细胞免疫组化步骤
免疫组化实验的详细步骤
免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。
4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。
2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。
蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。
5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。
PBS洗三次，每次5分钟。
6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。
9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。
12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。
稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。
淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。
苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。
盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。
我没用淡氨水溶液。
若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理大家好，今天咱们聊聊免疫组化这门技术。
它可是生物医学研究中的一把好手，能让细胞和组织的秘密无所遁形。
咱们先从免疫组化是什么说起。
首先得明白，免疫组化是一种研究方法，它通过给样品加上抗体，让它们跟细胞里的蛋白质或分子“亲密接触”，然后通过染色来观察这些蛋白质或分子的位置和分布。
听起来是不是挺高大上的？不过别急，咱们慢慢来，一步步揭开它的神秘面纱。
1.1 准备工作开始之前，你得确保所有材料都是新鲜的、高质量的，还有那试剂啊，得是实验室里常用的那种。
别忘了准备一个显微镜，这可是观察的关键哦！1.2 固定和包埋接下来就是让细胞和组织固定在一块，这个步骤叫做固定。
把样本放到甲醛溶液或者丙酮里面一泡，就能把它们牢牢地锁住，防止它们移动。
之后呢，把固定好的样本放进树脂里，这样它们就能稳稳当当的了。
这一步是为了保护细胞和组织的结构不被破坏，方便后续的切片和染色工作。
1.3 切片把处理好的样本切成薄片，这就是切片。
切片的时候得小心，别让样本碎掉或者变形。
切片后，还得把那些乱七八糟的东西去掉，比如蜡质啊、气泡啊，这样才能让下面的染色工作顺利进行。
1.4 染色染色可是个技术活。
你得选对染料，颜色要鲜艳，还要能穿透细胞膜，把里面的物质找出来。
染色的方法有很多种，比如直接法、间接法和免疫荧光法等等。
每种方法都有它的特点，就像不同的人有不同的爱好一样。
1.5 观察染色完成后，就可以用显微镜来观察啦！看看细胞和组织里的蛋白质、分子是怎么分布的。
有时候，你还能发现一些有趣的现象，比如某些细胞里藏着很多糖，还有些地方有抗体的“家”。
这些观察结果可是非常宝贵的，能帮助我们更好地理解生物体内的奥秘。
2.1 注意事项做免疫组化实验的时候，可不能马虎哦。
记得要戴好防护眼镜和手套，避免接触到有毒有害物质。
操作时要轻柔，不要破坏样本的结构。
还有啊，处理完样本后得洗手，保持实验室的清洁和卫生。
2.2 常见问题及解决方案有时候会遇到一些问题，比如样本太干或者太湿，这时候可以试试加一点水或者甘油来调整。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种常用的实验诊断技术，它通过检测细胞或组织中的特定蛋白质来帮助诊断疾病。
免疫组化的完整步骤包括抗原制备、抗体制备、预处理、染色和结果分析等几个环节。
下面我将详细介绍每个环节的原理及操作步骤。
首先是抗原制备。
抗原是指能够与特异性抗体结合的物质，常见的抗原有蛋白质、多肽和核酸等。
在免疫组化中，我们需要选择一种合适的抗原，并将其制备成适合免疫反应的浓度和形式。
一般来说，抗原可以采用化学合成法、生物来源法或基因工程技术等方法进行制备。
接下来是抗体制备。
抗体是指能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白，它是免疫组化的核心成分。
在抗体制备过程中，我们需要先确定需要检测的抗原类型和数量，然后选择合适的动物或植物源材料，进行细胞融合或表达纯化等步骤，最终得到高纯度的单克隆抗体。
第三步是预处理。
在进行免疫组化之前，我们需要对样品进行一系列的预处理操作，以去除杂质和干扰物质的影响。
预处理包括样品稀释、缓冲液调整、基质效应消除等步骤。
