基因工程药物之干扰素的制备流程课件(37页)
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基因工程药物——干扰素的制备PPT课件
•宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） •上市产品：IFN α-2b/安福隆 •表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子 结构和生物活性 •工艺特点：发酵周期短（几个小时），无需变性、复 性过程，获得有活性产品，纯化过程：淘汰抗体亲和 层析
病毒的克星——干扰素！
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
动物无限细胞系培养生产工艺： 上市产品：rhuIFN β-1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：细胞培养，分泌表达 缺点：产量低，成本高,过程严格
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺
我们生活的环境是被微生物包围着的，时时刻刻都要接触到许多 微生物，其中病毒的侵染刺激也不少。科学家猜测，人的血液细 胞里本身就存在干扰素。后来研究证明，这种猜测是有道理的， 通过精密的血液分析，在人和许多动物的细胞中都找到了干扰素。 人们最初想到的是，通过血液制取干扰素。可惜，干扰素在 血液中的含量实在是太少了，用大量的血液才能制得微量的干扰 素，这种生产方式产量低得可怜，自然价格也就十分昂贵。治疗 一个病人的费用高达几万美元，一般百姓只能望“药”兴叹，是 名副其实的“贵族药”，干扰素无法得到普及、推广。 既然蛋白质是干扰素的本质，那么把制造成这种蛋白质的遗 传基因找出来，转入大肠杆菌体内，让它们代劳进行大量生产， 也许能行。经过科学家的试验，干扰素的批量生产便成为可能。 1980年，终于实现了干扰素的批量生产，这是美国科学家的杰作， 他们利用DNA重组技术构建了生产干扰素的基因工程。 如今，运用基因工程技术的国家有：美国、日本、法国、比 利时、德国、英国以及中国等。通过DNA重组、大肠杆菌发酵等方 法，大量获取各种干扰素。经过试验明，这样制得的干扰素对乙 型肝炎、狂犬病、呼吸道发炎、脑炎等多种传染病的病毒都有一 定疗效。干扰素能减缓癌细胞的生长，是很有希望的防癌治癌药 物，具有非常诱人的前影。
病毒的克星——干扰素！
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
动物无限细胞系培养生产工艺： 上市产品：rhuIFN β-1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：细胞培养，分泌表达 缺点：产量低，成本高,过程严格
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺
我们生活的环境是被微生物包围着的，时时刻刻都要接触到许多 微生物，其中病毒的侵染刺激也不少。科学家猜测，人的血液细 胞里本身就存在干扰素。后来研究证明，这种猜测是有道理的， 通过精密的血液分析，在人和许多动物的细胞中都找到了干扰素。 人们最初想到的是，通过血液制取干扰素。可惜，干扰素在 血液中的含量实在是太少了，用大量的血液才能制得微量的干扰 素，这种生产方式产量低得可怜，自然价格也就十分昂贵。治疗 一个病人的费用高达几万美元，一般百姓只能望“药”兴叹，是 名副其实的“贵族药”，干扰素无法得到普及、推广。 既然蛋白质是干扰素的本质，那么把制造成这种蛋白质的遗 传基因找出来，转入大肠杆菌体内，让它们代劳进行大量生产， 也许能行。经过科学家的试验，干扰素的批量生产便成为可能。 1980年，终于实现了干扰素的批量生产，这是美国科学家的杰作， 他们利用DNA重组技术构建了生产干扰素的基因工程。 如今，运用基因工程技术的国家有：美国、日本、法国、比 利时、德国、英国以及中国等。通过DNA重组、大肠杆菌发酵等方 法，大量获取各种干扰素。经过试验明，这样制得的干扰素对乙 型肝炎、狂犬病、呼吸道发炎、脑炎等多种传染病的病毒都有一 定疗效。干扰素能减缓癌细胞的生长，是很有希望的防癌治癌药 物，具有非常诱人的前影。
干扰素生产工艺(共45张PPT)
第二十八页，共45页。
3.4．菌体收集
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体枯燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。
第二十九页，共45页。
4 干扰素的别离纯化工艺过程
4.1、干扰素别离工艺过程 4.2、干扰素的纯化工艺过程
第十页，共45页。
免疫调节活性机制
对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞外表MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞外表表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。
第三十四页，共45页。
〔4〕初级别离
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000 r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
