干扰素制备的工艺流程1
重组人干扰素α2b的制备研究
生物技术进展２０１６年㊀第６卷㊀第３期㊀２１２~２１８ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０１６￣０１￣２４ꎻ接受日期:２０１６￣０３￣１５㊀作者简介:梁果义ꎬ副研究员ꎬ主要从事生物制品的研发ꎮＴｅｌ:０１０￣６８７２７１２７ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｌｉａｎｇｇｕｏｙｉ＠ｓｌｐｈａｒｍ.ｃｏｍ.ｃｎ重组人干扰素α２ｂ的制备研究梁果义ꎬ㊀刘晓航北京双鹭药业股份有限公司ꎬ北京１０００４３摘㊀要:为了获得高活性高纯度的ｒｈＩＦＮα２ｂꎬ对重组人干扰素α２ｂ进行克隆㊁表达ꎬ并深入研究了其纯化工艺ꎮ采用重叠延伸ＰＣＲ法合成了编码ＩＦＮα２ｂ的基因ꎬ用ＤＮＡ重组技术构建了原核表达载体ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂꎬ获得了稳定的工程菌种ꎮ发酵产物通过破菌㊁洗涤获得包涵体ꎬ再经过变性㊁复性㊁离子交换层析和凝胶过滤层析的纯化ꎬ得到ｒｈＩＦＮα２ｂ纯品ꎬ其比活可达１ˑ１０８ＩＵ/ｍｇꎮ实验结果为进一步开展临床前研究和长效制剂奠定了基础ꎮ关键词:干扰素α２ｂꎻ制备ꎻ表达ꎻ纯品ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１６.０３.１１ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎα２ｂＬＩＡＮＧＧｕｏ￣ｙｉꎬＬＩＵＸｉａｏ￣ｈａｎｇＣｏｍｐａｎｙＰｒｏｆｉｌｅｏｆＢｅｉｊｉｎｇＳＬＰｈａｒｍꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００４３ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα２ｂｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｃｌｏｎｉｎｇꎬｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｏｂｔａｉｎｉｎｇｒｈＩＦＮα２ｂｗｉｔｈｈｉｇｈａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｐｕｒｉｔｙ.ＯｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｆｏｒＩＦＮα２ｂ.ＡｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｖｅｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｒｈＩＦＮα２ｂｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ.ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ.ｃｏｌｉｓｔｒａｉｎＤＨ５α.Ａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎꎬｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅｌｌｓｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｎｄｌｙｓｅｄ.ＦｉｎａｌｌｙꎬｔｈｅｒｈＩＦＮα２ｂｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎꎬｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎꎬｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬａｎｄｉｔｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｒｅａｃｈｅｄ１ˑ１０８ＩＵ/ｍｇ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗａｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｌａｙｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｌｏｎｇ￣ａｃｔｉｎｇｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα２ｂꎻｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎꎻｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇꎻｐｕｒｉｆｙ㊀㊀干扰素是一类重要的细胞因子ꎬ具有普遍的生物学功能ꎬ可以抵抗病毒感染ꎬ影响细胞生长㊁分化和调节生物机体免疫的功能ꎮ它在疾病的临床治疗上使用数年ꎬ在治疗病毒性感染㊁癌症和多发性免疫疾病等方面都有广泛的应用ꎮ目前世界上包括中国在内的５０多个国家已批准干扰素上市ꎬ治疗约３０多种疾病ꎬ如慢性乙型肝炎(ＣＨＢ)㊁ＳＡＲＳ病毒㊁毛细胞白血病㊁尖锐湿疣㊁艾滋病患者的卡波济肉瘤㊁慢性肉芽肿瘤㊁病毒性红眼病㊁病毒性角膜炎㊁唇和生殖器疱疹㊁水痘㊁慢性宫颈炎和巨细胞病毒病[１~４]等ꎮ目前所报道过的干扰素按照细胞结构和来源可分为α㊁β㊁γ干扰素３个型别ꎬα干扰素又称人白细胞干扰素ꎬ它是由Ｂ淋巴细胞和单核细胞产生的ꎮα干扰素亚型至少有２３种ꎬ成簇分布于人第９号染色体的ｐ２２区ꎬ总长度１~２ｋｂꎬ没有内含子ꎮ干扰素α２ｂ是由１６５个氨基酸残基组成的单链多肽[３]ꎬ理论值分子量为１９２３７Ｄａꎬ含４个Ｃｙｓ残基ꎬ形成２个分子内二硫键(Ｃｙｓ１和Ｃｙｓ９８㊁Ｃｙｓ２９和Ｃｙｓ１３８)ꎬ其中Ｃｙｓ２９和Ｃｙｓ１３８之间的二硫键对ＩＦＮα２ｂ形成特定的立体结构和表现生物活性非常重要[５ꎬ６]ꎮＩＦＮα２ｂ等电点在ｐＨ５~６之间ꎬ在ｐＨ２.