微生物糖苷酶的新型突变酶_硫代糖苷酶的产生及应用
β—葡萄糖苷酶及其应用
β—葡萄糖苷酶及其应用β—葡萄糖苷酶（β-glucosidase）是一种重要的酶类，在生物化学、生物技术、医学和工业中都有广泛的应用。
β—葡萄糖苷酶作用于葡萄糖苷键，能够水解葡萄糖苷化合物，将其转化为葡萄糖和相应的醛或酮。
本文将介绍β—葡萄糖苷酶的性质、结构、应用以及其在生物工程领域的潜力。
β—葡萄糖苷酶是一种水解酶，广泛存在于植物、微生物和动物中。
在微生物中，β—葡萄糖苷酶在纤维素降解、半乳糖代谢以及多糖分解等生理过程中起着重要作用。
在植物中，β—葡萄糖苷酶参与了植物生长发育、种子萌发和植物抵抗逆境的过程。
在动物中，β—葡萄糖苷酶则参与了碳水化合物的代谢和营养吸收。
由于β—葡萄糖苷酶在生物体内起着重要作用，因此其在医药和食品工业中具有重要的应用价值。
β—葡萄糖苷酶通常被用于食品加工工业中，用于水解植物中的葡萄糖苷化合物，例如大豆异黄酮和花青素。
通过β—葡萄糖苷酶的作用，可以将这些化合物水解成为葡萄糖和其他生物活性物质，从而提高其生物利用率。
β—葡萄糖苷酶还被广泛用于啤酒、葡萄酒和果汁等酿造行业，帮助降解残留的酚类化合物，改善产品的口感和质量。
在医药领域，β—葡萄糖苷酶也具有重要的应用价值。
近年来，β—葡萄糖苷酶在抗癌药物的研发和生产中得到了广泛的应用。
一些天然产生的抗癌化合物以葡萄糖苷化合物的形式存在，通过β—葡萄糖苷酶的水解作用，可以将其转化为活性的抗癌物质，从而提高药物的疗效。
β—葡萄糖苷酶还被用于合成具有生物活性的化合物，为药物研发提供了有效的手段。
在生物工程领域，β—葡萄糖苷酶的潜力尤为巨大。
由于其具有水解葡萄糖苷化合物的特性，β—葡萄糖苷酶可以用于生物燃料的生产。
利用β—葡萄糖苷酶将植物细胞壁中的纤维素水解为葡萄糖，然后利用发酵工艺将葡萄糖转化为生物燃料，可以提高生物燃料的产量和质量，从而减缓对传统石化燃料的依赖。
β—葡萄糖苷酶还可以用于生物质降解和生物制药等领域，为生物工程技术的发展提供了强大的支持。
β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及产酶条件优化
β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及产酶条件优化
陈显玲;苏龙
【期刊名称】《中国饲料》
【年(卷),期】2024()9
【摘要】本研究从实验室构建的微生物菌库中筛选获得1株β-葡萄糖苷酶产生菌株HHL,结合ITS序列分析方法鉴定其为米曲霉(Aspergillus oryzae)。
以β-葡萄糖苷酶酶活为考察指标,通过单因素试验及正交试验对其产酶条件进行优化。
结果显示:菌株HHL最优产酶条件为以改良察氏培养基为培养基,pH 6.0,接种量8%,培养温度35℃,培养时间144 h。
此条件下,产β-葡萄糖苷酶酶活为48.74 U/mL。
【总页数】5页(P60-64)
【作者】陈显玲;苏龙
【作者单位】广西科技师范学院食品与生化工程学院
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7
【相关文献】
1.转半乳糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选鉴定、产酶条件优化及酶法制备乳果糖
2.产α-葡萄糖苷酶抑制剂乳酸菌的筛选及发酵条件优化
3.β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及其所产纤维素酶酶系组成分析
4.产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选及产酶条件优化
5.一株产β-葡萄糖苷酶甘草内生菌的筛选、全基因组分析及产酶优化
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糖苷酶的异源表达及酶活表征
