菊花CmAP1基因克隆及其植物表达载体构建

菊花CmAP1基因克隆及其植物表达载体构建作者：梁芳黄萍袁秀云崔波李霞来源：《南方农业学报》2017年第06期摘要：【目的】克隆菊花CmAPETALA1基因（CmAP1）并构建植物表达载体，为该基因功能的遗传改良打下研究基础。

【方法】采用同源克隆及RT-PCR从菊花叶片中克隆CmAP1基因，运用在线生物信息学分析工具对其核苷酸及氨基酸序列进行分析，利用实时荧光定量PCR对该基因的组织表达差异进行分析，并用双酶切法将目的基因与pCAMBIA1300载体连接，构建植物表达载体。

【结果】克隆获得的CmAP1基因（GenBank登录号KU872999）编码区开放阅读框（ORF）长741 bp，编码246个氨基酸；CmAP1蛋白属亲水性蛋白，分子质量约28.3 kD、理论等电点（pI）为8.76，预测该蛋白内含10个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点；蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明，CmAP1蛋白与CDM111蛋白的同源性达98%，属MADS-box基因家族A类基因的euAP1分支；实时荧光定量PCR分析结果表明，CmAP1基因在花蕾中表达量极高，在舌状花和筒状花中表达量较低，而在营养器官中仅痕量表达。

将CmAP1基因连接到pCAMBIA1300载体上，可成功构建植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1。

【结论】CmAP1基因在花的发育及形成过程中发挥重要作用，成功构建获得的植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1可为后期利用基因工程手段改變菊花花形态结构、调控花期及遗传改良打下基础。

关键词：菊花；CmAPETALA1（CmAP1）；基因克隆；植物表达载体；生物信息学中图分类号： S682.11 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）06-0000-08Cloning of CmAP1 gene from Chrysanthemum morifolium and establishment of its plant expression vectorAbstract：【Objective】CmAPETALA1 gene（CmAP1） in Chrysanthemum morifolium was cloned and its plant expression vector was established， in order to provide references for further study on genetic improvement of CmAP1 gene function. 【Method】CmAP1 gene was cloned from leaf of C. morifolium by method of homology cloning and RT-PCR. The nucleotide and amino acid sequence were analyzed by online bioinformatics tool. Expression difference of this gene was determined by real-time fluorescence quantitative PCR. CmAP1 gene was linked to pCAMBIA1300 vector by double enzyme digestion to establish plant expression vector. 【Result】CmAP1 gene （GenBank accession number：KU872999） was obtained by cloning. The open reading frame （ORF） of CmAP1 was 741 bp encoding 246 amino acids. CmAP1 protein was a hydrophilic protein，and the molecular weight of this protein was about 28.3 kD. Its theoretical isoelectric point （pI） was 8.76. It was predicted that the protein contained ten phosphorylation sites and two potential N-glycosayation sites. Sequence and phylogenic analysis showed that CmAP1 protein was close to C. morifolium CDM111 protein with 98% similarity， which both belonged to euAP1 clade of A type gene in MADS-box gene family. Real fluorescence quantitative PCR analysis indicated that expression of CmAP1 gene was extremely high in buds. The expression level was low in tubiform and lingulate florets and was in trace expression in vegetative organs. CmAP1 was linked topCAMBIA1300 vector and the plant expression vector pCAMBIA1300-CmAP1 was established successfully. 【Conclusion】CmAP1 gene plays an important role in growth and development of C. morifolium. The established plant expression vector pCAMBIA1300-CmAP1 is useful for further research on changing morphological structure of C. Morifolium by genetic engineering， regulation of flowering and genetic modification.Key words： Chrysanthemum morifolium； CmAPETALA1（CmAP1）； gene cloning；plant expression vector； bioinformatics0 引言【研究意义】成花过程是植物从营养生长向生殖生长转折的关键期。

调控植物成花过程的基因分为花序分生组织特征基因、花分生组织特征基因和花器官形态特征基因。

大部分花器官形态特征基因属于MADS-box转录因子家族基因，其中APETALA1/FRUITFULL（AP1/FUL）亚家族被认为既是花分生组织特征基因，又是花器官特征基因。

AP1基因是花瓣和萼片正常发育的必需基因（Alvarez-Buylla et al.，2006）。

菊花（Chrysanthemum morifolium）是重要的短日照作物之一，多数品种在自然条件下于每年10～11月开花，温室种植的菊花需人工调控光照周期，成本较高，而通过分子育种可缩短菊花对短日照的响应时间，有效降低温室供热及人力物力等生产成本。

因此，克隆菊花AP1基因（CmAP1）并进行植物表达载体构建对其基因功能的遗传改良具有重要意义。

【前人研究进展】迄今，已有很多植物的AP1同源基因被分离克隆，如马铃薯（樊春媛等，2010）、草莓（邹冬梅等，2012）、萼脊兰（崔波等，2013）、梨（Liu et al.，2013）、荷花（Kong et al.，2015）等。

Ellul等（2004）将拟南芥AP1基因转入番茄中，转基因番茄营养生长期缩短，开花期比对照提前，且不影响植株正常发育。

烟草中异源表达大豆AP1基因，表现为提前开花及花器官改变（Chi et al.，2011）。

白桦AP1基因过表达能引起早花，且影响很多开花相关基因的表达及二萜化合物的生物合成（Huang et al.，2015）。

在菊花MADS-box基因研究方面，Shchennikova等（2004）从菊花中分离出3个AP1/FUL亚家族基因CDM111、CDM8和CDM41及1个SEPALLATA3亚家族基因CDM44；Shulga等（2011）将CDM111、HAM75和HAM92基因分别转入菊花中，在长日照条件下转基因植株与对照在表型上无差异，短日照条件下花芽启动比对照提前两周，且转基因植株花色着色更早；Shchennikova等（2011）克隆出菊花AGAMOUS的同源基因CDM37，该基因能促进萼片中蜜腺的发育。

此外，将菊花CDM41（Goloveshkina et al.，2012）、CIM8（Wang et al.，2013）和SOC1（Fu et al.，2014）基因分别转入烟草和拟南芥中，均可使烟草和拟南芥提前开花且引起花形态异常。

【本研究切入点】目前，针对AP1同源基因克隆和生物信息学分析及植物表达载体构建的研究鲜见报道。

【拟解决的关键问题】以菊花晚花品种狮子头为试验材料，利用RT-PCR克隆CmAP1基因，并对该基因核苷酸及其推导氨基酸序列进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR对开花期菊花不同器官中该基因的表达量进行定量分析，构建植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1，以期为CmAP1基因功能的遗传改良提供参考依据。

1 材料与方法1. 1 试验材料1. 1. 1 植物材料供试菊花品种为黄色大花品种狮子头，由郑州好日子园艺有限公司提供；试验于2015年10月～2016年4月在郑州师范学院生物工程研究所进行。

取其叶片进行基因克隆，在盛花期分别取健康植株的根、茎、叶、花蕾、管状花及舌状花，用于分析目的基因在不同部位的表达量。

所有材料迅速用液氮冷冻，-80 ℃保存备用。

1. 1. 2 菌株和质粒大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、根癌农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）EHA105及植物表达载体pCAMBIA1300由郑州师范学院生物工程研究所分子实验室保存提供，pGEM-T Easy Vector购于宝生物工程（大连）有限公司。