第三十五页，共45页。
4.2、干扰素纯化工艺过程
溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装
第十二页，共45页。
1.5.干扰素生产工艺路线〔1〕
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
基因工程药物的应用领域
肿瘤治疗
基因工程药物在肿瘤治疗 中发挥了重要作用，如干 扰素、白细胞介素等免疫 调节，基因工 程药物提供了有效的治疗 手段，如囊性纤维化、血 友病等。
抗病毒治疗
针对某些病毒性疾病，基 因工程药物可以起到抗病 毒和免疫调节的作用，如 艾滋病、肝炎等。
干扰素的临床应用与疗效
干扰素在临床上主要用于治疗病 毒性感染、肿瘤以及一些自身免
疫性疾病。
通过注射或雾化吸入给药，干扰 素可有效抑制病毒复制，缓解疾 病症状，提高患者生存率和生活
质量。
然而，干扰素也存在一些副作用 ，如发热、肌肉酸痛、肝肾功能 异常等，需要在医生的指导下合
理使用。
03
基因工程制备干扰素的流程
目的基因的表达
在培养条件下，目的基因在细胞内表达，产生相应的蛋白质或核酸产物。
干扰素的分离纯化
分离方法
采用离心、过滤、萃取等方法，将目 的产物从细胞培养液中分离出来。
纯化方法
通过凝胶电泳、色谱技术（如离子交 换、亲和、排阻等）、超滤等方法， 将目的产物进行纯化。
04
干扰素的质量控制与安全性评 价
。
免疫学评价
检测干扰素对机体免疫系统的影响 ，如免疫原性、抗体产生情况等， 以评估其免疫安全性。
不良反应监测
对临床使用过程中出现的不良反应 进行监测和记录，及时处理并分析 原因，确保患者用药安全。
干扰素的稳定性研究
温度稳定性
研究干扰素在不同温度下的稳定性， 确定其保存、运输和使用的适宜温度 范围。
极具挑战性。
生产成本高
基因工程药物的生产通常需要昂 贵的设备和精细的工艺控制，这 导致了干扰素的生产成本居高不
下。
干扰素制备的工艺流程
第十五页
❖５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的 1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于４℃以 12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ。 ６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。 用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。 ７）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L 乙醇铵，充分混匀，加２倍体积（约1ml）乙醇，于室温 放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的 质粒ＤＮＡ。 ８）吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。 ９）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后 可见的痕量乙醇蒸发殆尽。 10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用TE （pH8.0)] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD260 ＝50μg质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于－20℃。
从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
导入大肠杆菌
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
→工程菌
第四页
第五页
一、目的基因的分离与获得
❖ 1. 设计合成干扰素基因的两端引物（完全的），每条引物内 或5‘-端最好有内切酶酶切位点。
❖ 2. 有药物诱导细胞，如佛波酯，使细胞表达干扰素升高。 ❖ 3. 破碎细胞，提取细胞总mRNA. ❖ 4. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA ❖ 5. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干扰素基
❖ 2．种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐 中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速， 控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液
