薄层层析色谱(点板)
NO5 薄层色谱
三.实验装置图 实验装置图
展开剂（流动相）：6ml环己烷和 环己烷和2ml苯 展开剂（流动相）： ）： 环己烷和 苯 倒入展开剂，盖好盖子，放一段时间， 倒入展开剂，盖好盖子，放一段时间，然后 放入板，再盖上盖子。 放入板，再盖上盖子。 （目的：层析缸内展开剂的蒸汽压达到饱和， 目的：层析缸内展开剂的蒸汽压达到饱和， 排除溶剂挥发气态分子扩散造成的影响） 排除溶剂挥发气态分子扩散造成的影响） 层析缸不能洗
薄层色谱TLC
薄层层析 点板 爬板
赵
斌
zhaobinwily@
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一.实验目的 实验目的
1. 了解薄层色谱分析的原理和应用。 了解薄层色谱分析的原理和应用。 2. 掌握薄层色谱分离异构体的方法。 掌握薄层色谱分离异构体的方法。
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二.实验原理 实验原理
色谱法是分离提纯和鉴定有机化合物的重要方法。 色谱法是分离提纯和鉴定有机化合物的重要方法。 薄层色谱是一种微量、快速、简单、准确的定性分析方法， 薄层色谱是一种微量、快速、简单、准确的定性分析方法， 可在精制样品、化合物鉴定、 可在精制样品、化合物鉴定、跟踪反应进程和柱色谱摸索最 佳条件等方面得到应用。 佳条件等方面得到应用。 吸附剂（固定相） 硅胶，干燥， 吸附剂（固定相）：硅胶，干燥，活化 展开剂（流动相）：一种极性强的溶剂＋一种极性弱的溶剂 展开剂（流动相） 一种极性强的溶剂＋ 吸附能力弱的组分（即极性较弱）随流动相迅速向前移动， 吸附能力弱的组分（即极性较弱）随流动相迅速向前移动， 吸附能力强的组分（即极性较强的）移动慢。 吸附能力强的组分（即极性较强的）移动慢。 利用各组分在展开剂中溶解能力和被吸附能力的不同， 利用各组分在展开剂中溶解能力和被吸附能力的不同，最终 将各组分彼此分开， 将各组分彼此分开， 薄层板上将显示出各种有色斑点（若本身无色的情况呢？ 薄层板上将显示出各种有色斑点（若本身无色的情况呢？）
薄层色谱TLC(点板)的基本原理
薄层色谱(点板)的基本原理★★薄层色谱，或称薄层层析(thin—1ayer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。
这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法，从50年代发展起来至今，仍被广泛采用。
(一)基本原理薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板，也可用涤纶布等)上形成薄层，然后用相应的溶剂进行展开。
薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。
一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。
吸附是表面的一个重要性质。
任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。
在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。
物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。
在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。
而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。
吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。
在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。
吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。
例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。
当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。
薄层色谱层析操作规程
薄层色谱层析操作规程1. 引言薄层色谱（TLC）是一种常用的分离和分析技术，适用于有机物和天然产物的检测、纯化和鉴定。
本操作规程旨在提供一种标准化的TLC操作步骤，以确保结果的准确性和可重复性。
2. 实验材料和仪器设备•薄层色谱板：选择合适的固定相和基底材料的薄层色谱板。
•检测溶剂：根据需要选择合适的溶剂，常用的有乙醚、醋酸乙酯、甲醇、正己烷等。
•样品：准备待测物的溶液或提取液。
•试剂：例如显色剂、定位剂等。
•色谱槽：用于放置色谱板的槽状容器。
•喷雾开发箱：用于显色和可视化样品。
3. 操作步骤3.1 准备工作1.检查薄层色谱板是否完整，如有损坏需更换。
