肪中获得CFSCs，制备CFSCs-CM用于处理HSFbs，采用CCK-8法、细胞划痕实验、Annexin V-FITC凋亡检测法比较不同培养液对HSFbs细胞增殖、迁移、凋亡的影响;采用酶联免疫吸附试验、蛋白免疫印记实验检测Ⅰ型胶原蛋白（Col Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（Col Ⅲ）、核心蛋白聚糖（Decorin，DN）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的分泌水平。
结果：本实验结果初步验证CFSCs-CM能够抑制HSFbs的增殖、迁移，促进凋亡。
CFSCs-CM还可以抑制HSFbs分泌Col Ⅰ，Col Ⅲ及α-SMA蛋白。
CFSCs-CM对HSFbs能够发挥抗纤维化作用。
结论：CFSCs-CM可能通过旁分泌途径来发挥抑制HSFbs的作用。
[关键词]增生性瘢痕;纤维化;脂肪来源干细胞;机制研究;条件培养液;成纤维细胞[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2021）10-0001-05Study on the Mechanism of Chyle Fat Derived Stem Cells Affecting Hypertrophic ScarsCHEN Jun-nan1，LI Zhi-hua1，LAI Lin-ying2，ZHOU Gui-wen2，LIANG Li-ming2，CHEN Min-liang2[1.PLA Rocket Force Characteristic Medical Center，Beijing 100088，China;2.Department of Burn and Plastic Surgery，the Fourth Medical Centre，Chinese PLA （People’s Liberation Army）General Hospital，Beijing 100048，China]Abstract： Objective The purpose of this study was to observe the effects of CFSCs-conditioned medium （CFSCs-CM） on hypertrophic scar fibroblasts （HSFbs） on cell proliferation and apoptosis. Lay an experimental foundation for the application of chyle fat to improve hypertrophic scars. Methods Enzymatic digestion method was used to obtain CFSCs from the abdomen of healthy people. CFSCs-CM was used to treat HSFbs. CCK-8， cell scratch test， Annexin V-FITC apoptosis detection were used to compare the effects of different culture media on HSFbs cells The effects of proliferation， migration， and apoptosis. ELISA and Western Blot were used to detect the secretion level of type Ⅰ collagen （Col Ⅰ）， type Ⅲ collagen （Col Ⅲ）， decorin （DN）and α smooth muscle actin （α-SMA）. Results The results of this experiment preliminarily verify that CFSCs-CM can inhibit the proliferation and migration of HSFbs， and can promote the apoptosis of HSFbs. In addition， CFSCs-CM can also inhibit HSFbs to secrete Col Ⅰ， Col Ⅲ and α-SMA protein. CFSCs-CM can exert anti-fibrosis effect on HSFbs. Conclusion CFSCs-CM may inhibit HSFbs through the paracrine pathway.Key words： hypertrophic scar; fibrosis; adipose derived stem cells（ADSCs）; mechanism research; conditioned medium; fibroblast間充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSCs）可通过其多向分化潜能及分泌功能调节免疫反应、促进血管再生，MSCs可以分泌多种具有抗纤维化作用的细胞因子促进创面愈合并减少瘢痕的形成[1-4]，其中脂肪源性间充质干细胞更具备了促进血管内皮细胞增殖，加快血液循环建立，为瘢痕的修复提供充足的营养及氧，有效改善瘢痕重塑，让更多的研究者关注其对瘢痕的改善作用[5-6]。