糖苷酶的异源表达及酶活表征专业：微生物学研究生：张鹏飞指导教师：王一丁摘要：目的及意义：在时代飞速发展，传统能源日益锐减且价格不断上涨、温室气体大量排放、以及全球气候变化的今天，新型可再生能源产业的兴起和发展迫在眉睫。
其中，以农、林业废弃物为主的木质纤维素成为最普遍、储量最丰富的可再生资源，它不仅可以用于畜牧养殖、制备生物燃料及食品添加剂，还应用于工业生产和医疗卫生行业。
木质纤维素的合理高效利用不仅能够缓解环境压力，还能够带动经济增长。
但是，木质纤维素自身的特性使得其很难彻底分解并充分利用。
主要原因如下：1）组成木质纤维素的纤维素、木质素和半纤维素之间紧密联系导致降解不彻底；2）纤维素降解发酵所需的酶产量过低，不能满足工业发展的大量需求；3）单一的糖苷酶降解效率较低。
因此，本研究旨在寻找多种高效糖苷酶，对其基因进行密码子优化和改造，以期产生可以大量表达且易于收集和纯化的目标蛋白，并对异源表达所获取的融合蛋白酶进行酶学性质表征。
以期达到对木质纤维素的高效利用。
材料方法：本文利用分子生物学方法构建目的蛋白的重组表达载体，采用大肠杆菌和毕赤酵母两种异源表达体系作为糖苷酶的异源表达宿主细胞，对几种不同来源的异源表达的糖苷酶进行过表达，以及运用DNS方法对酶的酶学性质进行了详细的表征（最适pH和温度、pH和热稳定性以及二价金属离子的影响）。
结果：目标蛋白在异源细胞中均成功表达。
三种纤维素酶（pJL-14、pJL-36、A10）、甘露聚糖酶（C6）和果胶酶（pJL-44）的最适反应pH值分别为：5.5、5、4、4和4，均偏弱酸性，在中性及弱碱性的环境中均比较稳定。
而最适反应温度及热稳定性存在差异：pJL-14、pJL-36的最适反应温度分别为45℃和40℃，35℃和30℃以下较为稳定；C6的最适反应温度为60℃，40℃以下比较稳定；A10的最适反应温度为80℃，60℃以下较为稳定；pJL-44最适反应温度为60℃，25℃以下稳定存在。
a-糖苷酶作用机制
a-糖苷酶作用机制1.引言1.1 概述糖苷酶是一种重要的酶类，在生物体内起着关键的催化作用。
它们能够催化糖苷化合物的水解反应，将糖基从底物中剥离出来，从而发挥多种生理功能。
这些功能包括细胞信号传导、能量供应以及分解食物中的多糖类化合物等。
糖苷酶广泛存在于各种生物体中，如细菌、真菌、植物和动物等。
它们在不同生物体中的结构和功能具有一定差异，但都遵循一定的作用机制。
糖苷酶主要通过两种基本机制来催化底物的水解反应。
首先是酰基转移机制，其中糖苷酶通过将一个酰基由底物转移到水分子上，从而形成糖和一个羟基的临时中间体。
然后，这个临时中间体会发生水解反应，生成糖和自由的底物。
另一个常见的机制是酸碱催化机制。
通过在催化过程中提供一个酸性或碱性的催化剂，糖苷酶能够降低底物的活化能，从而促进水解反应的进行。
糖苷酶作用机制的深入研究对于理解生物体内多种生物过程具有重要意义。
通过揭示糖苷酶催化的具体机制，我们可以更好地理解免疫系统的功能，研究药物的代谢途径，并开发出更有效的药物。
近年来，糖苷酶作用机制的研究取得了显著进展，为进一步揭示生物体内底物水解反应的详细机制提供了重要的依据。
总之，糖苷酶作为一类重要的酶类，通过催化糖苷化合物的水解反应，在生物体内发挥着重要的功能。
我们对糖苷酶作用机制的深入研究不仅有助于加深对生物体内多种生物过程的理解，还为新药物的探索与开发提供了重要的指导。
1.2文章结构文章结构：本文主要介绍和探讨了糖苷酶的作用机制。
文章按照以下结构进行叙述：引言部分将对糖苷酶的概念和定义进行介绍，同时概述本文的研究目的。
接下来的正文部分将重点介绍糖苷酶的基本作用机制。
首先，将详细阐述糖苷酶的定义和分类，使读者对糖苷酶有更全面的了解。
然后，将重点介绍糖苷酶的基本作用机制。
这包括糖苷酶与底物的结合、底物的降解过程以及触发和催化底物反应的关键步骤等。
通过对糖苷酶作用机制的详细阐述，读者将能够更好地理解糖苷酶的功能和作用。
糖苷酶的应用及原理