2.在色谱板上使用铅笔标记出样品和参比物的位置。
3.2 样品处理1.准备待测物的溶液或提取液，并将其过滤以去除杂质。
2.如需测定混合物中的成分，可先进行分离提取。
3.3 上样1.使用微量锥或玻璃管在标记位置上均匀地涂抹样品。
2.上样后务必避免接触色谱板其他区域。
3.4 开发1.将色谱板放置在色谱槽中，加入适当的检测溶剂。
注意溶剂的选择应根据待测物的性质和溶解性来确定。
2.等待溶剂上升至足够高度，将色谱板取出并迅速标记并扫描涂点位置。
3.5 显色和观察1.将色谱板放入喷雾开发箱中，并加入适当的显色剂。
2.等待显色剂完全插入后，将色谱板取出并进行观察。
3.6 数据处理1.使用适当的测量工具，如图像分析软件，测量色谱带的迁移距离和Rf值。
2.进行定性和定量分析，根据需要绘制色谱图。
4. 安全注意事项1.使用化学品和有机溶剂时必须戴上防护手套和防护眼镜，以防止溅入眼睛或与皮肤接触。
2.所有操作需在通风良好的实验室中进行，避免吸入有害气体。
3.注意操作时避免产生火源，如禁止吸烟和使用明火。
4.做好废弃物的处理工作，避免对环境造成污染。
5. 结论本操作规程提供了一套标准化的薄层色谱层析操作步骤，涵盖了样品准备、上样、开发、显色和观察、数据处理等关键步骤。
通过遵守操作规程和安全注意事项，可以准确、高效地进行薄层色谱层析实验，并获得可靠的结果。
薄层层析色谱(点板)
检验系生化教研室 李莉
一、吸附层析的概念及原理
▪ 吸附：一种物质被聚集在另一种物质表面， 这种现象是吸附。
▪ 吸附剂：凡是能够将其他物质聚集到本身 分子表面的物质称为吸附剂，如氧化铝、 硅胶等。
▪ 被吸附物：聚集在吸附剂表面的分子就称 为被吸附物。
▪ 吸附层析（Absorption Chromatography):
rinse the microcap with clean solvent by first filling it . . .
. . . and then draining it by touching it to a paper towel
here's the TLC plate, spotted and ready to be developed
Measure 0.5 cm from the bottom of the plate. Take care not to press so hard with the pencil that you disturb the adsorbent.
Using a pencil, draw a line across the plate at the 0.5 cm mark. This is the origin: the line on which you will "spot" the plate.
Handle the plates carefully so that you do not disturb the coating of adsorbent or get them dirty.
Shown in the photo to the left is a box of TLC plates, a large un-cut TLC sheet, and a small TLC plate which has been cut to a convenient size. Plates will usually be cut and ready for you when you come to lab.
薄层色谱点样
薄层色谱点样
薄层色谱点样是薄层色谱法中的重要步骤，以下是其基本步骤：
1.点样：将样品溶液点在薄层板的一端距底边2cm处，同时点上随行标准。
点样时，每次吸取1～2μl的样品溶液，用毛细管或微量注射器点样。
点样斑点要集中、细小、圆整，每次点样时，斑点不能重叠，各次点样时所用的毛细管或微量注射器不能混用。
2.展开：将点好样的薄层板放入展开缸中，固定好。
如果展开缸不能密闭，可将展开缸的盖子取下，薄层板放好后，在盖上盖子。
3.晾干：将展开后的薄层板取出，放在晾干架上晾干。
4.显色：晾干后，将薄层板放入显色缸中显色。
如果显色缸不能密闭，可将显色缸的盖子取下，薄层板放好后，在盖上盖子。
以上信息仅供参考。
薄层色谱点样方法
薄层色谱点样方法薄层色谱（thin layer chromatography, TLC）是一种分离和分析混合物中化合物的常用方法。
它相对简单、快速、灵敏且经济实惠，因此在化学实验室中广泛应用。
薄层色谱的原理是根据物质在固定相（薄层）和流动相之间的相互作用不同而进行分离。
在进行薄层色谱时，首先需要准备一张薄层板，通常为玻璃、铝或硅胶薄片，上面涂有一层固定相，如硅胶或氧化铝。
然后，将待分离的化合物样品溶解在合适的溶剂中，称为样品溶液。
接下来，将薄层板浸入样品溶液中，使固定相完全湿润。
然后，将薄层板拿出并迅速放置到一个密封的盒子中，使其干燥形成薄层。
点样方法是薄层色谱中常用的一种方法。
它适用于待分析物质数量较少的情况。
