干扰素的工艺制备流程
干扰素制备的工艺流程图
(4)纯度 电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一区带，经扫描 仪测定纯度应在95%以上。 (5)相对分子量测定 还原型SDS-PAGE,加样量不低于微克，同时用已知相对分子量的蛋
重组体引入宿主 细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒pBR322中,转化到大肠杆菌,重组的载体 DNA 分子在 一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。
从大肠杆菌K12获取目 的基因
由于质粒重组时有3种基本方式,即:目的基因与克隆载体重组,目的基因片段与 目的基因片段重组,克隆载体与克隆载体重组;另外重组过程可能会发生基因突 变情况
提取重组质
粒②
3、碱裂解法
1）将洗过的500ml培养物的细菌沉淀物[来自收获细菌的步骤3]重悬于10ml(18ml) 溶液Ⅰ中。
溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
10mmol/L EDTA(Ph8.0)
溶液Ⅰ可分批配制，在10 1bf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟， 贮存于4 ℃。
(l)溶解氧控制 分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度，以期 提高干扰素的发酵水平。通过级联调节通气量和搅拌转速得以实现。
(2).温度控制 假单孢杆菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。产物 合成温度控制在20℃可以有效防止干扰素-α 2b的降解，而其最佳生长温度则 为30℃。质粒的稳定性随温度的升高而迅速下降，因此在培养后期降温可以 减少目标产物的降解，增加质粒的稳定性。
(8)残余抗生素活性测定 半成品中不应有抗生素活性存在。
干扰素制备工艺流程
８）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽， 于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置 相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放 在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
９）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
其区别在于个别氨基酸的差 异上。
早期干扰素是用病毒诱 导人白血球产生的，产量低、 价格昂贵，不能满足需要， 现在可利用基因工程技术并 在大肠杆菌中发酵、表达来 进行生产。
基因工程菌的制备
目的基因的分离
克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
重组体导入大肠杆菌K12
→
→
受体菌的培养及筛选
从受体菌中获取目的基因表达载体
出现在3.5小时之后，在4小时达到最大，然后由于降解而
迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单孢杆菌的生长和
干扰素的生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策
略进行过程控制。
(1)．溶解氧控制 分别在生长阶段和生产阶段采用各自 最佳溶解氧浓度，以期提高干扰素的发酵水平。通过级联调 节通气量和搅拌转速得以实现。
2、细菌的收获和裂解 １）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清， 敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。 STE 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。
扰素基因的PCR产物
二、目的基因与克隆载体进行体外重组
1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因
基因工程药物之干扰素的制备流程
基因工程药物之干扰素的制备流程干扰素是一种重要的生物制剂，被广泛应用于医学和生物制药领域。
其中，基因工程合成的干扰素具有高纯度和高效性，成为医药行业备受瞩目的制备临床药物之一。
下面将介绍基因工程制备干扰素的具体流程。
1. 选择干扰素基因：首先，需要确定要制备的干扰素类型，比如干扰素α、β或γ。
然后从合适的来源中提取相应的基因序列，这些基因将用于转染哺乳动物细胞中。
2. 克隆基因：将提取的基因进行PCR扩增，然后将扩增的基因与表达载体连接，形成重组质粒。
这一步大多数需要利用大肠杆菌进行克隆。
3. 转染细胞并表达：将重组质粒导入哺乳动物细胞中，并使用适当的转染试剂进行转染。
转染后，细胞将利用其自身的基因组表达干扰素基因，产生干扰素蛋白。
4. 提取纯化干扰素：采用细胞破碎和超声波等技术，将细胞内的干扰素进行提取。
接着，利用柱层析、凝胶过滤等方法对干扰素进行纯化，确保获得高纯度的目标蛋白。
5. 结构分析和活性检测：对制备的干扰素进行质谱分析、核磁共振等结构分析技术，确保合成的干扰素与天然干扰素的结构相似。
同时，需要进行活性检测，验证其在体外和体内的抗病毒、抗肿瘤等生物活性。
6. 毒性和稳定性评价：进行毒性和稳定性测试，确保制备的干扰素对人体没有不良影响，并且在不同条件下具有一定的稳定性。
7. 大规模生产：通过以上步骤初步制备的干扰素需要进行大规模发酵生产，确保满足医药市场对干扰素的大量需求。
通过上述基因工程制备流程，可以获得高效、高纯度的干扰素制剂，为医药健康事业做出重要贡献。
8. 注册和临床试验：在成功实现大规模生产后，制备的干扰素需要进行严格的注册和临床试验。
在注册过程中，需要提供充分的数据支持其安全性和有效性，以及符合各项规定标准。
对于基因工程制备的干扰素，还需要提供详细的制备工艺和质控措施，证明产品的稳定性和一致性。
在完成注册后，需要进行临床试验以验证干扰素在不同病症（如乙肝、乙型肝炎、多发性硬化症、癌症等）的疗效和安全性。
干扰素的生产工艺过程