５的溶液中稳定ꎬ在０.１％ＳＤＳ溶液中稳定ꎬ对热亦稳定ꎬ对各种蛋白酶敏感ꎮ天然α干扰素无糖基化位点ꎮ目前已有４０ｋＤａＰＥＧ修饰的ＩＦＮ￣α２ａ(Ｐｅｇａｓｙｓ )和１２ｋＤａＰＥＧ修饰的ＩＦＮ￣α２ｂ. All Rights Reserved.(ＰｅｇＩｎｔｒｏｎ Ｓｈｅｒｉｎｇ￣Ｐｌｏｕｇｈ)应用于临床ꎬ这两类产品都能够延长ＩＦＮ￣α在体内的半衰期ꎮ然而ꎬＰＥＧ修饰的ＩＦＮ￣α在体外的抗病毒活性较之未经修饰的ＩＦＮ￣α都有所降低[７]ꎮ修饰过的干扰素延长半衰期ꎬ改进药物治疗的有效性和耐受性ꎮ干扰素的制备是干扰素药物研发的一个难点ꎮ虽然包涵体复性过程繁琐㊁收率低ꎬ但是表达量高㊁成本低㊁生产周期短ꎬ干扰素通常以大肠杆菌包涵体的形式表达ꎮ本研究通过基因工程方法拼接成功构建了原核表达载体ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂꎬ获得了工程菌种ꎬ改进了纯化方法ꎬ加入凝胶过滤层析ꎬ制备高纯度的样品ꎬ提高了生物活性ꎬ以期为进一步开展药学研究和长效制备提供依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验材料ＤＨ５α感受态细胞为全式金生物技术有限公司产品ꎬ质粒ｐＢＶ２２０为本实验室保存ꎬＤＮＡ片段由北京三博远志生物技术有限责任公司合成ꎻ核酸纯化试剂盒㊁质粒提取试剂盒为Ｏｍｅｇａ公司产品ꎻ低分子量核酸标记物ＴａＫａＲａＤＬ２０００㊁ｄＮＴＰ㊁各种限制性内切酶㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶为ＴａＫａＲａ公司产品ꎻｐｆｕＤＮＡ聚合酶为ＴｉａｎＧｅｎ公司产品ꎻ氨苄青霉素为石药集团产品ꎻＴｒｉｓ为Ｐｒｏ￣ｍｅｇａ公司产品ꎻＳＤＳ㊁丙烯酰胺㊁甲叉双丙烯酰胺为Ｓｉｇｍａ公司产品ꎻＴｒｙｐｔｏｎｅ㊁Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ为ＯＸＩＯＤ公司产品ꎻ结晶紫为北京旭东化工厂产品ꎻＲＰＭＩ１６４０为ＧＢＩＣＯ公司产品ꎻ其余为国产分析纯试剂ꎮＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ㊁ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ￣１００均为ＧＥ公司产品ꎬ其他溶液配方见表１ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀ＩＦＮα２ｂＤＮＡ片段的合成㊀ＤＮＡ片段的设计参考魏开坤等[８]重组人干扰素α２ｂ的基因序列ꎬ根据实验设计把α２ｂ全基因分成１６个片段ꎬ即Ａ１~Ａ１６个序列(表２)ꎬ接着以顺序拼接成整条寡核苷酸ꎬ相临的片段之间均包含一部分重叠序列ꎬ并在Ｎ末端和Ｃ末端相应导入限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ㊁ＳａｌⅠ的酶切位点ꎮ表１㊀本研究所用到的溶液配方Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｏｌｕｔｉｏｎｆｏｒｍｕｌａｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ.溶液名称配方ＬＢ培养基胰蛋白胨１０ｇ/Ｌꎬ酵母提取物５ｇ/ＬꎬＮａＣｌ１０ｇ/ＬꎬｐＨ７.５裂解缓冲液２０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ４ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡꎬｐＨ８.０包涵体洗涤液Ａ２０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ１ｍｏｌ/Ｌ尿素ꎬ１％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬ０.１５ｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ２ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡꎬｐＨ８.０包涵体洗涤液Ｂ２０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ２ｍｏｌ/Ｌ尿素ꎬ１％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬ０.１５ｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ２ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡꎬｐＨ８.０变性缓冲液１００ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ６ｍｏｌ/Ｌ盐酸胍ꎬ０.１５％β￣巯基乙醇复性缓冲液２０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ０.５ｍｏｌ/Ｌ甘氨酸ꎬ０.１５％ＰＥＧ￣６０００ꎬ４ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡꎬｐＨ８.０平衡缓冲液Ａ１０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬｐＨ８.０洗脱缓冲液Ａ１０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ０.２ｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬｐＨ８.０平衡缓冲液Ｂ２０ｍｍｏｌ/ＬＰＢꎬ０.１５ｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬｐＨ７.