05.第五章 DNA的生物合成 (复制)
5ˊ→ 3ˊ外切酶活性
+
切除引物 延长冈崎片段 校读作用 DNA损伤修复
—
DNA损伤修 复
—
延长子链
生物学功能
校读作用
①DNA-polⅠ(109kD) 功能:对复制中的 错误进行校读，对复 制和修复中出现的空 隙进行填补。 N端 DNA-pol Ⅰ
木瓜蛋白酶
C端
小片段
5 核酸外切酶活性
大片段/Klenow 片段
(3)真核生物的DNA聚合酶
DNA -pol 分子量（ kD ） 5 → 3 聚合活性 3 → 5 外切 酶活性 α α 16.5 中 起始引 发，引 物酶活 性 β 4.0 ？ 参与 损伤 与修 复 γ 14.0 高 + 线粒体 DNA 复 制 δ 12.5 高 + 延长子 链的主 要酶， 解螺旋 酶活性 ε 25.5 高 + 填补引物 空隙，切 除修复， 重组
(1)活性：53 的聚合活性；3 5外切酶活 性能辨认错配的碱基对，并将其水解； 5 3 外切酶活性能切除突变的 DNA片段。
5´
AG C T T C A G G A T A
3´
| | | | | | | | | | |
3´
?
5´
T C G AA G T C C T A G C G A C
C C A C T G G
G G T G A C C
+
亲代DNA
复制叉
子代DNA
第一节 复制基本规律与体系
一、复制的基本规律 基本规律
(一)半保留复制
1.概念 DNA合成时，以亲代DNA解开的两股单 链为模板，按碱基配对规律，合成子代DNA的过程。 子代DNA，一股单链来源于亲代，另一股单链为新合 成。子代和亲代的DNA碱基序列一致。这种复制方式 称为半保留复制。
3 方向可以连续的延长。
领头链的合成 /
2.随从链的延长
复 制 简 图
复 制 延 长 动 画
(三)复制的终止
1.原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制 片段在复制的终止点(ter)处汇合。
ori
0
ori
50
82
32
ter
ter
SV40
E.coli
2.随从链上不连续性5
OH
P
DNA-pol Ⅰ
5
P
ATP
DNA连接酶 ADP+Pi
5
5
二、真核生物的DNA生物合成
真核生物 DNA 复制在细胞周期的S期进行， 也可分为起始、延长和终止三个阶段，每个阶 段的基本过程与原核生物DNA复制相似，但存 在不少差异。
G2
DNA合成期
S G1
M 哺乳动物的 细胞周期
2.复制保真性的碱基选择
a) DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价(氢键)与共价 键(磷酸二酯键) 的有序形成。 b) 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧 啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。
H N H N
9 6
H H N
6
N
9
N P-R
N
N
N N
N R-P
顺式
反式
3.DNA复制保真性依赖三种机制
(telomerase)
端粒酶逆转录酶
(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)
5.端粒酶催化作用的爬行模型
真核DNA复制后，两个5ˊ末端的引物被切除，缺口 无法填补，故DNA将面临多次复制而逐渐缩短的问题。
第三节 DNA损伤与修复
(DNA Damage and Repair)
(2)原核生物的DNA聚合酶
DNA-pol Ⅰ DNA-pol Ⅱ DNA-pol Ⅲ
DNA聚合酶II 120 — + + DNA聚合酶III 900 60 000 + +
大肠杆菌E.coli中的三种DNA聚合酶
分类 分子量(KD) 聚合速率(核苷酸/分) 5ˊ→ 3ˊ聚合酶活性 3ˊ→ 5ˊ外切酶活性 DNA聚合酶I 109 1 000 + +
(Basic Rules and System of DNA Replication )
复制的方式——半保留复制 固定起始点 双向复制 半不连续复制 复制的高保真性
2.半保留复制的实验依据和意义 (1)密度梯度实验 含重氮-DNA的细菌
培养于普 通培养液
梯度离心结果
第一代
继续培养于 普通培养液
第二代 ——实验结果支持半保留复制的设想。
(二)复制的延长
真核生物的聚合酶δ催化子链的延长，并 有校正功能。引物和冈崎片段 (约200bp) 都比 较短。
3 5
亲代DNA
5 3 3 5