糖苷酶的应用及原理1. 什么是糖苷酶糖苷酶是一类在生物体内起着重要催化作用的酶，它能加速糖苷键的水解反应，将糖苷分子分解成糖和相应的配体。
糖苷酶广泛存在于真核生物、原核生物和病毒等各种生物体中。
2. 糖苷酶的分类糖苷酶可以根据催化反应的位置和底物的不同分类。
常见的分类包括：•α-糖苷酶：催化α-糖苷键的水解，例如淀粉酶。
•β-糖苷酶：催化β-糖苷键的水解，例如木聚糖酶。
•γ-糖苷酶：催化γ-糖苷键的水解，例如乳果糖酶。
•其他糖苷酶：催化其他位置的糖苷键的水解，例如蜜糖酶。
3. 糖苷酶的应用3.1 生物燃料产业生物燃料产业中，糖苷酶被广泛应用于生物质转化过程中的酶解步骤。
糖苷酶能将木质纤维的纤维素水解成木糖、葡萄糖等糖类物质，为后续的发酵步骤提供底物。
3.2 食品工业在食品工业中，糖苷酶也被广泛利用。
例如，葡萄糖苷酶可以将大豆异黄酮转化为能被人体直接吸收的异黄酮，从而提高食品中对异黄酮的生物利用率。
3.3 制药工业糖苷酶在制药工业中的应用也非常重要。
例如，糖苷酶可以催化药物前体分子中的糖苷键水解，从而提高药物的溶解度和吸收率。
此外，糖苷酶还可用于合成特定的药物，例如某些抗生素。
3.4 环境保护糖苷酶在环境保护方面也有一定的应用价值。
例如，糖苷酶可以分解一些含有糖苷化合物的废水，减少对环境的污染。
4. 糖苷酶的作用机理糖苷酶催化反应的机理主要包括以下几个步骤：1.底物结合：底物通过与糖苷酶的活性位点结合，形成底物-酶复合物。
2.底物转化：酶催化底物的糖苷键水解，将底物分解成糖和相应的配体。
3.产物释放：糖和配体通过与酶的活性位点的相互作用，被释放出来。
4.酶的再生：酶通过与其他物质或反应产物的相互作用，恢复到活性状态，准备进行下一轮催化反应。
5. 总结糖苷酶是一类在生物体内起着重要催化作用的酶，广泛应用于生物燃料产业、食品工业、制药工业和环境保护等领域。
糖苷酶催化反应的机理涉及底物结合、底物转化、产物释放和酶的再生等步骤。
β—葡萄糖苷酶及其应用
β—葡萄糖苷酶及其应用β-葡萄糖苷酶是一种重要的酶类，在生物学和工业领域有着广泛的应用。
它是一种能够水解β-葡萄糖苷键的酶类，能够将β-葡萄糖苷结构的底物分解为葡萄糖和其他化合物。
β-葡萄糖苷酶在食品工业、医药工业、生物燃料生产等方面有广泛的应用，对于提高生产效率、改善产品品质具有重要意义。
本文将重点介绍β-葡萄糖苷酶的特性及其在不同领域的应用，以及未来的发展方向。
1. β-葡萄糖苷酶的特性β-葡萄糖苷酶是一种水解酶，是一类能够水解β-葡萄糖苷键结构的酶类。
其催化反应是将β-葡萄糖苷底物水解成葡萄糖和其他化合物。
β-葡萄糖苷酶的底物广泛存在于生物体内，包括植物、微生物、动物等。
β-葡萄糖苷酶可以分为内源性和外源性两种。
内源性β-葡萄糖苷酶存在于许多生物体内，起着降解和代谢底物的作用。
外源性β-葡萄糖苷酶则可以通过发酵产生，或者通过基因工程技术进行大规模生产。
β-葡萄糖苷酶的特性包括底物特异性、pH和温度稳定性等。
不同来源的β-葡萄糖苷酶对底物的特异性有所不同，有些可以水解多种底物，而有些则只对特定底物具有活性。
β-葡萄糖苷酶在不同的pH和温度条件下具有不同的活性，这也限制了其在不同领域的应用。
对β-葡萄糖苷酶的特性进行深入研究，可以为其在工业生产中的应用提供重要的基础。
β-葡萄糖苷酶在食品工业中有着广泛的应用，主要用于果汁生产、啤酒酿造、醋酿造等方面。
在果汁生产中，β-葡萄糖苷酶可以帮助提高果汁的产率和澄清度，降低果汁的粘度和浑浊度，改善产品的口感和外观。
在啤酒酿造和醋酿造中，β-葡萄糖苷酶可以帮助降解果皮中的苦味物质，提高啤酒和醋的品质。
β-葡萄糖苷酶在医药工业中也有着重要的应用。
它可以用于生产抗生素、消化酶、葡萄糖注射液等药品。
在抗生素的生产中，β-葡萄糖苷酶可以用于降解细胞壁，提高抗生素的产率和纯度。
在消化酶和葡萄糖注射液的生产中，β-葡萄糖苷酶可以帮助降解糖类化合物，提高产品的纯度和活性。
糖苷酶在多糖结构分析中的应用研究