０㊀㊀利用重叠延伸ＰＣＲ法进行ｒｈＩＦＮα２ｂ全基因合成ꎮ延伸ＰＣＲ法扩增ＩＦＮα２ｂ流程:①将片段Ａ１~Ａ４㊁Ａ５~Ａ８㊁Ａ９~Ａ１２㊁Ａ１３~Ａ１６四四混合ꎬ配制ＰＣＲ反应混合物进行ＰＣＲ延伸ꎮ将Ａ１~Ａ４㊁Ａ５~Ａ８㊁Ａ９~Ａ１２㊁Ａ１３~Ａ１６各组ＰＣＲ产物标记为Ｂ１㊁Ｂ２㊁Ｂ３㊁Ｂ４ꎮ②将Ｂ１㊁Ｂ２作为核心模板ꎬＡ１㊁Ａ８作为两头的引物ꎻ将Ｂ３㊁Ｂ４作为核心模板ꎬＡ９㊁Ａ１６作为两头的引物ꎻ配制ＰＣＲ反应混合物ꎬ进行ＰＣＲ延伸ꎮ将Ｂ１㊁Ｂ２㊁Ａ１㊁Ａ８组和Ｂ３㊁Ｂ４㊁Ａ９㊁Ａ１６组ＰＣＲ产物标记为Ｃ１㊁Ｃ２ꎮ将Ｃ１㊁Ｃ２作为核心模板ꎬＡ１㊁Ａ１６作为两头的引物ꎬ配制ＰＣＲ反应混合物ꎬ进行ＰＣＲ循环ꎮ１％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ最终扩增产物[９]ꎮ１.２.２㊀表达质粒ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂ的构建㊀通过３１２梁果义ꎬ等:重组人干扰素α２ｂ的制备研究. All Rights Reserved.表２㊀α２ｂ基因片段序列Ｔａｂｌｅ２㊀Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆα２ｂｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔ.序列名称序列(５ᶄң３ᶄ)Ａ１５ᶄ￣ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＡＣＣＣＡＣＴＣ￣３ᶄＡ２５ᶄ￣ＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＣＧＧＣＡＧ￣３ᶄＡ３５ᶄ￣ＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＴＣＧＴＡＴＣＴＣＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＡＧ￣３ᶄＡ４５ᶄ￣ＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＡＣＧＧＴＣＴＴＴＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＣＡＧ￣３ᶄＡ５５ᶄ￣ＧＧＴＴＴＣＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＧＴＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣ￣３ᶄＡ６５ᶄ￣ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣＡＴＴＴＣＧＴＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧ￣３ᶄＡ７５ᶄ￣ＡＡＡＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＣＣＡＡＡＧＡＣＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣ￣３ Ａ８５ᶄ￣ＧＧＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＴＴＴＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＴＧＧ￣３ᶄＡ９５ᶄ￣ＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣ￣３ᶄＡ１０５ᶄ￣ＧＧＴＴＴＣＧＧＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＧＴＴＣＡＡＣ￣３ᶄＡ１１５ᶄ￣ＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＡＣＣＧＡＡＡＣＣＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣ￣３ᶄＡ１２５ᶄ￣ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧＧＴＧＡＴＡＣＧＣＴＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＡＧＡＧＴＣ￣３ᶄＡ１３５ᶄ￣ＣＧＴＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＴＣＣＧＴＧＣＧＣＴＴＧＧＧＡＡＧ￣３ᶄＡ１４５ᶄ￣ＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＣＧＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＧＣＡＣＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＧＣＡＣＧＧＡＧ￣３ᶄＡ１５５ᶄ￣ＡＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＴＣＴＧＣＧＴＴＣ￣３ᶄＡ１６５ᶄ￣ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴＡＧＡＡＣＧＣＡＧＡＧＡＴＴＣＣＴＧＣ￣３ᶄ琼脂糖凝胶电泳回收目的基因ＩＦＮα２ｂ的ＰＣＲ产物ꎬ与表达载体ｐＢＶ２２０进行ＥｃｏＲⅠ与ＳａｌⅠ双酶切ꎬ于３７ħ酶切３ｈꎬ回收备用ꎮ目的片段经过内切酶ＥｃｏＲⅠ与ＳａｌⅠ消化ꎬ将消化后的目的片段ＩＦＮα２ｂ和同样酶切后载体ｐＢＶ２２０的连接体系混合ꎬ产物于４ħ孵育过夜ꎮ取部分连接体系热转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎮ３２ħ孵育０.５ｈꎬ涂布于含相应抗性的ＬＢ平板ꎬ平板置于超净台晾干ꎮ３２ħ培养箱过夜培养ꎮ挑取克隆ꎬ经过质粒小量制备后ꎬ进行ＥｃｏＲⅠ与ＳａｌⅠ双酶切ꎬ于３７ħ酶切３ｈꎬ１％琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应产物ꎮ阳性菌落菌种保藏后测序ꎮ１.２.