领头链 随从链
3
引物 核小体
5
(三)复制的终止
1.染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 2.复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 3.染色体两端DNA子链上复制的RNA引物，去除 后留下空隙。
a) 遵守严格的碱基配对规律。 b) 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能。 c) 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。
二、DNA复制的体系
(一) 底物(substrate) dATP, dGTP, dCTP, dTTP。
(二) 模板(template)
解开成单链的DNA母链。
(三) 引物(primer) 提供3-OH末端使dNTP可以 依次聚合的RNA(DNA)片断。 (四) 酶和蛋白因子 1.DNA聚合酶 全称为依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)，简称DNA-pol。
蛋白因子 DnaA (dnaA) DnaB (dnaB) DnaC (dnaC) DnaG (dnaG) SSB 通用名 解螺旋酶 引物酶 单链 DNA 结合蛋白 功能 辨认起始点 解开DNA双链 运送和协同DnaB 催化RNA引物生成 稳定已解开的单链
(4)DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 指理顺 DNA链，改变超螺旋状态的酶，分为I型和II型。
(2)子链继承母链遗传信息的几种可能方式
全保留式 (混合式)
半保留式
(3)半保留复制的意义 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA 的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗 传信息，体现了遗传的保守性。是物种稳定性 的分子基础，但不是绝对的。
(二)固定起始点 (三)双向复制
复制是从具有特异碱基序列的复制起始点开始。 原核生物(一个起始点)，真核生物(多个起始点)。 1.原核生物复制时， DNA从起始点向两个方 向解链，形成两个延伸 方向相反的复制叉，称 为双向复制。
5’ 3’
O O P OO-
3’ HO ATP ADP 3’ 5’ 5’
DNA 连接酶
5’ 3’
O
O P OO-
第二节 DNA复制的过程
(The Process of DNA Replication)
一、原核生物的DNA生物合成
(一)复制的起始
DNA解开成单链，提供模板。 需要解决两个问题 合成引物，提供3-OH末端。
5 3 3 5 3
5 3
5 3
5
3 5 3
5 3
+
(四)端粒与端粒酶
1. 端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末 端的结构。 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 2. 结构特点 末端序列是多重复富含G、C的短序列。
TTTTGGGGTTTTGGGG…
维持染色体的稳定性。 3.功能 维持DNA复制的完整性。 端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白 4. 端粒酶 (human telomerase associatedprotein 1, hTP1)
DNA聚合酶活性 ， 5 核酸外切酶活性
Klenow片段是实验室合成DNA的常用工具酶。
②DNA-pol Ⅱ(120kD)
DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与DNA损伤的应急状态修复。
③DNA-pol Ⅲ (250kD)
功能：是原核生 物 复制延 长中真 正 起催化作用的酶。
突变(Mutation)是指DNA分子中碱基序列 的改变，又称为DNA损伤(DNA damage)。 突变是进化、分化的分子基础 突变导致基因型改变 突变导致死亡 突变是某些疾病的发病基础
复制中的放射自显影示意图
A. 环状双链DNA及 复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点
ori ter
A
B
C