加强糖苷酶在多糖结构分析中的与其他方法的联用研究
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糖苷酶与质谱联用
将糖苷酶与质谱联用，通过酶解多糖生成的单 糖或寡糖的质谱分析，提供更多关于多糖结构 的信息。
糖苷酶与光谱方法联用
结合光谱方法如红外光谱、核磁共振等，对酶 解后的产物进行详细的结构分析，进一步解析 多糖的结构特征。
糖苷酶与生物信息学方法联用
度和回收率，降低杂质的干扰。
稳定性提高
03
通过蛋白质工程和分子进化等方法，提高糖苷酶的稳定性和耐
受性，使其在多糖结构分析中更可靠和高效。
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糖苷酶在多糖结构分析中可以 用于水解多糖，获得单糖分子 或低聚糖，以便进一步分析。
研究目的和方法
研究目的
探讨糖苷酶在多糖结构分析中的应用，分析其水解多糖的能力和效果。
研究方法
收集多种具有代表性的糖苷酶，分别对其性能进行测试，并对结果进行比较和分析。同时，对不同来源的多糖 进行水解，分析水解产物的组成和结构。
运用生物信息学方法对糖苷酶的基因序列、氨 基酸组成和三维结构进行预测和分析，为理性 设计提供依据。
发展更高效的糖苷酶制备和纯化方法，提高应用效率。
制备方法
01
探索更高效的制备方法，包括基因克隆、表达和纯化等步骤，
以降低成本和提高产量。
纯化方法
02
开发新的纯化技术，利用色谱、电泳等手段，提高糖苷酶的纯
多糖组成分析
单糖组成分析
利用糖苷酶水解多糖，分析释放出的单糖种类和比例，确定多糖的组成。
糖苷键类型分析
通过分析水解产物中单糖之间的连接方式，确定多糖中的糖苷键类型。
多糖链构象分析
分子量分布
利用糖苷酶处理多糖，通过凝胶色谱法或 超滤法测定分子量及分布。
n-乙酰氨基 葡萄糖-6-硫酸酶,-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶
n-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酶，-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶1. 引言1.1 概述本文旨在探讨n-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酶和n-乙酰氨基葡萄糖苷酶这两种重要的生物分子。
这两种酶在生物体中起着关键的作用，参与了一系列重要的生化反应和代谢过程。
通过对它们的结构、功能以及联系与区别的分析，我们可以更好地理解它们在细胞活动中的作用机制，进而为人类健康提供新的研究路径和治疗方法。
1.2 文章结构本文将从以下几个方面来进行论述：首先是对n-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酶进行介绍，包括其定义、作用、结构特点以及生理功能。
然后是对n-乙酰氨基葡萄糖苷酶进行详细阐述，包括其功能、反应机制以及应用领域。
接下来将比较分析这两种酶在结构和生物学功能上的差异与联系，并探讨它们对人体健康的影响与意义。
最后，文章将总结当前研究成果和重要发现，并展望未来的研究方向与挑战，并提出相关建议或启示。
1.3 目的本文的主要目的是通过对n-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酶和n-乙酰氨基葡萄糖苷酶的全面介绍和分析，加深对这两种关键生物分子的认识。
同时，探讨它们在细胞活动中的作用机制以及其对人体健康的影响与意义。
希望通过本文的阐述，能够为今后相关领域的深入研究提供一定的指导，并为相关治疗方法和药物开发提供新思路。