❖５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的 1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于４℃以 12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ。 ６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。 用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。 ７）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L 乙醇铵，充分混匀，加２倍体积（约1ml）乙醇，于室温 放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的 质粒ＤＮＡ。 ８）吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。 ９）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后 可见的痕量乙醇蒸发殆尽。 10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用TE （pH8.0)] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD260 ＝50μg质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于－20℃。
从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
导入大肠杆菌
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
→工程菌
第四页
第五页
一、目的基因的分离与获得
❖ 1. 设计合成干扰素基因的两端引物（完全的），每条引物内 或5‘-端最好有内切酶酶切位点。
❖ 2. 有药物诱导细胞，如佛波酯，使细胞表达干扰素升高。 ❖ 3. 破碎细胞，提取细胞总mRNA. ❖ 4. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA ❖ 5. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干扰素基
❖ 2．种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐 中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速， 控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液
基因工程药物之干扰素的制备流程
基因工程药物之干扰素的制备流程概述干扰素是一类重要的基因工程药物，具有抗病毒、抗肿瘤等作用。
本文将详细介绍干扰素的制备流程，包括干扰素的基因工程、表达和纯化等主要步骤。
1. 干扰素的基因工程干扰素的基因工程是制备干扰素的第一步，可以通过重组DNA技术构建包含干扰素基因的重组质粒。
具体步骤如下：•选择干扰素基因：从已知的干扰素基因库中选择合适的基因序列。
•克隆基因：将选定的干扰素基因通过PCR扩增等技术获得基因片段。
•构建重组质粒：将干扰素基因插入适当的表达载体中，构建重组质粒。
2. 干扰素的表达完成基因工程后，接下来是通过表达系统将干扰素基因表达为蛋白。
常见的表达系统包括大肠杆菌、哺乳动物细胞等，其中大肠杆菌表达系统是最常用的。
表达步骤如下：•转染表达宿主：将构建好的重组质粒导入表达宿主中。
•培养表达宿主：在适当的培养条件下，培养表达宿主，促使干扰素基因表达为蛋白。
•蛋白提取：采用合适的方法提取表达的干扰素蛋白。
3. 干扰素的纯化获得表达的干扰素蛋白后，还需要进行纯化步骤，将目标蛋白从其他杂质中分离出来，确保干扰素的纯度。
常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析等：•亲和层析：利用干扰素与某种亲和基质之间的特异识别作用，实现干扰素的分离纯化。
•离子交换层析：根据蛋白的电荷性质，通过离子交换柱将干扰素与杂质分离。
4. 干扰素的检测与质控最后一步是对制备好的干扰素进行检测与质控，确保其质量符合要求。
常见的检测方法包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western blotting等：•SDS-PAGE凝胶电泳：通过电泳分析蛋白的相对分子质量。
•Western blotting：通过特异抗体的靶向检测确认蛋白的存在。
结语通过上述步骤，干扰素的制备工作完成，得到的干扰素蛋白可以用于临床治疗等用途。
干扰素的基因工程、表达和纯化过程都需要严格控制，保证干扰素的质量和稳定性，为临床应用奠定基础。
基因工程药物-干扰素的制备
基因工程药物-干扰素的 制备
基因工程技术为干扰素的制备带来了革命性的突破。本节将介绍干扰素的概 述以及基因工程在干扰素制备中的应用。
基因工程技术在干扰素制备中的应用
1
基因克隆
通过克隆干扰素基因，实现大规模制备。
2
表达与纯化
将干扰素基因导入宿主细胞，并优化表达和纯化工艺。
3
转化与改性
通过转化和改性技术，提高干扰素的稳定性和疗效。
市场增长潜力
随着生命科学技术的发展，干 扰素药物市场有望持续增长。
疗效和安全性
干扰素在疾病治疗中的广泛应 用为其市场发展提供了机遇。
竞争格局
多家制药公司已进入干扰素药 物市场，竞争激烈。
பைடு நூலகம்
干扰素的生产工艺
步骤1
干扰素基因的克隆和构建。
步骤2
干扰素基因的表达与纯化。
步骤3
干扰素的转化和改性。
常见干扰素药物的种类和特点
α-干扰素