３㊀重组ｐＢＶ２２０￣ｒｈＩＦＮα２ｂ的表达验证㊀将阳性菌落按照１％比例接种到含５０μｇ/ｍＬ氨苄青霉素的新鲜ＬＢ培养基中ꎬ于３２ħꎬ２００ｒ/ｍｉｎ培养３ｈꎬ升温至４２ħꎬ继续培养４ｈꎮ于６０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ收获菌体沉淀ꎬ向沉淀中加入１００μＬ水重悬ꎬ取１０μＬ加入１０μＬ２ˑＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沸水浴５ｍｉｎꎬ取１０μＬ上样ꎮ把上述方法诱导表达后获得的菌体沉淀重悬ꎬ超声破碎ꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ分别取上清㊁沉淀ꎬ１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳ꎬ观察目的蛋白在上清和沉淀中的表达情况ꎮ１.２.４㊀基因工程菌ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂ/ＤＨ５α的发酵培养㊀一级种子培养:将１５０ｍＬ甘油保存菌接种于装有１００ｍＬＬＢ液体培养基(Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ１００μｇ/ｍＬ)的２５０ｍＬ三角瓶中ꎬ于３２ħꎬ２００ｒ/ｍｉｎ培养约１０ｈꎮ二级种子培养:以１２０μＬ/２００ｍＬ的接种量接种一级种子培养液于１０个装有２００ｍＬＬＢ液体培养基(含氨苄青霉素１００μｇ/ｍＬ)的５００ｍＬ三角瓶中ꎬ于３２ħ㊁２００ｒ/ｍｉｎ培养约１２ｈꎮ发酵:发酵罐工作容积:２０Ｌꎻ种子液接种量:１０％ꎬ共２Ｌꎮ按１０％接种量将二级种子培养液接种到３０Ｌ发酵罐中进行培养ꎬ发酵体积为２０ＬꎬｐＨ控制在７.００ʃ０.０５ꎬ通过发酵控制系统自动补加５ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ调节ｐＨꎮ温度控制在３２ħꎬ溶氧控制在３０％以上ꎬ培养过程中可通过提高通气量和搅拌速度来提高溶氧量ꎮ发酵过程中定时取样检测细菌密度和培养基中的葡萄糖含量ꎮ培养菌株至ＯＤ６００约为３.５时ꎬ培养基中的葡萄糖几乎消耗完毕ꎬ以２ｍＬ/ｍｉｎ的流速滴加补料４１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.液ꎬ培养至ＯＤ６００约为４时ꎬ迅速升温至４２ħꎬ热诱导表达３ｈꎬ离心收集湿菌体ꎮ１.２.５㊀重组蛋白ｒｈＩＦＮα２ｂ的分离纯化[１０]㊀表达后菌液的处理:按２００ｇ发酵湿菌体加４Ｌ起始缓冲液ꎬ均匀悬浮细菌后ꎬ进行超声破碎ꎬ１Ｌ/次ꎬ１２００Ｗꎬ超声１ｓꎬ间隙１ｓꎬ４０ｍｉｎꎮ８０００ｒ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ收集包涵体沉淀ꎮ将包涵体沉淀分别用包涵体洗涤液Ａ㊁包涵体洗涤液Ｂ㊁起始缓冲液洗涤一次ꎬ８０００ｒ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ收集包涵体ꎮ将包涵体沉淀用包涵体缓冲液溶解(１０ｍＬ/ｇ包涵体沉淀)ꎬ４ħ搅拌过夜ꎬ８０００ｒ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ收集上清液ꎬ即为包涵体变性液ꎮ包涵体蛋白的复性:在缓慢磁力搅拌下ꎬ将包涵体变性液以１ʒ１００(Ｖ/Ｖ)加入到复性缓冲液中ꎬ完全加入后静置４ｈꎮ复性蛋白的透析:将复性蛋白装入处理好的透析袋(截留分子量为１４ｋＤａ)ꎬ完全浸入２０倍样品体积的１０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬｐＨ８.０透析液中透析２４ｈꎮ其间可更换３次透析液ꎮ透析完成后收集蛋白溶液ꎬ８０００ｒ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ收集上清液备用ꎮＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析:用平衡缓冲液Ａ对层析柱进行平衡ꎬ使得流出液的电导㊁ｐＨ和平衡缓冲液Ａ一样ꎬ将透析离心后所获得的目的样品上样ꎮ用平衡缓冲液Ａ淋洗ꎬ去除非特异性吸附的蛋白ꎮ用洗脱缓冲液Ａ进行洗脱ꎬ流速为０.５ｍＬ/ｍｉｎꎮ用１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳对收集的样品进行检测ꎮ把收集的样品用超滤的方法进行浓缩处理ꎬ准备下一步纯化ꎬ选择截留分子量为５０００ｋＤａ的膜包ꎮＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ￣１００凝胶过滤层析:用平衡缓冲液Ｂ对层析柱进行平衡ꎬ使得流出液的电导㊁ｐＨ和平衡缓冲液Ｂ一样ꎬ将超滤浓缩后所获得的目的样品上样ꎮ用平衡缓冲液Ｂ进行洗脱ꎬ流速为１ｍＬ/ｍｉｎꎬ分段收集ꎮ用１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳对收集的样品进行检测ꎮ１.２.６㊀蛋白含量测定㊀蛋白质含量测定使用Ｌｏｗｒｙ法(即Ｆｏｌｉｎ￣酚法)[１１]ꎮ精密称取牛血清白蛋白ꎬ用水溶解成不同的浓度作为标准蛋白质溶液ꎬ取一定量的样品适当稀释ꎬ测得样品吸光度ꎮ以标准品蛋白质浓度为横坐标ꎬ吸光度为纵坐标绘制标准曲线ꎬ将样品对应的吸光度代入直线回归方程ꎬ计算样品的蛋白质含量ꎮ１.２.７㊀体外生物活性测定㊀采用细胞病变抑制法测定干扰素的体外生物学活性[１２]ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀重叠延伸ＰＣＲ法合成ＩＦＮα２ｂｃＤＮＡ经过三步重叠ＰＣＲꎬ最终检测结果见图１ꎬ可见ＰＣＲ产物在５００ｂｐ左右出现了谱带ꎮ条带清晰ꎬ大小与设计相同ꎬ可用于后续构建实验ꎮ图１㊀干扰素α２ｂ的ＰＣＲ扩增Ｆｉｇ.１㊀ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＩＦＮα２ｂ.Ｍ:ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒꎻ１:重叠ＰＣＲ扩增的ＩＦＮα２ｂ２.