2.真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制 子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为 一个复制子。复制子是独立完成复制的功能单位。
5’ 3’ 5’ 3’ ori ori ori ori 3’
58 66 166 174 201 209 237 245
E.coli复制起始点 oriC
2. 引发体和引物
Dna B、 Dna C Dna A 5 3 DNA拓扑异构酶 SSB 5 3
含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复
制起始区域的复合结构称为引发体。
3
5 3
引物
5
引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。
第五章 DNA的生物合成 (复制)
(DNA Biosynthesis，Replication)
复制是指以亲代DNA为模板合成子链DNA的过程。
A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C AT GC GC T A AT CG T A GC CG CG AT CG T A GC GC AT GC GC T A AT CG T A GC CG CG AT CG T A GC GC
临床执业助理医师--生物化学试题答案及解析(二)
临床执业助理医师--生物化学试题答案及解析（二）第五章氧化磷酸化「考纲要求」1.ATP与其他高能化合物：①ATP循环有高能磷酸键；②ATP的利用；③其他高能磷酸化合物。
2.氧化磷酸化：①氧化磷酸化的概念；②电子传递链；③ATP合成酶；④氧化磷酸化的调节。
「考点纵览」1. ATP是体内能量的直接供应者。
2.细胞色素aa3又称为细胞色素氧化酶。
3.线粒体内有两条重要的呼吸链：NADH氧化呼吸链和琥珀酸氧化呼吸链。
4.呼吸链中细胞色素的排列顺序为：b cl c aa3。
5.氰化物中毒的机制是抑制细胞色素氧化酶。
「历年考题点津」1.通常生物氧化是指生物体内A.脱氢反应B.营养物氧化成H2O和CO2的过程C.加氧反应D.与氧分子结合的反应E.释出电子的反应答案：B2.生命活动中能量的直接供体是A.三磷酸腺苷B.脂肪酸C.氨基酸D.磷酸肌酸E.葡萄糖答案：A3.下列有关氧化磷酸化的叙述，错误的是A.物质在氧化时伴有ADP磷酸北生成ATP的过程B.氧化磷酸化过程存在于线粒体内C.P/O可以确定ATP的生成数D.氧化磷酸化过程有两条呼吸链E.电子经呼吸链传递至氧产生3分子ATP答案：E第六章脂肪代谢「考纲要求」1.脂类生理功能：①储能；②生物膜的组成成分。
2.脂肪的消化与吸收：①脂肪乳化及消化所需酶；②一脂酰甘油合成途径及乳糜微粒。
3.脂肪的合成代谢：①合成部位及原料；②基本途径。
4.脂肪酸的合成代谢：部位及原料。
5.脂肪的分解代谢：①脂肪动员；②脂肪酸的氧化。
「考点纵览」1.必需脂肪酸指亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸。
2.脂肪的合成原料为乙酰辅酶A和NADPH.3.脂肪分解的限速酶是激素敏感性甘油三酯脂肪酶。
4.酮体生成的限速酶是HMG-CoA合成酶。
5.酮体利用的酶是乙酰乙酸硫激酶和琥珀酸单酰CoA转硫酶。
6.肝内生酮肝外用。
「历年考题点津」1.下列属于营养必需脂肪酸的是A.软脂酸B.亚麻酸C.硬脂酸D.油酸E.十二碳脂肪酸答案：B2.体内脂肪天量动员时，肝内生成乙酰辅酶A主要生成A. 葡萄糖B.二氧化碳和水C.胆固醇D.酮体E.草酰乙酸答案：D3.脂肪酸合成的原料乙酰CoA从线粒体转移至胞液的途径是A.三羧酸循环B.乳酸循环C.糖醛酸循环D.柠檬酸-丙酮酸循环E.丙氨酸-葡萄糖循环答案：D4.合成脂肪酸的乙酰CoA主要来自A.糖的分解代谢B.脂肪酸的分解代谢C.胆固醇的分解代谢D.生糖氨基酸的分解代谢E.生酮氨基酸的分解代谢答案：A5.下列关于酮体的描述错误的是A.酮体包括乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮B.合成原料是丙酮酸氧化生成的乙酰CoAC.只能在肝的线粒体内生成D.酮体只能在肝外组织氧化E.酮体是肝输出能量的一种形式答案：B6.脂肪酸合成过程中，脂酰基的载体是A.CoAB.肉碱C.ACPD.丙二酰CoAE.草酰乙酸答案：A第七章磷脂、胆固醇及血浆脂蛋白「考纲要求」1.甘油磷脂代谢：①甘油磷脂基本结构与分类；②合成部位和合成原料。