干扰素的生产工艺过程1．菌种制备取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。
然后，接入摇瓶，培养温度30℃，pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。
2．种子罐培养将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌。
3．发酵罐培养将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0。
级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。
然后控制培养温度20℃，pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。
同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。
或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10℃以下。
4．菌体收集将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000 r/min离心收集。
进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。
菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。
每保存3个月，检查一次活性。
11.4.3.4 干扰素发酵过程控制在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂速度最快，到3.5小时开始下降。
而干扰素的迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到最大，然后由于降解而迅速下降。
可见在发酵生产工艺中，假单孢杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策略进行过程控制。
1．溶解氧控制分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度，以期提高干扰素的发酵水平。
通过级联调节通气量和搅拌转速得以实现。
2．温度控制假单孢杆菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。
产物合成温度控制在20℃可以有效防止干扰素-α2b的降解，而其最佳生长温度则为30℃。
干扰素制备的工艺流程PPT课件
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质粒DNA的纯化②
6)吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯 仿、氯仿各抽l次。
7)将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混 匀，加2倍体积(约lml)乙醇，于室温放置10分钟，于4 ℃以 12000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。
3 破碎细胞,提取细胞总mRNA.
4
用逆转录试剂盒逆转录,把总mRNA逆转录成cDNA
5
以cDNA为模板、干扰素引物为引物,PCR,得到完全的干扰素基因的PCR产物
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6
目的基因与克隆载体进行体外重组
1.提取载体(连接
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,现在 来进行生
2
基因工程菌的制备
目的基因的分离
目的基因与克隆
克隆载体
载体的体外重组
重组导入大肠杆菌K12
受体菌的培养 及筛选
从受体菌中获取目的基因 重组质粒
表达载体
导入大肠杆菌
受体菌的筛选（表达性、稳定性等检测）
工程菌
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3
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工艺流程
目的基因的分离与获得
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%,培养4小时。然后控制培养温度20℃ ，pH6.0, 溶解氧60%,继续培养5-6.5小吋。同时进行发酵液杂菌检查，当0D值达9.0±1.0后，用5℃冷 却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温 度迅速降至10℃以下。
干扰素的工艺制备流程
蛋白质含量测定
原理：利用蛋白质与特定试剂反应，生成有色物质，通过比色法测定蛋白质含量
试剂：考马斯亮蓝、溴酚蓝、福林酚试剂等
步骤：样品处理、试剂添加、反应时间、比色测定、结果计算 注意事项：样品处理要充分，试剂添加要准确，反应时间要控制好，比色测定要准确，结果计 算要正确。
基因序列分析
目的：检测干扰素 的基因序列
化学合成法
原料：氨基酸、核苷酸等
反应条件：温度、pH值、反应时间 等
合成步骤：氨基酸合成、核苷酸合成、 蛋白质合成等
产物纯化：色谱法、电泳法等 质量控制：检测纯度、活性等 包装与储存：无菌包装、低温储存等
干扰素质量检测
生物学活性检测
检测方法：采用细胞培养法或酶联免疫吸附法 检测指标：干扰素的生物学活性、纯度、稳定性等 检测步骤：样品制备、细胞培养、酶联免疫吸附、结果分析等 检测结果：根据检测结果判断干扰素的生物学活性是否达标
干扰素工艺制备流程
汇报人：
干扰素制备原料 干扰素制备工艺流程 干扰素质量检测 干扰素生产成本控制 干扰素工艺制备技术的发展趋势
干扰素制备原料
重组人干扰素
原料：人源细胞
制备方法：基因 工程
作用：抗病毒、 抗肿瘤
应用：临床治疗、 疫苗开发
病毒干扰素
病毒来源：自然界 中的病毒
病毒种类：包括流 感病毒、乙肝病毒 等
病毒提取：通过生 物技术从病毒中提 取干扰素
干扰素纯化：通过 生物技术对提取的 干扰素进行纯化处 理
干扰素制备工艺流程
基因工程法
基因工程法简介： 通过基因工程技术， 将干扰素基因导入 到微生物中，使其 表达出干扰素蛋白