在点样方法中，可以使用微量管、试管或取样针等工具，从样品溶液中取出一小部分待分析物质，然后将其点在薄层板上。
待薄层板上的样品点干燥后，可以将薄层板放入色谱槽中，加入流动相（溶剂），然后以恒定速度让流动相上升或水平流动。
流动相通过薄层板上的样品点时，不同成分根据它们与固定相之间的相互作用力的不同而被分离。
最终，通过观察色谱板上斑点的迁移距离和颜色可以推断化合物的性质和纯度。
点样方法的优点是快速简便，对样品消耗较少，适用于少量样品的分析。
但是，它的缺点是对于待分离物质的选取有一定的局限性，分离效果可能不如扩展点样法和连续点样法等方法好。
总结起来，薄层色谱点样方法是一种简单、快速和经济实惠的分析方法。
它适用于待分析物质数量较少的情况。
在点样方法中，通过将待分析物质点在薄层板上，并通过流动相的上升或水平流动将其分离。
这种方法在化学实验室中广泛应用，并为化学分析提供了有力的工具。
薄层色谱技巧
薄层色谱技巧（点板子）展开剂的选择一种简单的办法是根据你产物的溶解性选择一种极性最强的溶剂学（如醇类，乙氰等），再根据你实际展开的情况慢慢加入极性弱的溶剂（如四氯化碳、石油醚、二氯甲烷等）调节体系的极性。
以得到最好的展开效果。
把我的祖传秘方告诉你吧PE(60-90)EtAc/PE=1:2EtAc/PE/AcOH=15:5:1EtAc/AcOH/n-Butanol/H2O=2:1:1:18年来我用这四种体系,没有出现过什么问题我一直在用的是乙酸乙酯：环已烷，不断调节比例，直到有满意的Rf值，有拖尾时可能要加酸或碱，我一般乙酸和三乙胺。
我用了好几年了，都还好。
不妨一试！氨基酸都有专用的展开剂，常用丁醇和水，再加酸碱选择展开剂一般要用混合溶剂：一般要有一种对所要展开样品溶解度较大的溶剂，视样品的极性，再选用相应的体系。
极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统极性较大的用甲醇：氯仿系统极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸(应该交好)甲醇：氯仿对于胺类比较好我常用的展开剂有：氯仿/甲醇；环已烷/丙酮；醋酸乙酯/石油醚；甲醇/吡啶/水；等.本人用过的展开系统中，苯-丙酮用的最多，通过调节不同比例可以得到较好的效果俺的：EtOAc/HexanesCh2Cl2（EtOAc）/MeOH， 0-1% TEA or NH3极性乙酸乙酯和非极性的石油醚按不同比例混合对一般的都能适应人民卫生出版社的《分析化学》（下册）有专门的介绍，很详细。
我一般用乙酸乙酯和石油醚配成不同比例的混合溶剂。
实验时调整至Rf=0.3--------0.5我们做的氨基酸,用的都是丁醇:醋酸:水二氯甲烷：甲醇，调节不同的配比基本解决大多数问题. 用二氯甲烷与甲醇体系非常有用，只要调整好比例。
展开剂的使用一看自己的喜爱；二看产品特点。
我多用氯仿/甲醇或石油醚/乙酸乙酯！主要是调节比例！掌握了几种展开剂的比例和极性，处理起来就容易多了！用乙酸乙酯/正己烷，必要时加醋酸或三乙胺。
薄层色谱法PPT参考课件
②点样 除另有规定外，在洁净干燥的环境下，用点样用的微
升毛细管（或其他符合要求的点样工具）点样与薄层板 上。一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线与底边的 距离，视所用板的大小而定，如采用长度为10cm的板， 点样距离底边以10-15mm为宜，高效板一般8-10mm。 圆点状点样直径一般不大于4mm，高效板不大于2mm。 如样品容量较大，或为了改善分离度，也可点成的条带 状，条带状宽度一般为5-10mm，高效板条带宽度一般 为4-8mm。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不 干扰为宜。点样时须注意尽量不要损害薄层表面。一般 的自制硅胶G薄层板，板面的牢度不够，定量测定时需特 别注意小心点样，不要使原点部分的板面破损。
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③展开 点样后的薄层板置入加有展开剂的薄层展开箱中，密闭，一般采用上行展
开，薄层板浸入展开剂深度一般要求溶剂最初的前沿距原点约5mm，展开至规 定展开距后立即将薄层权取出，晾干，以备检测。展开距离为8-15cm为宜，高 效板5-8cm为宜。
如规定需用展开剂或其他溶剂的蒸气预平衡者可在双槽展开箱的一侧加入 适量的溶剂，密闭，一般保持15-30分钟。溶剂蒸汽预平衡后，应迅速放入载有 供品的薄层板，立即密闭。如需达到饱和状态，可在展开箱内壁贴一被溶剂湿 润的滤纸使展开箱易于被蒸气平衡。如规定薄层板需要同时预平衡者，应将薄 层板放入箱内没有溶剂的一侧槽中，平衡后再将溶剂倾入此糟中展开（如图）。
365nm紫外光检视例图
254nm紫外光检视例图 15
⑥薄层色谱扫描仪
系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧 光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定 量的分析仪器。 薄层扫描仪不仅可以进行原位定量，薄层扫描全图谱对定性鉴别也能提 供有用的信息。