丹参酮A对瘢痕成纤维细胞超微结构和自由基代谢平衡影响的实验研究刘华
中国美容医学2012年12月第21卷第12期(上)Chinese Journal of Aesthetic Medicine.Dec.2012.Vol.21.No.12基础研究基金项目：２０１１年广西研究生教育创新计划项目（项目编号：２０１１１０５９８１００２Ｍ２０７），广西自然科学基金项目（桂科自０７２８１２９）通讯作者：蒙诚跃，广西医科大学第一附属医院烧伤整形外科，５３００２１，Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｃｙ８０６０＠１２６．ｃｏｍ·论著·丹参酮ⅡＡ对瘢痕成纤维细胞超微结构和自由基代谢平衡影响的实验研究刘华，杨华莲，蒙诚跃（广西医科大学第一附属医院烧伤整形外科广西南宁５３００２１）［摘要］目的：探究丹参酮ⅡＡ磺酸钠（ＳＴＳ）对人增生性瘢痕（ＨＳ）的成纤维细胞（Ｆｂ）超微结构及自由基代谢平衡的影响，从抗氧化途径寻找一种新的治疗ＨＳ的有效方法。
方法：收集术中７例ＨＳ组织进行Ｆｂ体外培养，取第３～６代传代细胞进行实验观察，设置实验组和对照组，实验组设置不同浓度组ＳＴＳ（０．０５，０．０７５，０．１０，０．１２５，０．１５，０．２０ｍｇ／ｍｌ）干预培养，对照组加入等量不含ＳＴＳ的ＤＭＥＭ培养液。
①干预培养４８ｈ后应用倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞形态及超微结构改变；②分别于培养１２ｈ，２４ｈ，４８ｈ后，应用化学比色法检测细胞内丙二醛（ＭＤＡ）含量、黄嘌呤氧化酶（ＸＯＤ）活力、总超氧化物歧化酶（Ｔ－ＳＯＤ）活力及谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）活力变化。
结果：①透射电镜见实验组细胞内线粒体肿胀及空泡样变性，粗面内质网扩张、囊泡变及脱颗粒，胶原纤维束减少，细胞坏死等现象；②与对照组比较，实验组ＭＤＡ含量及ＸＯＤ活力明显降低（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），且存在浓度－时间效应。
与对照组比较，实验组Ｔ－ＳＯＤ和ＧＳＨ－Ｐｘ活力水平有不同程度升高，其升高程度受药物浓度和作用时间影响。
与对照组比较，药物作用１２ｈ时，高浓度组（０．１５ｍｇ／ｍｌ和０．２０ｍｇ／ｍｌ）Ｔ－ＳＯＤ活力水平升高明显（Ｐ＜０．０５）；２４ｈ时，０．１２５～０．２０ｍｇ／ｍｌ组显著升高（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）；４８ｈ时，０．０５ｍｇ／ｍｌ～０．１０ｍｇ／ｍｌ组显著升高（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），０．１５ｍｇ／ｍｌ和０．２０ｍｇ／ｍｌ组显著降低（Ｐ＜０．０１）。
增生性瘢痕的发病机理和预防进展
增生性瘢痕的发病机理和预防进展增生性瘢痕一直以来都是存在于全世界范围内的难题，在不同种族中其发病率有所差异，以往的报道提到白种人群中的增生性瘢痕发病率在5%～37%[1]。
增生性瘢痕在临床上表现为不超过伤口范围的高出皮肤表面的瘢痕组织，早期充血明显，可伴有疼痛或瘙痒，位于关节部位则可能会引起活动功能障碍[2]。
增生性瘢痕产生的不雅外观和不适症状让患者身心都承受着巨大的压力，预防瘢痕不仅是医学问题，也是一个社会问题，其防治对临床工作者来说更是一个挑战。
本文就增生性瘢痕的预防进展综述如下。
1 发病机制增生性瘢痕的病理基础是以成纤维细胞（fibroblast，Fb）为主的细胞成分的过度增殖和以胶原为主的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度沉积，目前其发病机制尚不甚清楚，总结参与的致病因素主要包括以下几个方面：1.1 ECM代谢异常：正常情况下，人体内ECM的合成和分解处于动态平衡，从而维持着相对稳定。
在创伤愈合的过程中，如果ECM合成明显增多则会形成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩[3-6]。