广谱抗病毒活性，治疗病毒感染和肿瘤。
β-干扰素
用于多发性硬化症等自身免疫性疾病的治疗。
γ-干扰素
具有免疫调节和抗肿瘤活性。
干扰素药物的临床应用
抗病毒治疗
干扰素可用于治疗乙型肝炎、丙 型肝炎等病毒感染。
自身免疫疾病
用于多发性硬化症等自身免疫性 疾病的治疗。
抗肿瘤治疗
干扰素可用于肝癌、黑色素瘤等 肿瘤的辅助治疗。
干扰素药物的不良反应与副作用
1 注射部位反应
2 全身反应
局部疼痛、红肿等不良反应常见。
发热、乏力、恶心等全身不适感可能发生。
3 免疫反应
干扰素可引起免疫相关不良反应，如抑制造血功能等。
干扰素药物市场前景分析
基因工程技术为干扰素的制备带来了革命性的突破。本节将介绍干扰素的概 述以及基因工程在干扰素制备中的应用。
基因工程技术在干扰素制备中的应用
1
基因克隆
通过克隆干扰素基因，实现大规模制备。
2
表达与纯化
将干扰素基因导入宿主细胞，并优化表达和纯化工艺。
3
转化与改性
通过转化和改性技术，提高干扰素的稳定性和疗效。
市场增长潜力
随着生命科学技术的发展，干 扰素药物市场有望持续增长。
疗效和安全性
干扰素在疾病治疗中的广泛应 用为其市场发展提供了机遇。
竞争格局
多家制药公司已进入干扰素药 物市场，竞争激烈。
பைடு நூலகம்
干扰素的生产工艺
步骤1
干扰素基因的克隆和构建。
步骤2
干扰素基因的表达与纯化。
步骤3
干扰素的转化和改性。
常见干扰素药物的种类和特点
α-干扰素
广谱抗病毒活性，治疗病毒感染和肿瘤。
β-干扰素
用于多发性硬化症等自身免疫性疾病的治疗。
γ-干扰素
具有免疫调节和抗肿瘤活性。
干扰素药物的临床应用
抗病毒治疗
干扰素可用于治疗乙型肝炎、丙 型肝炎等病毒感染。
自身免疫疾病
用于多发性硬化症等自身免疫性 疾病的治疗。
抗肿瘤治疗
干扰素可用于肝癌、黑色素瘤等 肿瘤的辅助治疗。
干扰素药物的不良反应与副作用
1 注射部位反应
2 全身反应
局部疼痛、红肿等不良反应常见。
发热、乏力、恶心等全身不适感可能发生。
3 免疫反应
干扰素可引起免疫相关不良反应，如抑制造血功能等。
干扰素药物市场前景分析
干扰素制备的工艺流程1
基因工程药物的制造实例
什么是干扰素？
❖ 概念(interferon,IFN)：机体免 疫细胞产生的一类细胞因子，是 机体受到病毒感染时，免疫细胞 通过抗病毒应答反应而产生的一 组结构类似、功能接近的生物调 节蛋白。
干扰素的作用？
❖ 一、抗增生作用：这是干扰素能用于治疗多种肿瘤 的原因。 二、抗病毒作用：当我们的机体感染病毒时，体内 会产生大量的干扰素。 三、免疫调节作用 四、抗纤维化作用 五、干扰素还有抗新血管增生、促进细胞凋亡等多 种功能
❖ 干扰素是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制 品。
·
干扰素的合成
❖ 一、基因工程菌的组建 1、如何构建基因工程菌？也就是DNA重组
克隆单元操作步骤。 切、接、转、增、检
2、切之前还需要做什么？ 获取目的cDNA
❖ 1、干扰素cDNA的获得
全RNA
寡dT—纤维柱
mRNA
产生干扰素的白细胞
5%~23%蔗 糖密度梯度 离心提取12
精提
冻干
成品检定
成品包装
(P73)
制备的过程及要求： （1）发酵 （2）产物提取纯化 （3）质量控制标准和要求（P74）
❖ 小故事
❖ 抉择
一个农民从洪水中救起了他的妻子，他的孩子 却被淹死了。
事后，人们议论纷纷。有的说他做得对，因为 孩子可以再生一个，妻子却不能死而复活。有的说 他做错了，因为妻子可以另娶一个，孩子却不能死 而复活。
❖ 感悟：很多事情根本没有错与对，也容 不得你去细想错与对，如果过于犹豫或过于 在乎别人的想法，你可能什么事也做不成。
我听了人们的议论，也感到疑惑难决：如果只 能救活一人，究竟应该救妻子呢，还是救孩子?
于是我去拜访那个农民，问他当时是怎么想的 。
什么是干扰素？
❖ 概念(interferon,IFN)：机体免 疫细胞产生的一类细胞因子，是 机体受到病毒感染时，免疫细胞 通过抗病毒应答反应而产生的一 组结构类似、功能接近的生物调 节蛋白。
干扰素的作用？
❖ 一、抗增生作用：这是干扰素能用于治疗多种肿瘤 的原因。 二、抗病毒作用：当我们的机体感染病毒时，体内 会产生大量的干扰素。 三、免疫调节作用 四、抗纤维化作用 五、干扰素还有抗新血管增生、促进细胞凋亡等多 种功能
❖ 干扰素是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制 品。
·
干扰素的合成
❖ 一、基因工程菌的组建 1、如何构建基因工程菌？也就是DNA重组
克隆单元操作步骤。 切、接、转、增、检
2、切之前还需要做什么？ 获取目的cDNA
❖ 1、干扰素cDNA的获得
全RNA
寡dT—纤维柱
mRNA
产生干扰素的白细胞
5%~23%蔗 糖密度梯度 离心提取12
精提
冻干
成品检定
成品包装
(P73)
制备的过程及要求： （1）发酵 （2）产物提取纯化 （3）质量控制标准和要求（P74）
❖ 小故事
❖ 抉择
一个农民从洪水中救起了他的妻子，他的孩子 却被淹死了。
事后，人们议论纷纷。有的说他做得对，因为 孩子可以再生一个，妻子却不能死而复活。有的说 他做错了，因为妻子可以另娶一个，孩子却不能死 而复活。
❖ 感悟：很多事情根本没有错与对，也容 不得你去细想错与对，如果过于犹豫或过于 在乎别人的想法，你可能什么事也做不成。
我听了人们的议论，也感到疑惑难决：如果只 能救活一人，究竟应该救妻子呢，还是救孩子?