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（二）溶剂 不同溶剂具有不同的结构性质， 不同溶剂具有不同的结构性质，依极性大小 各种溶剂的洗脱能力各不相同。 各种溶剂的洗脱能力各不相同。 一般所选溶剂要求： 一般所选溶剂要求： a.纯度合格 纯度合格 b.黏度要小，易与样品中各组分相分离 黏度要小， 黏度要小 c.与所欲分离样品和吸附剂不起化学反应 与所欲分离样品和吸附剂不起化学反应
吸附层析（ 吸附层析（Absorption Chromatography): 指混合物组分随流动相经过由吸附剂组成 的固定相时， 的固定相时，由于吸附剂对不同物质的吸 附能力的不同以及各组分在流动相中的溶 解度不同而加以分离的方法。 解度不同而加以分离的方法。
二、薄层层析（Thin-layer 薄层层析（ chromatography,TLC)
聚酰胺是—类化学纤维原料， 聚酰胺是 类化学纤维原料，即锦纶 类化学纤维原料 (又称尼龙 。由己二酸与己二胺聚合 又称尼龙)。 又称尼龙 而成的称锦纶66 而成的称锦纶 。
因为在这类物质分子中都含有大量酰胺 基团，故统称聚酰胺。 基团，故统称聚酰胺。
聚酰胺对很多极性物质有吸附作用， 聚酰胺对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰 胺的一C＝ 及 胺的一 ＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢 基能与被分离物质之间形成氢 如酚类(包括黄酮类 鞣质等)和酸类 包括黄酮类、 和酸类<如核苷 键。如酚类 包括黄酮类、鞣质等 和酸类 如核苷 酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢 氨基酸等 是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢 键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形 成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱， 成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定 吸附能力的差异。在层析过程中， 吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被 分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择 分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。 适当的展层溶剂， 适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺 表面之间的分配系数能有较大差异， 表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与 解吸的展层过程，可以一一分离. 解吸的展层过程，可以一一分离
DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
检验系生化教研室 李莉
一、吸附层析的概念及原理
吸附：一种物质被聚集在另一种物质表面， 吸附：一种物质被聚集在另一种物质表面， 这种现象是吸附。 这种现象是吸附。 吸附剂： 吸附剂：凡是能够将其他物质聚集到本身 分子表面的物质称为吸附剂，如氧化铝、 分子表面的物质称为吸附剂，如氧化铝、 硅胶等。 硅胶等。 被吸附物： 被吸附物：聚集在吸附剂表面的分子就称 为被吸附物。 为被吸附物。
Procedure for TLC
1. Prepare the developing container. The developing container for TLC can be a specially designed chamber, a jar with a lid, or a beaker with a watch glass on the top:
Handle the plates carefully so that you do not disturb the coating of adsorbent or get them dirty.
Shown in the photo to the left is a box of TLC plates, a large un-cut TLC sheet, and a small TLC plate which has been cut to a convenient size. Plates will usually be cut and ready for you when you come to lab.