基因工程法的优点： 可以大规模生产， 成本低，效率高
干扰素的工艺制备流程
干扰素的工艺制备流程干扰素是一种细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种功能。
干扰素的制备是通过基因工程技术来实现的，下面将介绍干扰素的工艺制备流程。
1. 基因克隆在干扰素的工艺制备中，首先需要进行基因克隆。
这一步是将目标基因与表达载体连接起来，形成重组 DNA 分子。
常用的表达载体包括质粒和病毒载体。
基因克隆的具体步骤如下：1.1 选择目标基因：根据所需要制备的干扰素类型，选择相应的目标基因序列。
1.2 购买引物：根据目标基因设计引物，并购买合成。
1.3 PCR 扩增：使用引物进行 PCR 扩增，得到目标基因的 PCR 产物。
1.4 酶切与连接：将目标基因的 PCR 产物切割与载体进行连接，形成重组 DNA 分子。
常用的酶切酶有 EcoRI、BamHI、XhoI 等。
1.5 转化：将重组 DNA 转化至宿主菌中，如大肠杆菌，以便后续大规模培养。
2. 克隆表达在克隆表达阶段，需要将重组 DNA 导入到宿主细胞中，并使其表达干扰素。
克隆表达的具体步骤如下：2.1 酵母菌检测: 通过将宿主细胞转化至酵母菌中，进行孢子碟试验来筛选高表达的菌株。
2.2 培养: 选取高表达的菌株进行大规模培养，提供充足的菌体用于干扰素的表达。
2.3 诱导表达: 通过添加合适的诱导剂，如等温诱导或化学诱导，使菌体产生干扰素。
2.4 培养时间控制: 根据不同的干扰素类型，确定合适的培养时间。
2.5 菌体破碎: 将培养得到的菌体进行破碎，以释放干扰素。
2.6 干扰素纯化: 利用分离纯化技术，如柱层析、高效液相层析等，对菌体提取液进行纯化，得到纯净的干扰素。
3. 干扰素的活性检测制备干扰素后，需要对其进行活性检测，以确保其具有预期的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等功能。
干扰素活性检测的方法有多种，包括：3.1 细胞抑制实验：通过对目标细胞进行处理，并观察细胞生长情况，来判断干扰素抑制细胞生长的能力。
3.2 抗病毒实验：通过对目标病毒感染细胞进行处理，并观察细胞感染情况，来判断干扰素抗病毒能力。
干扰素制备的工艺流程
转化与筛选
将重组DNA分子导入受体细 胞，通过选择性培养基筛选 出含有干扰素基因的阳性克
隆。
表达与鉴定
对阳性克隆进行培养，诱导 干扰素基因的表达，并对表 达产物进行生物学活性鉴定 。
细胞培养技术
1 2 3
细胞株选择
选择适宜的细胞株作为干扰素的生产细胞，确保 其能够在体外培养条件下稳定表达干扰素。
量病毒颗粒。
感染与表达
03
将病毒颗粒感染适宜的宿主细胞，诱导干扰素基因的表达，收
集表达产物。
纯化与精制技术
初步纯化
采用沉淀、过滤等方法去除杂质和悬浮颗粒物，初步纯化干扰素。
进一步纯化
利用各种层析技术（如凝胶过滤、离子交换等）对初步纯化产物进 行进一步纯化，提高干扰素的纯度。
精制与制剂
对高纯度的干扰素进行精制和制剂加工，以满足临床应用的需求。
• 未来发展方向：随着生物技术的不断 发展，干扰素的质量控制将更加严格 和全面。未来发展方向包括建立更加 灵敏和准确的检测方法、提高制备工 艺的效率和纯度、加强生产过程中的 监控和管理等方面，以确保干扰素的 安全性和有效性。
05 干扰素制备的工艺优化
基因重组技术的优化
01
基因重组技术是制备干扰素的 关键技术之一，通过优化重组 技术，可以提高干扰素的产量 和纯度。
干扰素的种类
α干扰素
由白细胞和成纤维细胞产生，主要用于治疗 乙型肝炎和丙型肝炎。
β干扰素
由自然杀伤细胞产生，具有广谱抗病毒活性。
γ干扰素
由T淋巴细胞产生，具有免疫调节活性。
02 干扰素制备前的准备
原材料的准备
细胞培养基
选择适合细胞生长的培养基，确保细胞生长旺盛，产量高。
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扰素基因的PCR产物 ❖ 5.人工加尾形成“粘性末端”
二、构建重组质粒
❖ 1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因
的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接
EcoR I
BamH I
EcoR I
BamH I
2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后，导入受体细胞，筛选
三、重组体引入宿主细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件 下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。
提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）
2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。
❖ 不同来源的干 扰素
1.2 重组干扰素的临床应用
❖ 广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。
（4）初级分离
❖ 盐析: 硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 ❖ 离心：连续流离心机，16000 r/min ❖ 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
3. 2、干扰素纯化工艺过程
❖ 溶解粗干扰素 ❖ 沉淀与疏水层析
阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 ❖ 无菌过滤分装
3.1 干扰素分离工艺过程
❖ 菌体裂解 ❖ 预处理 ❖ 初级分离
(1)菌体裂解
❖ 裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5） ❖ 使用保护剂：EDTA，PMSF。 ❖ 破碎菌体：2厘米以下的碎块 ❖ 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr ❖ 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