于是我去拜访那个农民，问他当时是怎么想的 。
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
基因工程药物之干扰素的制备流程课件•引言•基因工程药物制备基础•干扰素制备流程详解•质量控制与安全性评估目•临床应用与市场前景•总结与展望录干扰素的基因克隆与表达目的基因的获取从人或动物细胞中提取干扰素基因，或通过化学合成方法获得。
基因克隆将目的基因插入到合适的载体中，如质粒、病毒等，构建重组DNA分子。
基因表达将重组DNA分子导入到宿主细胞中，如大肠杆菌、哺乳动物细胞等，进行基因表达，产生干扰素蛋白。
通过机械、化学或酶解等方法破碎细胞，释放干扰素蛋白。
细胞破碎初步纯化高度纯化利用离心、过滤、层析等技术对干扰素蛋白进行初步纯化，去除杂质和宿主细胞蛋白。
通过高效液相色谱、凝胶过滤层析等技术对干扰素蛋白进行高度纯化，获得高纯度的干扰素制品。
030201干扰素的分离纯化干扰素的制剂与质量控制制剂工艺将纯化后的干扰素蛋白进行制剂加工，如冻干、分装等，制备成适合临床使用的干扰素制剂。
质量控制对干扰素制剂进行质量检测和控制，包括外观、纯度、活性、安全性等方面的检测，确保产品质量符合规定标准。
基因工程药物是指利用基因工程技术生产的药物，包括基因重组蛋白质、基因治疗剂、基因疫苗等。
具有高效、特异性强、安全性高等优点，已成为现代医药产业的重要组成部分。
基因工程药物概述特点定义干扰素介绍定义干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性的蛋白质，是机体天然免疫的重要组成部分。
分类根据结构和功能不同，干扰素可分为α、β、γ等多种类型，其中α-干扰素是临床上应用最广泛的一种。
制备流程研究背景随着重组DNA技术的不断发展，利用基因工程技术生产干扰素已成为可能。
市场需求干扰素具有广泛的临床应用价值，市场需求量大，因此研究其制备流程具有重要意义。
基因重组通过体外DNA重组技术，将目的基因与载体DNA进行切割、拼接，构建重组DNA分子。
基因表达将重组DNA分子导入宿主细胞，利用宿主细胞的转录和翻译系统，表达出具有特定生物学活性的蛋白质分子。
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气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入
发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线
检查，控制杂菌
16
❖ 3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接 种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转 速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃， pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液 杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至 15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中， 加入冰块使温度迅速降至10℃以下。
超滤膜，0.005 M缓冲液。
27
(3)无菌过滤分装
0.22 μm滤膜过滤干扰素溶液 ❖ 分装 ❖ －20℃以下的冰箱中保存。
28
(4)检测项目
❖ 干扰素鉴别试验 ❖ 干扰素效价测定 ❖ 蛋白质含量，纯度测定，分子量 ❖ 宿主残余蛋白、残余DNA ❖ 干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列 ❖ 其他：热原，内毒素，残留抗生素
20
(2)预处理-沉淀
❖ 加絮凝剂聚乙烯亚胺: 2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。
❖ 加凝聚剂醋酸钙溶液: 2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行 沉淀。
21
(3)离心
❖ 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min ❖ 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 ❖ 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
24
(1) 溶解粗干扰素
❖ 配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和10 ku 超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。
❖ 检查: 缓冲液的pH值和电导值。 ❖ 溶解：2℃～10℃，匀浆，完全溶解。
25
(2) 沉淀与疏水层析
❖ 等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白， 离心收集上清液。
区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。
30
❖ （5）相对分子量测定
❖
还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相
对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对
分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比
较，误差不得高于10%。
❖ （6）残余外源性DNA含量测定
❖
用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外
与批之间应一致。
❖ （11）等电点测定 等电聚焦电泳。
❖ （12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质 试验。
32
成品检定
❖ （1）物理性状
❖
冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得
含有肉眼可见不溶物。
❖ （2）鉴别试验
❖
应用ELISA或中和试验检定。
❖ （3）水分测定
❖
用卡氏法，应低于3%。
❖ 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金 淋巴瘤。
❖ 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） ❖ 多发性硬化症 rhuIFNβ
6
2 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺
7
干扰素生产工艺路线
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
12
四、受体菌的筛选
由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体 重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆 载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况
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五、分析保存
对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保存菌种。
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干扰素的发酵工艺过程
启开种子 精提 冻干
制备种子液 半成品制备
成品检定
发酵培养 半成品检定
成品包装
粗提 分装
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❖ 1．菌种培养
取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种
子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30℃，
pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定
和发酵液杂菌检查。
❖ 2．种子罐培养
将已活化的菌种接入装有30L培养基的
种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通
源性DNA应低于100pg。
❖ （7）残余血清IgG含量测定
❖
在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项