还需要根据具体的实验设计选择合适的预处理方法和条件。
第四步是染色。
染色是免疫组化的核心步骤之一，它可以将标记有抗体的二抗与待测样本中的抗原结合，形成可视化的斑点分布。
常用的染色方法包括直接荧光法、间接荧光法、免疫印迹法等。
在染色过程中，需要注意染料的选择、浓度和作用时间等因素，以保证染色效果的质量和稳定性。
最后一步是结果分析。
免疫组化的结果分析需要综合考虑多个因素，如阳性对照品的比较、背景值的控制、图像处理和统计分析等。
常用的结果分析方法包括图像分析软件(如ImageJ)和统计分析软件(如SPSS)。
在结果分析过程中，需要注意数据的可靠性和准确性，避免误判和漏判的情况发生。
免疫组化是一项复杂而精细的技术，它需要综合运用多种知识和技能才能完成高质量的实验诊断任务。
希望以上的介绍能对您有所帮助！。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种非常神奇的实验技术，它可以让科学家们观察到细胞内部的微小世界。
那么，这个神奇的过程到底是怎么进行的呢？下面就让我们一起来揭开免疫组化的神秘面纱吧！我们要了解一下什么是免疫组化。
简单来说，免疫组化就是利用特定的抗体去识别和标记细胞表面或者细胞内部的一些蛋白质分子。
这些抗体可以是医生们自己设计的，也可以是从动物或者植物中提取出来的天然抗体。
当这些抗体与目标蛋白结合时，就会发生一些特殊的反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
通过观察这些反应，科学家们就可以了解到细胞内部的结构和功能特点。
接下来，我们来看一下免疫组化的完整步骤及各步原理。
首先是样品制备，也就是把待测的细胞样本取出来进行处理。
这个过程非常重要，因为只有处理好的样品才能够被抗体识别和标记。
接着就是抗体制备，也就是把医生们设计好的抗体合成出来。
这个过程需要一定的技术和经验，因为不同的抗体可能适用于不同的细胞类型和目标蛋白。
然后就是抗原检测，也就是把制备好的抗体加入到样品中，看看它们是否能够与目标蛋白结合。
如果结合了，就会发生一些特殊反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
最后就是结果分析，也就是根据观察到的反应来推断出细胞内部的结构和功能特点。
虽然免疫组化看起来很复杂，但是只要掌握了其中的原理和技巧，就可以轻松地完成实验了。
当然啦，在实际操作过程中也会遇到各种各样的问题和挑战，比如说抗体的选择、样品的质量等等。
但是只要我们保持耐心和信心，相信总会找到解决问题的方法的。
免疫组化是一项非常重要的技术，它可以帮助我们更好地了解细胞内部的结构和功能特点。
虽然它看起来有些复杂难懂，但是只要我们认真学习和实践，相信一定可以掌握其中的精髓并取得优异的成绩！。
免疫组化的操作流程
免疫组化的操作流程免疫组化是一种常用的分子生物学技术，用于检测细胞和组织中特定分子的存在和表达水平。
它可以帮助科学家深入了解细胞和组织的功能和病理改变，是研究和诊断疾病的重要工具之一、以下是免疫组化的操作流程简介：1.样本制备：根据实验目的，选择合适的样本，可以是细胞培养物、冻存组织切片或石蜡包埋的组织切片。
对于细胞培养物，通常直接进行固定处理，而对于组织切片，则需要进行脱水、清洁等预处理。
2.细胞固定：将细胞或组织切片进行固定处理。
常用的固定剂包括甲醛、醋酸乙酯和乙醇等。
固定过程中需要注意不同抗原固定条件的优化，以保持抗原的完整性和免疫反应的灵敏性。
3.抗原恢复：某些抗原在固定过程中可能会丧失其免疫原性，需要进行抗原恢复处理。
常用的恢复方法包括加热诱导抗原修复（如煮沸、蒸汽加热或微波辅助加热）和酶解法等。
4.阻断非特异性结合：在进行免疫组化反应之前需要对样本进行非特异性结合的阻断处理，以减少背景信号。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶和奶粉等。
5.标记抗体：选择合适的一种一抗和二抗，一抗通常是用于识别目标抗原的物质，可以是单克隆抗体或多克隆抗体；二抗是特异性地识别一抗，并携带标记物，如荧光素或酶。
6.免疫反应：将样本与一抗和二抗进行免疫反应。
通常，一抗在特定的条件下与目标抗原结合，然后二抗与一抗结合。
标记物将被聚集在含有目标抗原的区域，形成可视化的免疫复合物。
7.信号增强：为了增强免疫反应的信号，可以使用信号增强剂，如生物素-亲和素体系和酶联免疫吸附法（ELISA）等。
这些方法可以增加检测的灵敏性和特异性。
8.示性显示：为了观察并记录实验结果，可以使用荧光显微镜、电子显微镜或者染色反应等方法来可视化免疫反应。
9.数据分析和解释：根据实验结果进行数据分析和解释。
通过比较免疫反应的强度和位置，可以确定目标抗原的存在和表达水平。
总结起来，免疫组化的操作流程包括样本制备、固定处理、抗原恢复、非特异性结合阻断、标记抗体、免疫反应、信号增强、示性显示以及数据分析和解释等步骤。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