２㊀提取质粒后进行双酶切对阳性重组子的验证挑取转化后平板中的克隆子ꎬ培养后利用质粒提取试剂盒提取质粒ꎬ用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切ꎬ在５００ｂｐ左右的位置ꎬ泳道２出现了谱带(图２)ꎬ证明质粒中插入基因与目的基因大小相同ꎬ说明质粒构建成功ꎮ２.３㊀对阳性克隆重组子的诱导表达验证对阳性菌落进行测序ꎬ测序结果与设计相同ꎮ进行诱导表达验证ꎬ并进行１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测ꎬ结果见图３ꎮ与诱导前相比ꎬ诱导后蛋白表达明显ꎬ且与α２ｂ标准品大小相同ꎬ证明菌种可表达α２ｂ蛋白ꎮ分别取菌体沉淀超声破碎后的上清和沉淀进行１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测ꎬ结果证实其为包涵体表达ꎮ２.４㊀基因工程菌ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂ/ＤＨ５α的发酵培养３批发酵的湿菌体进行１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析ꎬ电泳图谱见图４ꎮ可见蛋白表达明显ꎬ该菌种５１２梁果义ꎬ等:重组人干扰素α２ｂ的制备研究. All Rights Reserved.图２㊀ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂ酶消化Ｆｉｇ.２㊀ＥｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂ.Ｍ:ＤＬ１００ＰｌｕｓＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切ｐＢＶ２２０ꎻ２:ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂ图３㊀ｐＢＶ２２０￣ｒｈＩＦＮα２ｂ诱导表达Ｆｉｇ.３㊀ＩｎｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐＢＶ２２０￣ｒｈＩＦＮα２ｂ.１:未经诱导的ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂꎻ２:热诱导的ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂꎻ３:标准蛋白ｒｈＩＦＮα２ｂ图４㊀ｒｈＩＦＮα２ｂ表达的电泳检测Ｆｉｇ.４㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｈＩＦＮα２ｂｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙ１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ.Ｍ:Ｍａｒｋｅｒꎻ１~３:３批发酵菌体的总蛋白可用于发酵制备α２ｂ蛋白ꎮ电泳检测３批样品中ꎬ在分子量２０ｋＤａ左右的位置都有明显的一条蛋白条带ꎬ同目的蛋白的分子量一致ꎬ此发酵工艺稳定ꎬ能够获得目的蛋白ꎮ２.５㊀重组蛋白ｒｈＩＦＮα２ｂ的分离纯化２.５.１㊀表达后菌液处理的电泳分析结果㊀按实验１.２.５方法ꎬ菌种经发酵培养ꎬ菌体破碎ꎬ包涵体洗涤ꎬ各阶段进行１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析ꎬ电泳图谱见图５ꎮｒｈＩＦＮα２ｂ的分子量为１９.２ｋＤａꎬ在对照品２２ｋＤａ和１４ｋＤａ之间有一条明显的蛋白条带ꎬ即为ｒｈＩＦＮα２ｂ的表达产物ꎮ目的蛋白存在于离心沉淀中ꎬ破菌上清中没有ꎬ说明目的蛋白以包涵体形式表达ꎮ图５㊀ｒｈＩＦＮα２ｂ包涵体的电泳检测Ｆｉｇ.５㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｈＩＦＮα２ｂｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ.Ｍ:低分子量蛋白Ｍａｒｋｅｒꎻ１:重组大肠杆菌的总蛋白ꎻ２:重组大肠杆菌的可溶性蛋白ꎻ３~５:经包涵体洗涤液Ａ~Ｃ冲洗后的重组大肠杆菌非可溶性蛋白２.５.２㊀ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析及电泳分析结果㊀将ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ离子交换层析洗脱收集的样品做１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测ꎬ观察每一步层析的洗脱情况及其纯度ꎬ电泳结果见图６ꎮ图６㊀ｒｈＩＦＮα２ｂ离子交换层析的电泳检测Ｆｉｇ.６㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｈＩＦＮα２ｂｏｎＩＥＣ.Ｍ:低分子量蛋白Ｍａｒｋｅｒꎻ１:ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ峰值蛋白２.５.３㊀ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ￣１００凝胶过滤层析及电泳分析结果㊀按照ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ￣１００凝胶过滤层析的蛋白出峰情况分段收集的样品进行１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测ꎬ观察各个样品中蛋白条带的分布情况及其纯度ꎬ电泳图谱见图７ꎮ分析ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ洗脱液的电泳检测结果ꎬ除了目的蛋白条带还有２~３条杂蛋白ꎬ而且分子量大于目的蛋白ꎬ可以尝试凝胶过滤层析的方法进一步分离ꎮ凝胶过滤层析分段６１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.