(2)预处理-沉淀
❖ 加絮凝剂聚乙烯亚胺: 2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。
❖ 加凝聚剂醋酸钙溶液: 2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行 沉淀。
(3)离心
❖ 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min ❖ 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 ❖ 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
四、受体菌的筛选
由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体 重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆 载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况
五、分析保存
对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保存菌种。
干扰素的发酵工艺过程
启开种子 精提 冻干
制备种子液 半成品制备
成品检定
基因工程药物 --干扰nterferon,IFN)：机体 免疫细胞产生的一类细胞因 子，是机体受到病毒感染时， 免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、 功能接近的生物调节蛋白。
根据分子结构和抗原性的差 异分为α、β、γ、ω等4个类 型。
1.1天然干扰素的分类
1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类
◆ I 型干扰素：IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω
来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 、免疫调节(较弱） 其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。
◆ II 型干扰素：干扰素γ（IFN)
来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节
❖ 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金 淋巴瘤。
❖ 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） ❖ 多发性硬化症 rhuIFNβ
2 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺
干扰素生产工艺路线
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
❖ 4. 菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机， 16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、 菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。 菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个 月，检查一次活性。
3. 干扰素的分离纯化工艺过程
3.1、干扰素分离工艺过程 3.2、干扰素的纯化工艺过程
基因工程菌的制备
❖ 目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
重组体导入大肠杆菌K12
→ → 受体菌的培养及筛选 从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
→ 导入大肠杆菌 受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
工程菌
一、目的基因的分离与扩增
❖ 1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA ❖ 2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶
发酵培养 半成品检定
成品包装
粗提 分装
❖ 1．菌种培养
取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种
子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30℃，
pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定
和发酵液杂菌检查。
❖ 2．种子罐培养
将已活化的菌种接入装有30L培养基的
种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通
气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入
发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线
检查，控制杂菌
❖ 3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接 种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转 速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃， pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液 杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至 15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中， 加入冰块使温度迅速降至10℃以下。