酶的分离纯化第四节 沉淀法
第四章酶工程酶的提取与分离纯化ppt课件
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
酶的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
4.12第四章酶的分离纯化
超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对 分子质量的测定等。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增 大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分 子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的 水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙 醇、甲醇等 。
2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、 不同密度的物质分离的技术过程。
4.4 酶的分离方法
1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 5、电泳分离 6、萃取分离
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀 法
胆固醇浆液分析 牛奶灭菌后H2O2的 清除
1、细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
参见动画
高 压 细 胞 破 碎 机
超 声 波 细 胞 粉 碎 机
4沉淀法
（ 3 ）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋
PH＜PI，带正电荷， 又有水膜，是稳定的 亲水胶体
在等电点状态的 酶蛋白，水膜未脱， 是不稳定的亲水胶体
PH＞PI，带负电荷， 又有水膜是稳定的 亲水胶体
+ + +
+
+
+ + + +
H
+
+
_
+ +
_
_
OHH+
+
+ +
OH-
_
+
_ _ _ _ _ _ _ _
柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子
盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂
（1） 价廉 ； （2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；
（3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，
4.3盐析
Salt induced precipitation
1.概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶） 等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生 沉淀的过程。 盐析是可逆的
早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离 蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分 级中使用，得到了比较满意的结果。
7.盐析注意事项
选择适宜饱和度 采用分步盐析 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH 用磷酸
缓冲液 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应 该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶 解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。 盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放臵一段时间。 为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢， 一般可用超滤
生物分离工程4沉淀法
第四章沉淀法在分离制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。
沉淀：流体中分散悬浮的固体或液体，在重力、离心力、静电力等各种力场内，将粒子互相或自流体分离的作业。
例：澄清(clarification)、稠化(thickening)、类析(classification)、浮选(floatation)、重液分离(heavy liquid separation)、集尘(dust collection)。
其中使用离心力场的特称为离心分离。
一、沉淀的类型沉淀按其物理性质不同，可粗略分成两类：晶形沉淀和无定形沉淀 ( 又称非晶形沉淀或胶状沉淀 ) 。
晶形沉淀如：BaSO4，MgNH4PO4， CaC2O4·2H2O ， PbSO4其颗粒直径约0.1 ～ 1 μ m 。
非晶形沉淀： Fe2O3·nH2O ， ZnS ，Al2O3·nH2O[Al(OH)3] 其颗粒直径一般 <0.02 μ m 。
晶形沉淀：内部排列较规则，结构紧密，整个沉淀所占体积较小，易沉降于容器底部。
无定形沉淀，由许多疏松聚集在一起的微小沉淀颗粒组成，排列杂乱无章，有时又包含大量数目的 H2O ，所以是疏松的絮状沉淀。
介于晶形沉淀与无定形沉淀之间的为凝乳状沉淀，颗粒大小 0.1>d>0.02 μ m ，如 AgCl 。
二、沉淀的形成沉淀的形成一般经过晶核形成和晶核长大两个过程。
将沉淀剂加入试液中，当形成沉淀的离子浓度乘积大于其 KSP ，离子通过静电引力结合成一定数目的离子群，即为晶核。
晶核形成后，构晶离子向晶核表面沉积，晶核就逐渐长大成微粒。
聚集速度 V ：由离子聚集成晶核，再进一步积集成沉淀颗粒的速度。
定向速度 V ′：在聚集的同时，构晶离子又按一定晶格排列，这种定向排列速度。
若聚集速度 V 大，而定向排列速度 V ′小，即离子很快聚集来生成沉淀微粒，却来不及进行晶格排列，则得到的是非晶形沉淀。
酶的分离纯化
超声波破碎法