收集１０瓶ꎬ第７~１０瓶没有杂蛋白ꎬ可以合并保存ꎮ２.５.４㊀蛋白质收率㊀蛋白质粗提过程中ꎬ每取２００ｇ湿菌体ꎬ获包涵体５０ｇꎬ包涵体变性液５００ｍＬꎬ可分批复性ꎮ每２００ｇ湿菌体可获ｒｈＩＦＮα２ｂ纯品２１８ｍｇꎮ蛋白质复性后各步蛋白含量㊁活性等情况见表３(３批复性结果)ꎮ对比３批的实验结果ꎬ生物活性都达到了１ˑ１０８ＩＵ/ｍｇꎬ目的蛋白活性稳定ꎬ回收率可达４.０％以上ꎬ此工艺可行ꎬ能够用于放大生产工艺的开发ꎮ图７㊀ｒｈＩＦＮα２ｂ凝胶层析的电泳检测Ｆｉｇ.７㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｈＩＦＮα２ｂｏｎＧＦＣｂｙ１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ.１~１０:分段收集的蛋白片段表３㊀ｒｈＩＦＮα２ｂ纯化结果Ｔａｂｌｅ３㊀ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｒｈＩＦＮα２ｂ.Ｌｏｔ方法总体积(ｍＬ)蛋白质含量(ｍｇ/ｍＬ)蛋白质(ｍｇ)活性(ˑ１０１０ＩＵ)比活(ˑ１０７ＩＵ/ｍｇ)蛋白产量(％)活性产量(％)纯化(Ｘ￣ｆｏｌｄ)１２３复性４７０００.１７５８２３１.９８２.４５００００.１７０８５０２.１３２.５４５０００.１９５８７８２.０２２.３１２３离子交换层析１９００.８７２１６６１.３３８.０２０.２６７.２３.３２０００.８１６１６３１.３２８.１１９.２６２.０３.２２４００.８０８１９４１.５１７.８２２.１７４.８３.４１２３凝胶过滤层析１０２０.３２１３２.７０.３６１１４.０１８.２４.６１１００.３１９３５.１０.３５１０４.１１６.４４.０１０４０.３５３３６.７０.３７１０４.２１８.３４.３３㊀讨论采用了重叠延伸ＰＣＲ法成功合成了ｒｈＩＦＮα２ｂ基因ꎬ构建了表达质粒ｐＢＶ２２０￣ｒｈＩＦＮα２ｂꎬ表达产物ｒｈＩＦＮα２ｂ在大肠杆菌ＤＨ５α中以包涵体的形式存在ꎬ蛋白表达量可占全菌蛋白的２３％~３２％ꎮ发酵产物通过破菌㊁包涵体抽提㊁变性㊁复性㊁阴离子交换层析ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ以及凝胶过滤层析ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ￣１００的纯化方法ꎬ得到纯品ｒｈＩＦＮα２ｂꎬ比活达到１ˑ１０８ＩＵ/ｍｇꎬ每２００ｇ湿菌体可获ｒｈＩＦＮα２ｂ纯品２１８ｍｇꎮ本实验在进行ＰＣＲ时ꎬ将相邻片段两两互补延伸以后ꎬ再与相邻片段互补延伸ꎬ最后是两个大片段拼出全长基因ꎬ虽然步骤较多ꎬ但ＰＣＲ效果较好ꎬ显示出良好的应用前景ꎮ包涵体是指通过基因工程技术ꎬ大肠杆菌表达的重组蛋白在细胞内凝集ꎬ形成没有活性的固体颗粒ꎮ本实验包涵体洗涤中ꎬ采用低浓度的尿素能溶解部分杂蛋白ꎬＴｒｉｔｏｎＸ￣１００能溶解脂质和脂膜蛋白ꎮ有文献报道ꎬ在复性过程中ꎬ会出现大量的二聚体ꎬ可能是一级结构错配造成的ꎬ一般采用离子交换和疏水层析的方法纯化[１３]ꎮ本实验重新优化了菌种ꎬ采用两步色谱法分离纯化ｒｈＩＦＮα２ｂꎬ凝胶过滤层析替代疏水层析ꎬ生物活性大大提高ꎮ本研究合成了编码ＩＦＮα２ｂ的基因ꎬ构建了表达载体ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂꎬ并在大肠杆菌ＤＨ５α内得到表达ꎮ同时建立了ｒｈＩＦＮα２ｂ大肠杆菌表达后的分离纯化工艺ꎮ发酵产物通过破菌㊁经过裂解㊁洗涤液去除杂质获得高纯度的包涵体ꎬ变㊁复性㊁ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ离子交换层析和凝胶过滤层析ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ￣１００进行纯化ꎬ得到ｒｈＩＦＮα２ｂ纯品ꎬ其比活可达１ˑ１０８ＩＵ/ｍｇꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀侯云德.干扰素及其临床应用[Ｍ].江苏:江苏科学技术出版社ꎬ１９８１ꎬ３.７１２梁果义ꎬ等:重组人干扰素α２ｂ的制备研究. All Rights Reserved.[２]㊀吴梧桐ꎬ丁锡申ꎬ刘晶晶.基因工程药物－基础与临床[Ｍ].北京:人民卫生出版社ꎬ１９９６.[３]㊀吴玉厚ꎬ吴冰洁ꎬ周国利ꎬ等.干扰素研究进展[Ｊ].生物学教学ꎬ２００７ꎬ３２(７):２－４.[４]㊀侯相山ꎬ王洪水.干扰素研究进展[Ｊ].安徽农业科学ꎬ２００７ꎬ３５(６):１７００－１７０２.[５]㊀何成ꎬ朱运松.干扰素的分子生物学研究进展[Ｊ].国外医学－微生物学手册ꎬ１９９４ꎬ１７(４):１４５－１４７ꎬ１５５. [６]㊀ＬｅｉｇｈＪＷꎬＰａｕｌＰＴꎬＭａｒｋＲＷꎬｅｔａｌ..Ｚｉｎｃｍｅｄｉａｔｅｄｄｉｍｅｒｏｆｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα２ｂｒｅｖｅａｌｅｄｂｙＸ￣ｒａｙｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙＲａ￣ｍａｓｗａｍｙ[Ｊ].Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬ１９９６ꎬ４(１２):１１５３－１１６３. [７]㊀ＢｒｕｎｏＲꎬＳａｃｃｈｉＰꎬＣｉｍａＳꎬｅｔａｌ..Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｐｒｏｆｉｌｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｖｉｒａｌ.Ｈｅｐａｔ.ꎬ２０１２ꎬ１９(１):３３－３６.[８]㊀魏开坤ꎬ马学军ꎬ张丽兰ꎬ等.人α２ｂ型干扰素的基因合成㊁表达质粒构建及产物的制法[Ｐ].中国ꎬ９９１２５９６６.１ꎬ２００１.[９]㊀萨姆布鲁克Ｊꎬ拉塞尔ＤＷꎬ著ꎬ黄培堂ꎬ译.分子克隆实验指南(第三版)[Ｍ].北京:科学出版社ꎬ２００２ꎬ３９１－３９６. [１０]㊀汪家政ꎬ范明.蛋白质技术手册[Ｍ].北京:科学出版社ꎬ２０００ꎬ１１１－１１２.[１１]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典２０１０版(附录３４) [Ｍ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０１０.[１２]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典２０１０版(附录７１－７２)[Ｍ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０１０.[１３]㊀韩霭辰ꎬ王劲峰.疏水相互作用层析分离重组人干扰素ａ２ｂ[Ｊ].微生物学免疫学进展ꎬ２０１２ꎬ４０(６):８－１２.８１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。