第五章 DNA的复制3
真核生物DNA聚合酶
不同生物的DNA复制体系
三、SV40的DNA复制 的 复制
SV40（simian virus 40）病毒只编 码一个蛋白质T抗原，以供基因组复 制的需要，其他复制所需要的蛋白 质由宿主细胞提供。 SV40 DNA的复制发生在宿主细胞 核中，在病毒和细胞DNA复制之间 有很多相似之处，这使SV40病毒成 为研究真核生物细胞DNA复制的理 想模型体系。
隔膜
控制DNA复制重新起始的机制还不是 完全清楚，可能会包括以下几种情 况： ① 复制起点的物理隔离 ② 再甲基化的延迟 ③ DnaA对复制起点的结合 ④ dnaA基因转录的抑制
真核生物的基因组是由许多复制子 （replicon）组成的，每个复制子的 复制起点在一个细胞周期内同样也只 能被激活一次。 问题的实质集中在以下两个问题上： ① 调节系统是如何识别已经发生复制的 起点的？ ② 有哪些蛋白质成分参与了这些调控过 程？
Rapid growth and preparation for DNA synthesis DNA synthesis and histone synthesis phase
S
G0
Quiescent cells
静止的
G1
phase
phase
M
phase
G2
Growth and preparation for cell division
在半甲基化阶段，复制起点是无活 性的（ inert ），而且dnaA的表达也 受到抑制，DNA复制的起始蛋白的 产量很低。 已经确定，SeqA基因的突变可以缩 短oriC和dnaA再甲基化所需要的时 间。SeqA与半甲基化状态DNA的结 合力比与全甲基化DNA结合力更强。
(完整word)原核生物DNA的复制
原核生物DNA的复制1．与复制有关的酶及蛋白质：(1）拓扑异构酶：通过切断并连接DNA双链中的一股或双股,改变DNA分子拓扑构象,避免DNA分子打结、缠绕、连环,在复制的全程中都起作用.其种类有：拓扑异构酶I和拓扑异构酶II,拓扑异构酶I能切断DNA 双链中一股并再连接断端，反应不需ATP供能；拓扑异构酶II能使DNA双链同时发生断裂和再连接，需ATP 供能,并使DNA分子进入负超螺旋.(2) 解螺旋酶： DNA进行复制时，需亲代DNA的双链分别作模板来指导子代DNA分子的合成，解螺旋酶可以将DNA双链解开成为单链。
大肠杆菌中发现的解螺旋酶为DnaB。
（3）单链结合蛋白（SSB）：在复制中模板需处于单链状态,SSB可以模板的单链状态并保护模板不受核酸酶的降解.随着DNA双链的不断解开，SSB能不断的与之结合、解离。
(4）引物酶：是一种RNA聚合酶，在复制的起始点处以DNA为模板，催化合成一小段互补的RNA。
DNA 聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合反应,若没有引物就不能起始DNA合成。
引物酶能直接在单链DNA模板上催化游离的NTP合成一小段RNA,并由这一小段RNA引物提供3’-OH，经DNA聚合酶催化链的延伸.（5） DNA聚合酶：是依赖DNA的DNA聚合酶，简称为DNA pol，以DNA为模板，dNTP为原料，催化脱氧核苷酸加到引物或DNA链的3’—OH末端，合成互补的DNA新链，即5’→3'聚合活性。
原核生物的DNA 聚合酶有DNA polI、DNA pol II和DNA pol III，DNA pol III是复制延长中真正起催化作用的，除具有5’→3’聚合活性,还有3’→ 5’ 核酸外切酶活性和碱基选择功能,能够识别错配的碱基并切除，起即时校读的作用；DNA pol I具有5'→3’聚合活性、3’→ 5'和5'→3’核酸外切酶活性，5’→3’核酸外切酶活性可用于切除引物以及突变片段,起切除、修复作用。
原核生物及真核生物DNA复制
真核生物DNA聚合酶及有关蛋白
表 真核生物五种DNA聚合酶
DNA聚合 酶
位置
功能α核 引发 Nhomakorabeaδ
核 合成
ε
核 修复
βγ
核 线粒体 修复 复制
相对活性 80% 分子量 300K
170-230K
250K
亚基
3’→5’ 外切
催化核心（180K） 催化核心
催化核
两个引物酶(60,50K) (125K)
心
一个未知
原核生物及真核生物DNA复制
9、单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：稳定已被解开的DNA 单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶 降解。