Ⅰ型和Ⅲ型胶原是组成ECM的主要成分[7]，在增生性瘢痕中I /III胶原的比例可达6：1，明显高于正常的皮肤组织[8]。
1.2 细胞因子：细胞因子在增生性瘢痕的形成中起到了重要的作用，如转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板源性生长因子和胰岛素样生长因子，均可诱导细胞合成大量胶原蛋白，使基质中胶原过度沉积。
Wang[9]研究发现增生性瘢痕比正常皮肤产生更多的可合成TGF-β1的mRNA以及蛋白，并且持续高表达TGF-β受体。
1.3 低氧和自由基：Takahashi等[10]发现低氧环境中培养的Fb可持续高表达脯氨酸、胶原蛋白，而间质金属蛋白酶-3表达降低，导致创伤后胶原沉积[11]。
研究表明，高于正常水平的NO可刺激成纤维细胞合成胶原，与瘢痕的形成有关[12]。
苦参碱对体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞 MMP-1、MMP-9表达的影响
苦参碱对体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞 MMP-1、MMP-9表达的影响陈小婷;欧斌贤;唐屈;黄积荣;刘达恩;农庆文【摘要】Objective To study the effects of matrine on the expressions of matrix metalloproteinase (MMP)-1, MMP-9 in human hypertropic scar fibroblasts ( HSFb) in vitro.Methods HSFb was cultured in vitro by being treated with different concentrations of matrine[0 mmol/L(control group),2.5 mmol/L,5.0 mmol/L,10.0 mmol/L].Enzyme-linked immunoadsorbent assay(ELISA) was used to detect the expressions of MMP-1,MMP-9 in the treated supernatants.Results The expression levels of MMP-1,MMP-9 in groups of different concentrations of matrine were higher than those in the control group 24 or 48 hours after matrine treatment(P<0.05),the expression levels of MMP-1,MMP-9 in the 5.0 mmol/L matrine group were higher than those in the 2.5,10.0 mmol/L matrine groups ( P<0.05).Conclusion Matrine can increase the expression of MMP-1,MMP-9.It can be applied to hyperplastic scar prevention and treatment .%目的：探讨苦参碱对体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞（ HSFb ）基质金属蛋白酶（ MMP-1、MMP-9）表达的影响。
病理性瘢痕基因治疗的研究现状通
病理性瘢痕基因治疗的研究现状通（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【关键词】增生性瘢痕;瘢痕疙瘩;基因治疗;细胞因子病理性瘢痕主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，目前国内外的研究尚未能很好地揭示其发病机制，临床防治也存在较大困难，成为了医学研究的难点和重点问题之一。
近年来，随着基因工程技术的研究进展，病理性瘢痕的基因治疗成为研究的热点，现就其研究现状综述如下。
1 细胞因子基因疗法目前的研究表明，各种细胞因子对创面愈合和瘢痕防治的作用不同，通过基因转染、基因敲除等手段，针对这些细胞因子的作用进行干预，可以达到防治瘢痕的目的。
1.1 转化生长因子β(TGF-β) TGF-β在瘢痕形成及发展中起着非常重要的作用[1]。
Choi等[2]以反义TGF-β1核酸转染动物伤口，结果发现在给予反义寡核苷酸转染抑制TGF-β功能后，伤口瘢痕形成显著减少。
liu等[3]用含有截短型TGF-βⅡ型(tTGF-βR Ⅱ)受体的腺病毒转染新生大鼠背部线性伤口，检测结果表明腺病毒介导的tTGF-βR Ⅱ可促进创伤愈合，减少瘢痕形成。