重组人干扰素α2a凝胶剂的制备
重组人干扰素α2a凝胶剂的制备重组人干扰素α2a凝胶剂的制备作者:张淑子，张京兰，董义兰,摘要, ,目的, 制备重组人干扰素α2a凝胶剂，并研究部分药效和毒理学. ,方法, 以羧甲基纤维素钠为基质制备重组人干扰素凝胶剂，利用FL传代细胞检测凝胶在体外培养单纯疱疹病毒(HSV)的抑制作用，并进行家兔体内局部用药毒性试验及稳定性试验. ,结果, 所制备重组人干扰素α2a凝胶剂的稳定性良好，局部用药未见皮肤刺激反应及急性毒性反应，对HSV-?的抑制效果优于对HSV-?. ,结论, 所制备重组人干扰素α2a具有制备工艺简单、稳定性好及无毒副作用等特点，且对HSV有抑制作用. ,关键词, 干扰素α，重组;凝胶;药物，评估ABSTRACT:OBJECTIVE To prepare rhIFNα2a gel and study on its effectiveness and toxicology.METHODS CMC-Na was used as the gel base，the pharmacological effects of anti-HSV in vitro was studied with FL cell，the toxicity in topical administration was tested with animals and the stability test was performed.RESULTSThe gel was stable，no skin stimulation and acute toxicity was found，and its antiviral effects on HSV-?was better than on HSV-?.CONCLUSION The preparation technique of rhIFNα2a gel is simple，and the gel is stable in quality and nontoxic，and that can inhibit HSV effectively. Key words:interferon alfa，rebinant;gels;drug evaluation 干扰素具有抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖及调节机体免疫功能等作用，有多种剂型应用于临床.国内外有众多关于将,1, ，如将干扰素α软膏用于治疗干扰素注射于皮肤损伤部位或局部应用的报道人类乳头状瘤病毒感染的尖锐湿疣 ,2, ，将干扰素α乳膏用于治疗生殖器疱疹 ,3, ，将干扰素α口服剂用于治疗人类乳头状瘤病毒感染的口腔黏膜病变等 ,4, ，均获得了良好的效果.本研究制备了重组人干扰素α2a外用凝胶剂，旨在为局部应用以达到治疗目的提供依据. 1 材料与方法1.1 材料 WISH细胞及水疱性口炎病毒(VSV)由中国药品生物制品检定所提供;HSV-?型和HSV-?型购自中国医学科学院病毒研究所;FL人羊膜传代细胞和白色健康家兔(体重为2,3kg，雌雄各半)由卫生部长春生物制品所提供;IMDM购自GIBCO公司;重组人干扰素α2a原液由长生基因药业公司制备;羧甲基纤维素钠及甘油对羟基甲酸乙酯等试剂均为分析纯.1.2 制备处方为干扰素1.8×10 7 U，羧甲基纤维素钠4.0g，甘油16.0g，对羟基苯甲酸乙酯0.1g，人血白蛋白0.3g，加蒸馏水至90mL.制备方法:取处方量羧甲基纤维素钠、甘油、对羟基苯甲酸乙酯及适量蒸馏水混和均匀，高压灭菌(115?，30min)，自然冷却至适宜温度，加入人血白蛋白及干扰素溶液，加蒸馏水至90mL，缓缓搅拌成凝胶状，分装于药用铝管内，每支为12g(10mL)，干扰素含量为2.0×10 5 U/mL，共制备3批样品，生产批号分别为051001，051102，051103.1.3 稳定性试验1.3.1 加速试验采用温度与湿度联合加速试验方法，即将干扰素凝胶样品放入含有饱和氯化钠(相对湿度为74.7%)的干燥器内，再置于(40?1)?恒温培养箱中培养，分别于1，2，3月时取样进行外观、效价及微生物限度等相关质量指标检查.1.3.2 离心稳定性试验取3批样品各5mL，分别置于10mL离心试管中，以4000r/min离心30min，观察凝胶剂的外观及涂展性的变化情况.1.4 抗病毒试验参照文献,5,的方法进行，即培养FL细胞至单层，向试验组内加入干扰素凝胶稀释液0.1mL、HSV病毒液0.1mL及细胞维持液0.8mL，向对照组内加入HSV病毒液0.1mL及细胞维持液0.9mL，待细胞出现明显病变时反复冻融3次，低速离心，取上清液测定其TCID 50 .病毒滴定采用微孔板滴定方法进行，即将样品梯度稀释后，分别加样0.1mL于各孔，置于37?，50mL/L二氧化碳孵箱内培养，7d后计算样品对病毒的抑制效价.1.5 局部用药毒性试验1.5.1 局部刺激性试验取健康家兔20只，随机分为5组，即3批样品试验组、赋型剂对照组及空白对照组，每组各为4只.家兔背部去毛5.0cm×5.0cm，同时进行破损皮肤试验.分别给予3批样品试验组家兔皮肤破损部位涂抹相应批次重组人干扰素α2a凝胶1g，每日2次;给予赋型剂对照组家兔涂抹相同剂量的不含干扰素的基质，每日2次;空白对照组不予处理.1.5.2 急性毒性试验取健康家兔20只，雌雄各半，分组方法同1.5.1项下方法.家兔背部去毛5.0cm×5.0cm，同时进行破损皮肤试验.分别给予3批样品试验组家兔皮肤破损部位涂抹相应批次重组人干扰素α2a凝胶5g，;给予赋型剂对照组家兔涂抹相同剂量的不含干扰素的基质;空白对照组不予处理;自给药之日起每日进行观察，连续15d.。