2. n-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酶2.1 定义和作用n-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酶（N-acetylglucosamine-6-sulfatase）是一种重要的酶类，在生物体内发挥着关键的功能。
它属于硫酸酶家族，在细胞质或溶酶体中起着催化反应的作用。
该酶在早期被认为仅存在于哺乳动物中，但随后被发现在许多其他生物群体中也广泛存在。
其作用是将n-乙酰氨基葡萄糖分子上的位置6上的硫酸基团水解掉，从而形成未被硫酸化的产物。
该反应参与了特定底物的代谢途径，并调控着多种生理过程。
2.2 结构特点n-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酶是由一个单一聚合物组成，具有特定的空间结构。
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微生物糖苷酶的新型突变酶———硫代糖苷酶的产生及应用3卢丽丽 肖 敏33 赵 晗(山东大学微生物技术国家重点实验室 济南 250100)摘要:微生物糖苷酶的酸碱功能氨基酸突变酶能催化硫代糖苷的合成,这类酶被称为硫代糖苷酶。
目前发展的硫代糖苷酶有β2硫代葡糖苷酶、β2硫代甘露糖苷酶、β2硫代半乳糖苷酶、α2硫代木糖苷酶和α2硫代葡糖苷酶,来源于细菌和古细菌,能合成多种硫代糖苷。
最近,硫代糖苷酶被应用于糖蛋白的糖基化修饰,首次人工合成硫代糖蛋白。
微生物糖苷酶合成功能的新延伸,对糖生物学、生物技术和制药业的发展将有着重要意义。
关键词:糖苷酶,硫代糖苷酶,合成中图分类号:Q5,Q81 文献标识码:A 文章编号:025322654(2007)0420769204N ovel Mutants of Microbial G lycosidases ———G eneration and Application of Thioglycoligases 3LU Li 2Li XI AO M in 33 ZH AO Han(State K ey Laboratory o f Microbial Technology ,Shandong Univer sity ,Jinan 250100)Abstract :Acid Πbase mutants of glycosidases ,namely thioglycoligases ,are able to catalyze thioglycosides synthesis.N ow ,many thioglycoligases ,including β2thioglucoligase ,β2thiomannoligase ,β2thiogalactoligase ,α2thioxyloligase and α2thioglucoligase ,have been developed from bacteria and archaebacteria ,and applied in synthesizing various thioglycoligases.Recently ,thioglycoligases have been used to glycosylate the glycoprotein and firstly generate the thioglycoprotein.The novel extended synthetic function of glycosidases w ould prom ote the development of glycobiology ,biotechnology and pharmacy.K ey w ords :G lycosidases ,Thioglycoligases ,Synthesis 3国家“863”高技术研究发展计划项目(N o.2006AA10Z 338)国家十五攻关计划项目(N o.2004BA713B04206) 33通讯作者 T el :0531288365128,E 2mail :m inxiao @收稿日期:2006209227,修回日期:2006211222 微生物糖苷酶来源广泛,种类繁多。