Ashcroft等[4]证实Smad3 缺陷的小鼠上皮再生加快，瘢痕形成减少。
Gao等[5]证实针对Smad 2的小干扰RNA转染能减少瘢痕疙瘩成纤维细胞的I、Ⅲ型胶原分泌。
提示通过对TGF-β下游分子Smad进行干预，也能对抗TGF-β促瘢痕形成作用。
1.2 肝细胞生长因子(HGF) HGF可抑制肝纤维化组织中TGF-β1的产生，增强胶原酶的活性。
Ha 等[6]以腺病毒载体将人的HGF 转染兔耳增生性瘢痕，结果显示实验组瘢痕明显缩小，胶原成分也较对照组减少，而且有更多的毛囊和汗腺结构出现。
1.3 结缔组织生长因子(CTGF) CTGF在肝、肾、等器官纤维化中具有重要作用，是TGF-β的下游分子，能促进成纤维细胞的增殖和Ⅰ型胶原的表达[7]。
刘剑毅等[8]以脂质体将CTGF反义寡核苷酸导入瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)，证实CTGF反义寡核苷酸能抑制细胞增殖，减少其胶原合成。
PI3K／AKT信号通路在CTGF促人增生性瘢痕成纤维细胞转
ＰＩ3Ｋ／ＡＫＴ信号通路在ＣＴＧＦ促人增生性瘢痕成纤维细胞转分化中的作用目的：探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路是否介导结缔组织生长因子促人增生性瘢痕成纤维细胞转分化。
方法：体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞，实验分3组：①空白对照组；②结缔组织生长因子（10ng/ml）刺激组；③磷脂酰肌醇3激酶抑制剂L Y294002（10μmol/L）预处理后结缔组织生长因子刺激组。
应用免疫印迹技术检测48h后a-平滑肌肌动蛋白的表达，应用流式细胞术检测a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率。
结果：和空白对照组相比，结缔组织生长因子刺激组细胞a-平滑肌肌动蛋白表达和阳性细胞百分率升高；经磷脂酰肌醇3激酶抑制剂L Y294002预处理后，再以结缔组织生长因子刺激，细胞a-平滑肌肌动蛋白表达和阳性细胞百分率升高水平下降，经统计学分析，差别具有显著性（P＜0.05）。
结论：结缔组织生长因子能够促进人增生性瘢痕成纤维细胞转分化，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路介导该效应，磷脂酰肌醇3激酶抑制剂L Y294002 可抑制此效应。
Abstract：ObjectiveTo explore if the effect of connective tissue growth factor on the transdifferentation of human hypertrophic scar fibroblasts is mediated by phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B(PI3K/PKB) signal pathway. MethodsHuman hypertrophic scar fibroblasts were cultured in vitro. The cells were divided into three groups: ①control group，②connective tissue growth factor（10 ng/ml）stimulated group，③PI3K inhibitor LY294002（10μmol/ L）pretreated and connective tissue growth factorstimulated group. The expression of a-smooth muscle actin was examined by western blot in human hypertrophic scar fibroblasts after 48 hours. The positive ratio of a-smooth muscle actin was examined by flow cytometry.ResultsCompared with the control group, the expression and the positive ratio of a-smooth muscle actin in the connective tissue growth factor stimulated group increased. The raise level of a-smooth muscle decreased after the pretreatment of PI3K inhibitor LY294002. The results were markedly different