原核生物及真核生物DNA复制
（三）DNA的复制过程（大肠杆菌为例）
双链的解开
RNA引物的合成
DNA链的延伸
切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的
5、 DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶 ●以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物 ●反应需要有模板的指导 ●反应需要有3-OH存在 ●DNA链的合成方向为5 3
原核生物及真核生物DNA复制
原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌）
性质
聚合酶Ⅰ 聚合酶Ⅱ 聚合酶 Ⅲ
3' 5 '外切活性 +
+
+
5' 3 '外切活性 +
在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并 连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的 方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一 条完整的DNA链为原滞核生后物及链真核。生物DNA复制
在DNA复制过程中，前导链能连续合成， 而滞后链只能是断续的合成53 的多 个短片段，这些不连续的小片段称为冈 崎片段。
郜刚分子生物学-05-DNA半不连续复制与修复
④ Unwound-replicate-rewound ⑤ Only one origin（oriC）
θ复制的特点
• 多数环状DNA采用的复制方式 • 复制叉式复制，两个复制叉，双向等速或 者不等速复制 • 有先导链和后随链之分
滚环复制
φX174
ori
环状亲本DNA，双链
3’-OH 5’-p
限制性内切酶在复制起点 识别特异序列，切开一条 单链
推断
• 1、DNA复制过程中两条链不是同时合成的， 存在一定的时间差 • 2、一条链先合成是连续的，称为前导链； 另一条链是不连续的，称为后随链 • 3、一个酶分子同时完成前导链和后随链的 复制，说明这个酶分子有两个活性中心， 一个活性中心复制前导链的合成，另一个 活性中心负责后随链的合成
DNA聚合酶的结构特点：双组分不对称
• a、终止序列 E.coli 有两个终止区域， 分别结合专一性的终止蛋白 序列一：terE terD terA 序列二：terF terB terC 每个区域只对一个方向的复制叉起作用 • b、专一性终止蛋白 E.coli 中由 tus gene 编码 通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用
一个问题？
随着loop的形成，后随链上的核心 酶解离，释放出已经合成的冈崎片 段，并且在复制叉前端暴露出了下 一个冈崎片段的引物，于是β 夹子结合上来，继而核心酶结合， 形成全酶，完成下一个冈崎片段的 复制。。。。。。如此重复直至终 止。
DNA聚合酶Ⅲ催化先导链和后随链同时合成
当先导链复制出大约一个冈崎片段长度，在后随 链上暴露出第一个引物结合位点，引发酶引发一 段引物，
John Cairns provided a well-designed demonstration of E. coli chromosomal replication in 1963. In his experiment, he radioactively labeled the chromosome by growing his cultures in a medium containing 3H-thymidine. The nucleoside base was incorporated uniformly into the bacterial chromosome. He then isolated the chromosomes by lysing the cells gently and placed them on an electron micrograph (EM) grid which he exposed to X-ray film for two months. This Experiment clearly demonstrates the theta replication model of circular bacterial chromosomes