溶剂选择考虑因素： 溶剂选择考虑因素： 1、溶剂与吸附剂之间的相互作用力 、 2、溶剂与样品之间的作用因素 、 溶剂的选择可通过实验来确定。 溶剂的选择可通过实验来确定。
（三）薄层层析的操作 1、点样 、 样品最好溶解在挥发性的溶剂中，如氯仿、 样品最好溶解在挥发性的溶剂中，如氯仿、 丙酮等，避免用水每次点少量样品， 丙酮等，避免用水每次点少量样品，可在 溶剂挥发后反复进行至点完为止。 溶剂挥发后反复进行至点完为止。 样品原点直径＜ 样品原点直径＜3mm
三、薄层层析的应用
（一）定性分析：将已知化合物作为标准品 定性分析： 与样品一起进行层析后对照， 与样品一起进行层析后对照，可初步确定 未知化合物的组成。 未知化合物的组成。 定量分析：可直接在薄板上测定， （二）定量分析：可直接在薄板上测定，无 须破坏薄层； 须破坏薄层； 用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱， 用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱， 再用其他方法测定。 再用其他方法测定。
3. Spot the TLC plate
add a few drops of solvent . . .
. . . swirl until dissolved
dip the microcap into solution - the arrow points to the microcap, it is tiny and hard to see
make sure it is filled - hold it up to the light if necessary
touch the filled microcap to TLC plate to spot it - make sure you watch to see that all the liquid has drained from the microcap
吸附剂的吸附能力常称为活度， 吸附剂的吸附能力常称为活度，用罗马字 表示。 母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表示。 活度 减少 含水量 增大
2、常用吸附剂 、 极性： 极性：氧化铝 硅胶 非极性： 非极性：纤维素 聚酰胺： 合成 己二酸、 合成： 聚酰胺：a.合成：己二酸、己二胺 b.特点：氢键吸附剂 特点： 特点
DNS-C1在pH过高时，水解产生 在 过高时 过高时， 副产物DNS-OH，即： 副产物 ，
过量时， 在DNS-C1过量时，会产生 过量时 会产生DNS—NH2，即： ，
DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光， 氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光， 氨产生蓝色荧光，可 和 彼此区分开。 彼此区分开。
（三）临床生化上的应用 1.氨基酸的分离 氨基酸的分离 2.核苷、核苷酸和核酸的分析 核苷、 核苷
DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析 氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
二甲氨基萘磺酰氯 （1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl chloride）简称 ）简称DNS-Cl，可与氨基酸的游离 ， 氨基结合成DNS-氨基酸，形成的 氨基酸， 氨基结合成 氨基酸 形成的DNS-氨基 氨基 酸在紫外线（ 酸在紫外线（260nm或365nm）照射下发出 或 ） 强烈的黄色荧光，因此可用荧光检测DNS强烈的黄色荧光，因此可用荧光检测 氨基酸的存在。反应过程如下： 氨基酸的存在。反应过程如下：
Cover the beaker with a watch glass, swirl it gently, and allow it to stand while you prepare your TLC plate.
2. Prepare the TLC plate.
TLC plates used in the organic chem teaching labs are purchased as 5 cm x 20 cm sheets. Each large sheet is cut horizontally into plates which are 5 cm tall by various widths; the more samples you plan to run on a plate, the wider it needs to be.
Pour solvent into the beaker to a depth of just less than 0.5 cm.
To aid in the saturation of the TLC chamber with solvent vapors, line part of the inside of the beaker with filter paper
It's kind of hard to see the pencil line in the above photos, so here is a close-up of how the plate looks after the line has been drawn.
Under the line, mark lightly the name of the samples you will spot on the plate, or mark numbers for time points. Leave enough space between the samples so that they do not run together, about 4 samples on a 5 cm wide plate is advised. Use a pencil and do not press down so hard that you disturb the surface of the plate. A close-up of a plate labeled "1 2 3" is shown to the right.
薄层层析法是在平滑的玻璃板上或在聚脂 薄膜上， 薄膜上，将吸附剂铺在上面成薄层作为固 定相，以溶剂作为流动相， 定相，以溶剂作为流动相，把样品中各组 分分离。 分分离。 分离原理：吸附层析、 分离原理：吸附层析、分配层析和离子交换 层析。 层析。