免疫组化流程
免疫组化流程
免疫组化是一种生物技术，用于研究一个或多个蛋白质的交互性及它的细胞上的定位，从而探究蛋白质在复杂的细胞环境中的功能及其作用机制。
免疫组化是以抗体作为特异性
捕获识别分子的标记物，以检测某一特定的蛋白质在细胞中的形态分布，其主要分为三个
步骤：样本处理、抗体淬取和检测荧光。
1. 样本处理：由于免疫组化需要在细胞环境下完成实验，所以在处理样品前，先要
将细胞或组织悬浮，再利用活细胞分离技术将其分离出来，以制备出水平固定、正常形态
的细胞阵列。
2.抗体淬取：抗体淬取是查找蛋白质在细胞中的分布的主要步骤，将具有指示特定蛋
白质的特定抗体喷射在分离的细胞上是大多数实验的基本过程，抗体可以通过多种不同的
方法混合到细胞上，例如管接收、块接收和碰撞接收。
3.检测荧光：检测荧光是一种利用荧光探针标记抗体和膜蛋白，在荧光显微镜上观察
膜蛋白的分布情况，字膜上的膜蛋白和脱离细胞膜的膜蛋白也可以由不同颜色的荧光探针
标记，从而确定膜蛋白的分布情况。
以上三个步骤合在一起，就能完成免疫组化实验，从而检测蛋白质在细胞中的空间分布，免疫组化还可以用来分析蛋白质如何在细胞周围的其他分子之间相互作用。
这个实验
技术具有高灵敏度、可重复性强和节省时间等优点，可以大大提高细胞内目标蛋白质的分
析能力，同时为细胞医学研究和更深入地研究细胞功能提供重要的实验证据。
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细胞免疫组化步骤标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
细胞免疫组化步骤
(2010-06-19 21:40:50)
细胞免疫组化（SABC法）步步看：
细胞冻存够了，且状态良好！咋们就开始做细胞免疫组化吧！开始做实验了，先看要准备些什么吧！
实验准备：
实验用品：
移液枪：1ml、200ul、10ul
枪头：1ml、200ul、10ul
枪头盒：1ml、200ul、10ul
EP管：
湿盒
需要灭菌的东西：培养皿（可以是重复用的）、细胞爬片（多聚赖氨酸处理，并经过环氧乙烷消毒）、常规细胞培养物品。
试剂：
细胞消化液、完全培养基、4%多聚赖氨酸、0.01M PBS（）、3%H2O2（现配）、%Txiton X-100、浓缩型SABC试剂盒（血清封闭液、二抗、三抗《SABC》）、苏木素、ddH2O、DAB 显色试剂盒
操作步骤：
一、细胞爬片的制作
1、细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬（4-5ml）或者密度为1-5x106/ml
2、在灭菌的培养皿中铺上3块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠
3、取细胞悬液分别滴到圆片上，注意不要滴到圆片外，让细胞贴片30min左右
4、30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢）。
二、组化前处理
1、取出培养皿，用PBS漂洗2x2min（PBS可以不灭菌）
2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；
3、PBS漂洗，3x2min；
4、%Txiton X-100 处理（室温）20min；
5、PBS漂洗，3x2min；
6、3%H2O2处理（室温）15min；
7、PBS漂洗，3x2min；
三、组化
1、血清封闭：试剂盒中的血清封闭液，37°C，20min；
2、取出甩干封闭液（不漂洗）；一抗（1：200）（PBS稀释），阴性对照用PBS代替一抗，37°C1-2h或4°C过夜；
3、PBS漂洗，3x2min；
4、二抗孵育：试剂盒中的生物素化...37°C，20min；
5、PBS漂洗，3x2min；
6、SABC孵育：湿盒内37°C，20min；
7、PBS漂洗，3x4min；
8、DAB显色：DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂，我是按照500ul蒸馏水中各加4ul，混匀。
在镜下观察显色情况，在没有背景色的条件下可继续显色。
一般在2-10min
9、自来水冲洗；
10、苏木素复染，15-30s；
11、自来水冲洗；
12、封片剂封片（有细胞一面对着载玻片），镜下观察
若要长期保存片子，可以对爬片进行脱水处理：
70%（1次，1min）-80%（1次，1min）-95%（1次，1min）-无水乙醇（2x3min）-二甲苯（2x1min），观察是否彻底脱水，看观察片子放入二甲苯时，容器周围有白色雾状产生，若有则说明脱水不彻底。
可重新进行！
得到结果：实验组中，细胞浆为棕黄色，细胞和为蓝紫色；阴性细胞中，只有核被染为蓝色，胞浆无色！在此抱歉不能将图片上传，还得用来发文章之用！
在爬片时，圆片不好用镊子夹起，可在圆片之下垫上封口膜，这样操作起来即省事省时，又节约试剂的用量和提高试剂的有效性。