第五章、病毒的复制
❖ 但对于RNA病毒来说，病毒编码的一种RNA依赖 性RNA聚合酶，即可以是转录酶，也可以是复 制酶，所以这种酶常被称为转录/复制酶。
➢ 还有的RNA病毒如逆转录病毒可以编码合成逆 转录酶/RNase H，由它催化病毒基因组RNA逆 转录合成原病毒DNA；DNA病毒如嗜肝DNA病毒 、花椰菜花叶病毒编码合成的DNA聚合酶，也 具有逆转录酶/ RNase H活性，能够催化全长 的前基因组RNA逆转录生成负链DNA，再复制
➢ 脊髓灰质炎病毒含有正链RNA基因组，其5 '端 没有类似真核生物mRNA5 '端的帽子结构，但5 端有共价结合的VPg蛋白，其VPg-pUpU可能也 是RNA基因组复制起始所必需的引物。
➢ 细小病毒由于ssDNA基因组的两端有末端重复 序列形成的反转发夹结构，其反转发夹环可作 为引物起始DNA的合成，因而不需要RNA引物的 存在。
➢ 3．链置换方式
DNA噬菌体Ø 29、腺病毒、痘病毒基因组dsDNA 以及细小病毒RF DNA是以链置换方式进行复制 的，在链置换方式复制过程中，通常以3’ ￫ 5’的DNA链作为模板，并且由新合成的生长链 置换出与模板链互补的亲链，然后新生链和模 板链互补生成子代dsDNA。
➢ 除此而外、腺病毒和 Ø 29在复制过程中置换出 来的亲链，经过末端反向重复序列互补可以产 生锅柄样环形分子，这种锅柄样环形分子在末 端重复序列互补处以链置换方式起始复制，合 成双链DNA。
➢ 嗜肝DNA病毒科的乙型肝炎病毒（HBV）的病毒 粒子内携带有自身编码DNA聚合酶和末端DNA结 合蛋白（TP）。DNA聚合酶和TP的ORF在HBV基 因组的P区内，此DNA聚合酶为碱性蛋白，富含 组氨酸， 具有逆转录酶和RNase H的活性。
➢ 2．RNA病毒自身编码的复制酶
第五章DNA生物合成
旧链
新链
• 子链继承母链遗传信息的几种可能方式
全保留式
半保留式
混合式
（四） 复制的起点和方向
1.概念 概念
●
复制子(replicon)：基因组能独立进行复制的单位。 ：基因组能独立进行复制的单位。 复制子 独立进行复制的单位 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制 子.
第五章
DNA的生物合成 的生物合成
原核生物的DNA复制 第一节 原核生物的 复制 第二节 真核生物的 真核生物的DNA复制 复制 第三节 DNA的损伤修复 的损伤修复 第四节 DNA的重组 的重组
DNA具有储存、传递（包括复制、转录、翻译） 具有储存、传递（包括复制、转录、翻译） 具有储存 和接受（反转录）遗传信息的功能。 和接受（反转录）遗传信息的功能。 DNA的生物合成包括 的生物合成包括DNA的复制、损伤修复和重 的复制、 的生物合成包括 的复制 组。 DNA复制是保持DNA分子的忠实拷贝过程 DNA复制是保持DNA分子的忠实拷贝过程，具有 分子的忠实拷贝过程， 复制是保持 高度的忠实性，DNA修复和重组是影响遗传信息 高度的忠实性， 修复和重组是影响遗传信息 本身结构的调整过程，保持遗传信息的完整性。 本身结构的调整过程，保持遗传信息的完整性。
2）功能： ）功能：
聚合酶活性（ ① 5′→3′聚合酶活性（大片段上）； 聚合酶活性 大片段上）； 酶与模板结合后构象改变，识别碱基， 酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正确配对后才 发挥聚合作用；（错误率10-5） 发挥聚合作用；（错误率 ；（错误率 外切酶活性（ ② 3′→ 5′外切酶活性（大片段上）； 外切酶活性 大片段上）； 仅对短的单链DNA起作用，主要是对新生DNA链进行 起作用，主要是对新生 仅对短的单链 起作用 链进行 校对，防止“错配” 错误率5*10-2） 校对，防止“错配”； （错误率 外切酶活性（ ③ 5′→3′外切酶活性（小片段上）。 外切酶活性 小片段上）。 仅作用于双链DNA，可切除由紫外线照射形成的嘧啶二 ， 仅作用于双链 聚体，也可切除冈崎片段5’端RNA引物。 聚体，也可切除冈崎片段 端 引物。 引物
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
天津大学生物化学05第五章核酸化学
（二）DNA的二级结构1(总)
1．DNA双螺旋结构模型的要 点 2．双螺旋结构的稳定因素 3．DNA双螺旋的不同类型
.
（二）DNA的二级结构2
➢公 认 的 为 1953 年 watson 和 crick 提 出 的 DNA 双 螺旋结构模 型
.