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂
酶促破碎法
自溶法 加酶处理
G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充
分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。
2、按膜孔径或截留物质的大小：
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
膜
孔
径大
小
灰尘 细菌
膜
病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子
生物小分子 盐类 水
微滤（MF）
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子
选择性热变性法、选择性酸碱变性法、 选择性表面变性法
亲和层析、亲和电泳
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法 1、原理： 2、硫酸铵盐析的优点
优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
(25℃)
当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加 入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐 浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。
4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素
（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目 标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实 验确定。
（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
生物分离工程第四章沉淀分离法
3、特点
• 沉淀效果很好； • 选择性好 • 容易使生物分子变性 • 复合物难分解
• 丙酮（浓度40-50%） ：沉析作用更强，用量省，但毒 性大，应用范围不广；
• 特点：
– 介电常数小， 60%乙醇的介电常数是48
– 容易获取
40-50%丙酮的介电常数是22
4.有机溶剂沉淀的特点
• 分辨率高； • 溶剂容易分离，并可回收使用； • 产品洁净（有机溶剂易祛除）； • 容易使蛋白质等生物大分子变性失活； • 应注意在低温下操作； • 成本高
沉淀法分离蛋白质的特点有：
1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10～50 倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用；
2 使中间产物保持在一个中性温和的环境；
3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中 分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色 谱分离使用的限制因素降到最低。
（七）选择性变性沉淀法
• 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂质蛋白 变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方 法就称为选择性变性沉淀法
• 在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂 质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全 面的了解。
使用时需慎重！！！！
选择性变性的方法
• 选择性热变性：对于α-淀粉酶等热稳定性好 的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂 蛋白受热变性沉淀而被除去。
酶的分离纯化
第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。
一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1. 防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。
一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。
常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。
二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1. 细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。
2. 抽提3. 纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
1. 机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。
物理破碎法包括如下几种方法；1. 温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。
即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。
酶工程4-1--3 酶的提取与分离提纯 酶的提取与分离提纯
用于提取在稀碱溶液中溶解度大 且稳定性较好的酶
用于提取那些与脂质结合牢固或 含有较多非极性基团的酶
有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂
主要影响因素
扩散的影响：