有些糖苷酶除具有水解活性外,还具有转基活性,该性质使其成为糖类合成的重要工具,被用于大规模合成多种O 2糖苷。
近三年研究发现,微生物糖苷酶的一类新型突变酶即硫代糖苷酶(thioglycoligases )能催化硫代糖苷(thioglycosides )的合成,这一发现引起了科学家的极大兴趣。
硫代糖苷是O 2糖苷类似物,糖单位组成和空间结构与O 2糖苷类似,不同之处仅在于糖苷键通过硫原子起连接作用,不易被糖苷酶水解,具有重要的研究价值:①由于化学水解和酶解速率低,可以解决O 2糖苷易被内源糖苷酶水解的问题,从而作为O 2糖苷替代品,应用于药物疗法[1～3];②作为糖苷酶的竞争性抑制剂,与糖苷酶形成稳定的复合物用于X 2射线晶体结构分析[4,5],研究糖苷酶特异性和作用机制,探索其突变或缺陷引起人类疾病的分子机理;③用于制备亲和树脂纯化糖苷酶蛋白[6];④作为非降解性配体用于凝集素研究等等[7,8]。
由于硫代糖苷在生物技术和制药业方面的潜在价值越来越受到关注,相应地,其大量获得也成为当今研究的热点。
传统的化学法合成步骤繁琐,糖基转移酶法合成供体昂贵且酶来源有限。
而硫代糖苷酶作为一类新型催化剂,其微生物来源十分广泛,合成方法简单,合成产物种类丰富,甚至还能合成硫代糖蛋白,用于药用糖蛋白的生产,因而显示出极大的优点,具有很好的应用前景。
1 硫代糖苷酶的产生及作用机制天然糖苷酶催化合成反应时,其催化中心酸碱功能氨基酸和亲核体氨基酸(谷氨酸或天冬氨酸)的一对羧基起着重要作用,分别作为广义酸碱(acid Πbase )和亲核体(nucleophile ),通过双置换机制保持构型不变来催化两步反应[9]:第一步是酶的糖基化,亲核体羧基直接作用于底物,形成共价键糖基2酶中间物,酸碱羧基先进行酸催化,提供质子,促使底物离去基团的离去;反应第二步是酶的去糖基化,酸碱羧基进行碱催化,激活糖受体分子,发生转糖基反应合成糖类(图1a )。
但天然糖苷酶通常只能合成O 2糖苷,不能以SH 2糖为受体进行转糖基反应。
而当天然糖苷酶酸碱功能氨基酸被不带负电荷的氨基酸(如丙氨酸)取代后,形成的突变酶能以二硝基苯糖苷或氟代糖为糖基供体,以SH 2糖为糖基受体高效合成硫代糖苷,因而被称为硫代糖苷酶。
这类酶由于缺少酸碱功能氨基酸,不能提供促进糖基供体离去基团离去的酸催化作用和激活糖受体分子发生转糖基的碱催化作用,导致酶的糖基化和去糖基化两步反应速率都会降低。
而当以二硝基苯糖苷等带有强离去基团的糖苷为糖基供体时,由于不需要提供酸催化,第一步反应会加快。
当以SH 2糖为糖基受体时,由于SH 2糖亲核性比OH 2糖强,糖基2酶中间物不需要碱催化即可转糖基到受体分子上(图1b ),第二步反应也会加快。
最终形成的硫代糖苷产物因离去基团解离能力很弱,不能被酶水解,可以大量积累[10]。
图1 糖苷酶和硫代糖苷酶催化糖类合成的机制[9,10](a )糖苷酶;(b )硫代糖苷酶2 硫代糖苷酶的获得及筛选硫代糖苷酶的获得,首先要确定糖苷酶的酸碱催化位点,可采用定点突变的方法,即将不同来源的酶序列进行同源性比对,对完全同源的谷氨酸或天冬氨酸分别进行突变:若突变酶水解简单O 2糖苷(需要提供酸催化)的速率大大低于12氟代糖(不需要提供酸催化),则突变位点为酸碱功能氨基酸;若反应中加入外源亲核剂如叠氮化物,突变酶反应速率大大提高,且生成的糖基叠氮化物构型不变,则可进一步确定该位点的酸碱催化功能[11]。
糖苷酶酸碱催化位点取代的氨基酸不同,形成的硫代糖苷酶的活性也存在差异,这就需要在该位点进行饱和突变,进一步筛选高效突变酶。
目前有两种筛选方法:一种是常见的低通量筛选方法,用薄层层析(T LC )检测突变酶的转糖基产物;另一种是高通量筛选方法,在反应体系中加入筛选酶,该酶不水解带荧光基团的糖基受体,只水解带荧光基团的硫代糖苷产物,通过检测产物释放的荧光来进行筛选。