干扰素滴眼液生产标准操作规程
干扰素滴眼液生产标准操作规程干扰素滴眼液生产标准操作规程一、前言干扰素滴眼液是一种用于眼科治疗的药物，其主要成分为干扰素。
为了确保干扰素滴眼液的质量和安全性，制定了以下操作规程。
二、生产环境1.生产车间应具备良好的通风系统，保持空气清洁。
2.生产区域的温度应在20~25摄氏度之间，并且保持相对湿度在40%~70%。
3.生产设备、容器和工具应符合相关的卫生标准，每次使用前应对其进行彻底清洁和消毒。
三、原辅材料控制1.干扰素的原料进货应检查其厂家资质和产品合格证书，并对其进行抽样检验。
2.原辅材料的储存应遵循相应的存放要求，防止受潮、受热、受光等。
四、生产工艺1.干扰素滴眼液的生产工艺应符合国家相关法规和标准，并严格按照产品质量控制文件进行操作。
2.生产过程中应确保操作人员身着无菌工作服，并佩戴洁净手套和口罩，以防止异物和微生物的污染。
3.操作人员应经过专业培训，熟悉工艺流程并掌握正确的操作方法。
4.干扰素的制备过程中，应按照严格的时间和温度控制要求进行加热、冷却和混合等操作。
5.操作过程中应进行适当的取样和监测，确保产品质量符合规定标准。
五、包装与存储1.干扰素滴眼液的包装应符合国家相关法规和标准，采用无菌包装材料，并进行严格的清洁和消毒。
2.包装过程中应确保产品的密封性和稳定性，并标注产品批号、生产日期等必要信息。
3.包装成品应存放在洁净、干燥、温度适宜的环境中，并防止阳光直射和高温变化影响产品质量。
4.存放过程中应定期对包装进行检查，确保包装的完整性和卫生性。
六、设备维护与清洁1.生产设备在使用前应进行检查和维护保养，确保其正常运行和功能完好。
2.操作结束后，应对使用过的设备进行彻底清洁，并进行消毒处理，以防止交叉污染和微生物滋生。
3.设备维修和更换应有相应的记录和程序，确保设备的可靠性和工作效率。
七、质量控制1.干扰素滴眼液的质量控制标准应符合国家相关法规和标准，包括外观、PH值、浓度、活性等指标。
重组人β干扰素-1b的融合表达及制备
２１ ０ ０年 ４月
Ａｐ ．２０１ ｒ ０
重组人 ｌ ３干扰 素 一１ 融合 表 达及 制备 ｂ的
刘 日勇 ， 岚 ， 罗 范 开
（ 重庆理工大学 ， 重庆 ４ ０５ ） ０ ００
摘
要 ：通过 融合 表 达获得 无 需复性 的 重组 人 ｐ干扰 素 一１ （７ ｅ—． Ｎ） ｂ １ＳｒＢＩ 。运 用 Ｐ Ｒ方 Ｆ Ｃ
ｒＩ Ｎ— —ｂｗａ ｒ ｅ ｙｓｐ ａｅ ｙＣ１ ｖｒｅ ｐ ａｅｃ ｒｍａｏｒｐ ｙ， ｎ ｓａ ｔ ｉ ｌ ｐ ｃｆ ｃｉｉ ｈ Ｆ Ｂ ｌ ｓｆ ｔ ｄ ｅ ａ ｔｄｂ ８ｒ ｅｓ—ｈ ｓ ｈｏ ｔｇａ ｈ ａ ｄｉ ｎｉ ｒ ｅ ｉｃａ ｔ ｔ ｕｈ ｒ ｅ ｔ ｖａｓ ｉ ｖｙ
ｓ ｔ ｎｅｔ ｉａｅｒ ｏｎ ｉ ｉ Ｄ Ｄ Ｋ ｎ ｘｒｓ ｎ ｓ ｎｐｏ ｉ Ｔ Ｘ ｐ ＩＮ ｌ ）ｉ Ｑ ｉ ｅ ｅ ａ ｅ ｎ ｃｇｉｏ ｓｅ（ Ｄ Ｄ ）ａ ｄｅｐｅｓ ｇ ｕｉ ｒ ｅ ｒｄ ｎ ｍｋ ｓ ｅ ｔｎ ｔ ｉ ｆ ｏ ｔ ｎ（ Ｒ — — —ｂ ｎ ｒ Ｆ 分
法扩增带有 Ｅ （ Ｋ 肠激酶） 白酶酶切位点的人 Ｊ干扰 素 一 ｂ 因， 蛋 Ｂ １基 构建重纽表达栽体 ｐ Ｔ２ａ Ｅ ３ —
Ｅ — — Ｎ ｌ ， 过 工程 菌（ Ｅ ３ 一— Ｋ—ｐ—ＩＮ一１ Ｋ ｐ Ｉ —ｂ 通 Ｆ ｐ Ｔ ２ ａＥ Ｆ ｂ／Ｑ ｉ ｍ Ｅ ） 达 融合 蛋 白 Ｔ Ｘ ＢＩＮ ｒａ ｉ ３ 表 ｇ Ｄ Ｒ —— ． Ｆ
文献标 识码 ： Ａ 文章 编号 ：６ ４—８ ２ （ ０ ０ ０ ０ ４ ０ １７ ４ ５ ２ １ ） ４— ０ ０— ４
中图分 类号 ： ７ ２ Ｒ ５
Ｆ ｓｏ ｐ ｅ ｓｏ ｎ ｒ ｐ ｒ ｔ ｎ ｏ ｃ ｍｂ ｎ ｎ ｍａ ｕቤተ መጻሕፍቲ ባይዱｉ ｎ Ｅｘ ｒ ｓ ｉｎ ａ ｄ Ｐ ｅ ａ ａ ｉ ｆＲｅ ｏ ｏ ｉ ａ ｔＨｕ ｎ
重组人干扰素α1b制造及检定规程_图文
他微生物污染。 2.2.3.5 生化反应
应符合大肠杆菌生物学性状。 2.2.3.6 干扰素表达量
在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。 2.2.3.7 表达的干扰素型别
应用抗α型干扰素参考血清作中和试验，证明型别无 误。 2.2.3.8 质粒检查
2.5 加样
取2.1项制备的细胞培养板。将2.4项制备的溶液移
入该细胞培养板，每孔100µl。37ºC，5% 培养18～24小时。
CO2条件下
2.6 制备病毒液
液稀释攻至毒工剂作量浓为度10。0TCID50，取保存的VSV用攻毒培养
2.7 攻毒
取2.5项制备的细胞培养板，弃去上清。加入病毒液 ，液每的孔501%00病µ变l。点3在7ºDC或，E5行%)。CO2培养24小时(镜检标准溶
该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。
2. 3 原液制备 2.3.1 种子液制备
将检定合格的工作种子批菌种接种适宜的培养基培养，供发酵罐 接种用，种子液应进行质粒稳定性检查。
2.3.2 发酵用培养基 采用适宜的培养基。其中不含任何抗生素。
2.3.3 种子液接种及发酵培养 2.3.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。 2.3.3.2 在适宜的温度下进行发酵，发酵条件如温度、pH值、溶氧、
3.1.2 蛋白质含量 用Lowry法测定。
3.1.3 比活性 应不低于1.0 × 107IU /mg蛋白。
3.1.4 纯度 3.1.4.1 电泳法
用非还原型SDS-PAGE法。加样量应不低于5µg(银 染法)或10µg(考马氏亮蓝R-250染色法)。经扫描仪扫描 ，纯度应不低于95.0%。 3.1.4.2 高效液相色谱法