（二）DNA的二级结构3
➢此模型的建立主要基于两方面的根据 ➢（1）碱基组成A=T，C=G，并证明A 与T之间可生成两个氢键，而C与G之间 三个氢键。 ➢（ 2 ） X 衍 射 结 构 分 析 ： 不 同 来 源 的 DNA纤维具有相似的X光衍射图谱。
➢含量:占总RNA的5% ➢存在：在细胞核中以DNA为模板被合成以后，
可能暂存于核仁内，也可能立即转移到胞质中， 并以每分子mRNA与几个或几十个核蛋白体结合 成串珠样的多核蛋白体形式而存在。
➢特点：一般都很不稳定，代谢活跃，更新迅速，
寿命较短，种类很多。
➢功能:在蛋白质生物合成中起传递遗传信息的作
➢（2）离子键及范德华力：DNA分子中磷酸基因在生理 条件下解离，使DNA成为一种多阴离子，这有利于它与 带正电荷的其它阳离子基团发生静电作用，这样减少双链 间的静电排斥，有利于双螺旋的稳定。
➢（3）碱基堆积力：目前普遍认为堆积碱基间的疏水作 用是稳定DNA结构的更重要的因素。大量碱基层层堆积， 两相邻碱基的平面十分贴近，于是使双螺旋结构内部形成 一个强大的疏水区，与介质中的小分子隔开，有利于互补 碱基之间氢键的形成。
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1．DNA双螺旋结构模型要点1（1）
➢（1）DNA分子是由两条方向相反的平行 的多核苷酸链构成。即p5’-糖3‘-p的结构 与p3’-糖5‘-p的结构相对;两条链的糖－磷 酸主链都是右手螺旋，有一共同的螺旋轴。
DNA复制及蛋白质合成过程
DNA复制及蛋白质合成过程DNA复制和蛋白质合成是生物体内两个重要的生物化学过程。
DNA复制是指DNA分子通过复制过程产生两个完全相同的复制体，而蛋白质合成则是指RNA分子通过翻译过程合成蛋白质。
这两个过程对于生物体维持遗传信息的稳定性和正常的生命活动都至关重要。
首先，我们来探讨DNA复制的过程。
DNA复制发生在细胞分裂的前期，确保每个新生细胞都具有与母细胞完全相同的遗传信息。
DNA复制是一个精确且有序的过程，它发生在细胞核内。
DNA复制的过程通常分为三个主要步骤：解旋、复制和连接。
首先，双链DNA中的两条链被酶分子解旋，并暴露出复制起点。
然后，在DNA链的起始位点上，RNA引物被合成并与DNA模板配对形成初级转录复合物。
然后，DNA聚合酶继续从RNA引物开始合成新的DNA链，这称为连续复制。
在另一条DNA链上，DNA聚合酶需要合成片段，然后由DNA 连接酶将片段连接在一起，这称为间断复制。
DNA复制的精确性得益于许多酶和蛋白质的协同作用。
DNA聚合酶是最重要的酶之一，它能将碱基按照互补配对的规则添加到新的DNA链上。
此外，蛋白质复制因子还起到辅助DNA聚合酶的作用，确保DNA复制的顺畅进行。
细胞还借助一种称为DNA修复酶的机制来修复复制过程中可能出现的错误。
接下来，让我们了解蛋白质合成的过程。
蛋白质合成发生在细胞质的核糖体内，是一种将RNA信息转化为蛋白质的过程，这个过程称为翻译。
翻译的过程可以分为三个主要步骤：起始、延伸和终止。
首先，RNA聚合酶将DNA信息转录为RNA分子，其中的信号序列指导RNA分子到达核糖体。
在核糖体上，起始复合物会将RNA分子与特定的起始tRNA结合起来。
然后，核糖体会将氨基酸根据RNA上的密码子进行配对，合成蛋白质的氨基酸序列，这称为延伸阶段。
最后，当核糖体达到RNA的终止密码子时，蛋白质合成停止。
蛋白质合成的过程中，多个辅助蛋白质和酶也参与其中。
例如，氨基酸连接酶将tRNA上的氨基酸与mRNA上的密码子配对，将氨基酸逐渐加到蛋白质链上。