Mullegger 等在对土壤杆菌(Agrobacterium sp.)β2葡糖苷酶(Abg ,EC3.2.1.21)的酸碱催化位点进行饱和突变时,首次使用了上述两种筛选方法,证实了其有效性。
在T LC 筛选中,将重组子细胞粗酶液与2,42二硝基苯2β2葡糖苷和甲基伞形酮242巯基2葡糖苷反应,产物用荧光T LC 板分离检测,共筛选到10种有活性的突变酶,包括Abg E171A 和E171G 等。
在筛选酶联合筛选中,考虑到二硝基苯离去基团会淬灭甲基伞形酮的荧光,选择葡糖基叠氮化物为糖基供体;糖基受体不变;筛选酶为来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum sp.lycoper si )的内切葡聚糖酶1(EG 1,EC3.2.1),EG 1不水解甲基伞形酮242巯基2葡糖苷,只水解转糖基产物(图2)。
该方法筛选到1种有活性的突变酶Abg E171Q 。
糖基供体的不同导致两种方法的筛选结果也不一致,将突变酶进行动力学分析,结果表明:E171Q 催化多种糖基供体转糖基到甲基伞形酮242巯基2葡糖苷的效率均高于最初获得的突变酶E171A (见3.1),且以糖基叠氮化物为供体时的反应速率提高了100倍;当糖基受体为甲基伞形酮242巯基2半乳糖苷时,Abg E171G 催化半乳糖基或其它糖基转移的效率最高[12]。
图2 应用筛选酶筛选硫代糖苷酶的机制[12]3 不同硫代糖苷酶的微生物来源及其特征311 β2硫代葡糖苷酶Jahn 等2003年首次报道了硫代糖苷酶,通过点突变技术在土壤杆菌Abg 催化中心用丙氨酸取代第171位谷氨酸,造成酸碱功能氨基酸突变,形成的硫代葡糖苷酶Abg E171A 能以2,42二硝基苯2β2葡糖苷和硝基苯2巯基2糖苷为底物,合成β21,42硫代糖苷,产量为64%～85%[10,13]。
突变酶的区域选择性与天然糖苷酶不一致,受体分子中巯基的位置决定其区域选择性[10]。
Mullegger 等2005年在Abg 酸碱催化位点进行饱和突变,获得了反应速率更高的突变酶Abg E171Q 和Abg E171G [12],进一步丰富了硫代糖苷酶酶库。
312 β2硫代甘露糖苷酶Jahn 等2003年同样采用点突变技术,对粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi )β2甘露糖苷酶(Man2A ,EC3.2.1.25)进行基因改造,用丙氨酸取代第429位谷氨酸,形成的硫代甘露糖苷酶Man2A E429A 能以2,52二硝基苯2β2甘露糖苷和硝基苯2巯基2糖苷为底物合成β21,42硫代糖苷,产量为35%～82%[12]。
313 β2硫代半乳糖苷酶K im 等2006年在木薯萎蔫病黄单胞菌(Xanthomonas manihotis )β2半乳糖苷酶(BgaX ,EC3.2.1.23)的酸碱催化位点进行点突变,形成的硫代半乳糖苷酶BgaX E184A 能以3,42二硝基苯2β2半乳糖苷为糖基供体,以对硝基苯232巯基2葡糖苷、对硝基苯232巯基2半乳糖苷和对硝基苯242巯基2葡糖苷为糖基受体合成β21,3和β21,42硫代二糖,产量达80%以上。
由于G al 2β21,3Π1,4糖苷键位于具有药用价值的神经节苷脂及糖蛋白糖链中,因而BgaX E184A 将成为合成稳定的神经节苷脂及表面抗原类似物的有力工具[14]。
314 α2硫代木糖苷酶和α2硫代葡糖苷酶K im 等2006年首次报道了α2硫代糖苷酶,对大肠杆菌(E scherichia coli )α2木糖苷酶(Y icI ,EC3.2.1)和硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solf ataricus )α2葡糖苷酶(MalA ,EC3.2.1.20)酸碱催化位点的天冬氨酸分别进行突变,产生突变酶Y icI D482A 和MalA D416A ,获得了两个来源于糖苷酶家族31的硫代糖苷酶。