检定。
❖ （8）残余抗生素活性测定
❖
半成品中不应有抗生素活性存在。
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❖ （9）紫外光谱扫描
❖
检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳
米。
❖ （10）肽图测定
❖
用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批
1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类
◆ I 型干扰素：IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω
来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 、免疫调节(较弱） 其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。
◆ II 型干扰素：干扰素γ（IFN)
来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节
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存在的问题：
（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞 争， 严重影响产业的健康发展。 （2）融资渠道单一、产业发展资金不足。 （3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。 （4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮 乏。
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37
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半成品检定
❖ （1）效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基本检测
系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。
❖ （2）蛋白质含量测定
❖
福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋
白为标准。
❖ （3）比活性
❖
效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。
❖ （4）纯度
❖
电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一
❖ （4）无菌试验
❖
同半成品。
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❖ （5）热原质试验
❖
同半成品检定。
❖
❖ （6）干扰素效价测定
❖
同半成品检定，效价不应低于标示量。
❖ （7）安全试验
❖
取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注射
量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚
鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。
EcoR I
BamH I
EcoR I
BamH I
2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后，导入受体细胞，筛选
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三、重组体引入宿主细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件 下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。
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基因工程菌的制备
❖ 目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
重组体导入大肠杆菌K12
→
→
受体菌的培养及筛选 从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
导入大肠杆菌
→
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
工程菌
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一、目的基因的分离与扩增
❖ 1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA ❖ 2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶
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提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）
2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（HuIFN同来源的干 扰素
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1.2 重组干扰素的临床应用
❖ 广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。
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3.1 干扰素分离工艺过程
❖ 菌体裂解 ❖ 预处理 ❖ 初级分离
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(1)菌体裂解
❖ 裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5） ❖ 使用保护剂：EDTA，PMSF。 ❖ 破碎菌体：2厘米以下的碎块 ❖ 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr ❖ 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
基因工程药物 --干扰素的制备
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1 什么是干扰素
概念(interferon,IFN)：机体 免疫细胞产生的一类细胞因 子，是机体受到病毒感染时， 免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、 功能接近的生物调节蛋白。
根据分子结构和抗原性的差 异分为α、β、γ、ω等4个类 型。
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1.1天然干扰素的分类
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（4）初级分离
❖ 盐析: 硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 ❖ 离心：连续流离心机，16000 r/min ❖ 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
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3. 2、干扰素纯化工艺过程
❖ 溶解粗干扰素 ❖ 沉淀与疏水层析
阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 ❖ 无菌过滤分装
取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人
每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存
活，说明成品合格。
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4 国内基因工程药物产业发展状况
我国的生物技术药物却一直苦于缺乏 自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿 制药，创新药物的开发一直未能打开局面。
一种新药从研发到投放市场，投入大 约为30亿~60亿美元。