by statistic analysis（P ＜0.05）.ConclusionConnective tissue growth factor can promote the transdifferentation of human hypertrophic scar fibroblasts mediated by PI3K/PKB signaling pathway. This effect can be inhibited by LY294002.Key words: connective tissue growth factor; hypertrophic scar; fibroblast; phosphatidylinositol 3-kinase; protein kinase B; transdifferentation; a-smooth muscle actin增生性瘢痕（hypertrophic Scar，HS）是人类皮肤真皮损伤后以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质如胶原等过度沉积为特征的皮肤纤维化疾病，其中成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞后促纤维化功能明显增强。
成纤维细胞培养与瘢痕形成
成纤维细胞培养与瘢痕形成
佚名
【期刊名称】《中国组织工程研究与临床康复》
【年(卷),期】2011(15)24
【摘要】1人正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞的培养及生物学差异,见2010年50期9341页。
2姜黄素对瘢痕疙瘩成纤维细胞周期及其核转录因子KB信号转导通路的影响。
【总页数】1页(P4510-4510)
【关键词】成纤维细胞培养;瘢痕形成;瘢痕疙瘩成纤维细胞;核转录因子KB;信号转导通路;生物学差异;正常皮肤;细胞周期
【正文语种】中文
【中图分类】R982
【相关文献】
1.人增生性瘢痕成纤维细胞中SnoN的表达及其参与增生性瘢痕形成的机制 [J], 况芳;张志;陈宾;刘昌玲;赵元元;许志荣;李孝建
2.缺氧状态下瘢痕疙瘩成纤维细胞条件培养基对血管形成能力的影响 [J], 张哲;康春福;陈斌;聂芳菲;马建勋;秦泽莲
3.培养的正常和瘢痕角质形成细胞上清液对瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响[J], 郭树忠;张琳西;王臻;刘建波
4.本期专题：成纤维细胞培养与瘢痕形成 [J],
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人增生性瘢痕成纤维细胞的分离、培养
随着当今科技发展，细胞研究成为热点，因此合适细胞培养方法成为实验的基础。
本实
验主要在组织块培养法上进行改进，为寻找比较合适的人增生性瘢痕成纤维细胞的分离、培
养的方法提供依据，提高实验效率。
1.实验方法
标本取自我院骨科患者(伤后5月)，采用组织块和组织块消化培养法，体外培养成纤维
细胞第4～8代后，各分为4组。
2.人增生性瘢痕成纤维细胞的分离、培养
标本由本院骨科医生术中切取（经患者及家属知情同意，证实术前未进行任何药物治疗，5岁小儿伤后5月瘢痕，红色，稍高出周边皮肤）。
切取瘢痕置于生理盐水培养皿中，送入
实验室，给予酒精浸泡5秒，送入无菌台，放入含有青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL)的Hank,s液中漂洗。
首先用眼科剪剪除瘢痕的表皮及皮下脂肪，再将真皮层剪成1mm?左右的
块状物,使用组织块法接种4瓶：将小块种植于25cm?培养瓶瓶底，保持间距1cm，翻转瓶底
朝上，使用10ml注射器抽取含10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100U/ml)的DMEM
培养液，注入培养瓶中，4mL左右，将培养瓶置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中，瓶
盖扭松1/4圈。
静置4小时，组织块贴牢瓶底后，缓慢翻转培养瓶，使培养液浸过所有组织块，继续培养。
剩余组织块采用改进组织块法，浸入0.25%胰蛋白酶和0.02%依地酸溶液，水平面高出组织约2cm，室温保持30分钟后，送入4℃冰箱消化过夜。
次日清晨，取出培养瓶，酒精消毒后送入无菌台，取出组织，以10%胎牛血清终止消化。
使用吹打管将小块种植于
25cm?培养瓶瓶底，保持间距1cm，翻转瓶底朝上。
使用10ml注射器抽取含10%胎牛血清、
青霉素(100U/ml)和链霉素(100U/ml)的DMEM培养液，注入培养瓶中，4mL左右，将培养瓶
置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中，瓶盖扭松1/4圈。
静置4小时，组织块贴牢瓶底后，缓慢翻转培养瓶，使培养液浸过所有组织块，继续培养。
每隔5天换液，待细胞游离、
扩增至基本融合成片达瓶底80%后，进行消化传代。
10ml注射器吸去瓶中培养液，D-Hanks
液漂洗3次后，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%依地酸溶液，消化1～3min，肉眼可见瓶底斑片
脱落、漂浮、溶解，立即送入显微镜下观察：细胞明显失去两极，回缩、变成圆球形，加入
含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用弯头吸管反复吹打瓶壁细胞，吹打时动作轻柔，顺序从瓶底一侧吹响另一侧。
将消化下的细胞置入离心管离心，去上清，加入培养液6ml左右，按1：3比例接种于新的培养瓶中，并补加含10%胎牛血清的DMEM培养液，混匀，于
温箱中继续培养。
3天左右，当细胞再次长满时，继续按1：3传代。
（实验采用第4～8代
细胞进行）
3.两种不同分离方法人增生性瘢痕成纤维细胞的生长
组织块改进法培养细胞第3天，在倒置相差显微镜下观察可见组织块周边有游走的贴壁
细胞，呈梭行或多角形，核卵圆，散在分布于瓶底，排列稀疏。
第12天组织块周边可见大
量呈梭行的瘢痕成纤维细胞鱼群样生长，鱼群周边可见大量的散在成纤维细胞，中央有卵圆
形核，胞质向外伸出2～3个的突起，长短不一，细胞间排列明显紧密，较少的细胞间隙。
第18天细胞明显增多，细胞缝隙明显减少，分布培养瓶底80%面积，细胞相互平行排列，
呈旋涡状或鱼群状，部分拥挤处细胞呈针尖样。
组织块法第8天可见组织块周边有游走的贴
壁细胞。
第20天，25天分别见到上述现象，进行细胞传代，传代后细胞生长迅速，分布瓶
底80%时再进行传代，约5天左右传代1次。
见图1.2.1～1.2.8。
4.结论
组织块改进法获得细胞时间明显缩短，较组织块法提前5天爬出成纤维细胞，提前一周
长满瓶底。
5.讨论
自Conway[1]体外培养成纤维细胞成功以来，细胞研究逐渐成为热点。
因此如何有效体外培养细胞十分关键。
目前主要的培养方法根据是否使用消化酶分为两大类：一类是组织块培养法，另一类酶消化法。
目前大部分的科研工作者采用组织块培养法。
黄勇[2]等人在组织块接种6天后可见细胞爬出，郭冉[3]组织块法接种10天左右可见细胞爬出，加入多聚赖氨酸后1周可见游离的细胞，李永林[4]等人经实验证实酶消化法明显较组织块法更快培养出成纤维细胞等人。
林尊文[5]等人证实酶消化法培养细胞存度高、培养周期短。
本实验分别采用组织块法和改进组织块培养法，同一批组织块，取自小儿伤后5月增生期瘢痕，两者均培养出成纤维细胞。
改进法在剪成小块的基础上使用0.25%胰蛋白酶和0.02%依地酸4℃消化，消化后组织贴壁更紧，不易漂浮，胶原纤维在消化后也更易成纤维细胞的爬出。
因此改进法获得细胞时间明显缩短。
实验注意事项：（1）瘢痕组织经消毒后尽快处理；（2）年轻患者瘢痕组织更易培养；（3）实验操作避免组织块的漂浮，但酶消化法因消化液的粘性，不易漂浮；（4）培养过程中注意无菌操作，避免污染。
综上所述，目前大量的实验证实结合组块法的酶消化法更易培养出成纤维细胞。
可快速高效培养成纤维细胞，对于细胞生物学的研究具有重要意义。
图1.2.1 改进组织块法第3天图1.2.5 组织块法第8天
（倒置相差显微镜400X）（倒置相差显微镜400X）
图1.2.2 改进组织块法第7天图 1.2.6 组织块法第15天
（倒置相差显微镜400X）（倒置相差显微镜400X）
图1.2.3 改进组织块法第12天图 1.2.7 组织块法第20天
（倒置相差显微镜400X）（倒置相差显微镜400X）
图1.2.4 改进组织块法第18天图 1.2.8 组织块法第25天
（倒置相差显微镜400X）（倒置相差显微镜400X）
【参考文献】
[1]Conway H.Observation on the behavior of human Keloids[J].Plast
Reconstrsurg,1959,24(2):229.
[2]黄勇，任林森，芩瑛.瘢痕成纤维细胞培养及其生物学行为的实验研究[J].Chinese
J.Reparative and Reconstructive Surgery,1998,12(6):332-334.
[3]郭冉，刘洁婷，刘海峰等.组织贴壁法原代培养人皮肤瘢痕成纤维细胞[J].牡丹江医学院学报，2010,31(1):31-32.
[4]李永林，陈壁，汤朝武等.烧伤患者深Ⅱ度创面成纤维细胞的体外培养.Chin J Burns,February 2003,Vol.19,No.1:35-37.
[5]林尊文，徐少宏，游敏等.人增生性瘢痕成纤维细胞的改良培养和鉴定[J].实用医学杂志，2011,27(24):4367-4369.。