酶分子的扩散速度与温度、溶液黏度、扩散面积、扩散距离以及两相 界面的浓度差有密切关系。提高温度、降低溶液黏度、增加扩散面积、缩 短扩散距离, 增大浓度差等都有利于提高酶分子扩散速度, 从而增大提取效 果。 含酶原料的颗粒体积越小,则扩散面积越大,有利于提高扩散速度;适当的搅 拌可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面,从而增大两相界面的浓 度差,有利于提高扩散速率;适当延长提取时间,可以使更多的酶溶解出来,直 至达到平衡。
2. 酸溶液提取
3. 碱溶液提取 4. 有机溶剂提取
表4-2 酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 使用的溶剂或溶液 0.02～0.5mol/L的盐溶液 提取对象 用于提取在低浓度盐溶液中溶解 度较大的酶 用于提取在稀酸溶液中溶解度大, 且稳定性较好的酶
酸溶液提取
碱溶液提取
pH值为2～6的水溶液
pH值为8～12的水溶液
指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值。
饱和度＝
溶液中饱和硫酸铵的体积
溶液的总体积
3) 调整盐浓度的方式
a.
饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）
适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又 不太高时。
配制饱和硫酸铵溶液
在水中加入过量的固体硫酸铵, 加热至50～60℃, 保 温数分钟 , 趁热滤去过量未溶解的硫酸铵 , 滤液在0℃ 或 25℃平衡1～2 天, 有固体析出, 此溶液即为饱和硫酸铵溶 液, 其饱和度为1。
利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同, 通过添加 一定量的某种有机溶剂, 使酶或杂质沉淀析出, 从而使酶 与杂质分离 在酶液中加入某些物质, 使它与酶形成复合物而沉淀下来, 从而使酶与杂质分离
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注意：PEG难于从酶分子中除去，采用一
般的透析和分子筛效果都不理想，但残 留的少量PEG对酶无害，盐析、离子交换、 亲和层析、凝胶过滤可在不除去PEG的情 况下进行。
有 机 溶 剂 中 的 蛋
7 复合物沉淀法
指在酶液中加入某些物质，与酶形成复合物而 沉淀下来，再用适当方法将酶从复合物中重新析 出的方法. 7.1 丹宁沉淀 丙酮/乙醇抽提除丹宁或用碳酸钠等碱性溶液处 理，使酶溶解，而单宁仍为沉淀，也可以用土温 60/80或分子量大于6000的PEG或PVP（聚乙烯氮 戊环酮）等大分子物质进行复分解反应，形成难 溶树脂状沉淀，使酶游离出来。
阴阳离子盐析效果
阴离子盐析效果
：
柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞ CH3COO-＞ Cl-＞ NO3＞SCN-
阳离子盐析效果：
NH4+ ＞
K+＞Na+ ＞高价阳离子 硫酸铵： （1） 价廉 ；（2） 溶解度大，稳定蛋白质 ； （3）水解变酸；（4）高pH 释氨，腐蚀； （5）残留产品有影响。
盐析注意事项
3、PH值
pH值在等电点时蛋白质溶解度最 小易沉淀析出。因此盐析时除个别特殊情况 外，pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附 近。由于硫酸铵有弱酸性，它的饱和溶液的 pH值低于7，如所要蛋白质遇酸易变性则应 在适当缓冲液中进行。
盐析注意事项
4、蛋白质浓度 在相同盐析条件下蛋白质浓度愈高 愈易沉淀。使用盐的饱和度的极限也愈低。如血清 球蛋白的浓度从0.5%增至3.0%时,需用中性盐的饱 和度的最低极限从29%递减至24%.某一蛋白质欲进 行两次盐析时,第1次由于浓度较稀,盐析分段范围较 宽,第2次则逐渐变窄.例如胆碱酯酶用硫酸铵盐析进 时，第1次硫酸铵饱和度为35%至60%,第2次为40% 至60%.蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利,但浓度过 高也易引起杂蛋白的共沉作用.因此,必须选择适当 浓度尽可能避免共沉作用的干扰。
第四节 沉淀法
1 概述
沉淀与结晶
形成无定型物质的过程叫沉淀，而得到 晶形物质的过程叫结晶 特点： (1) 料液体积大大降低 (2) 作为纯化前处理或最 后产物收集方法 (3) 操作简便
2 蛋白质胶体溶液的稳定性
静电斥力
吸引力
3 蛋白质盐析
机理： （1）破坏水化膜， （2）中和电荷 盐析经验式 盐溶 低盐浓度，溶解度随盐浓度增加而升 高 盐析 盐浓度达一定浓时，溶解度随盐浓度 增加而降低 饱和度 中性盐的盐析效果
硫酸铵盐析的计算公式（可直接查表）
公式：
V=V0· 2-S1/1-S2 S
V、V0饱和硫酸铵体积及原溶液体积 S2、S1所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液硫酸 铵饱和度 加入固体硫酸铵的计算公式： W=B（S2-S1）/1-AS2 W：将1LS1饱和度溶液提升到S2，所需的硫酸 铵克数 A、B 常数，与温度有关，0℃，A 0.27，B 707； 20℃， A 0.29，B 756
盐析注意事项
5、温度
由于浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析
操作一般可在室温下进行。至于某些对热特 别敏感的酶，则宜维持低温条件。通常蛋白 质盐析时对温度要求不太严格。但在中性盐 中结晶纯化时，温度影响则比较明显。
盐析注意事项
6、脱盐
蛋白质用盐析法分离沉淀后，常需脱盐才能
获得纯品。脱盐方法最常用的是透析法。透 析法所需时间较长，常在低温下进行并加入 防腐剂避免微生物污染。透析使用前必须处 理，方法是将透析袋置于0.5mol/LEDTA溶液 中煮0.5h,弃去溶液,用蒸镏水洗净,置50%甘 油中保存备用。
7 复合物沉淀法
7.2 聚丙烯酸沉淀
主要用来沉淀带正电蛋白质。（低酸条件） pH6以上，酶与聚丙烯酸分离，Ca2+、 Mg2+、Al3+ 与聚丙烯酸形成沉淀（可用2N 硫酸处理回收）
8 有机聚合物沉淀
指一些水溶性有机高聚物，一般采用相
对分子质量为6000或20000的PEG
机理：类似有机溶剂
6 有机溶剂沉淀法
机理 库仑定律：F=Q1Q2/εr2 a 溶液介电常数降低，分子间引力增大 b 破坏水膜，使Pr溶解度降低 c 破坏氢键等副键，空间结构破坏，疏水基团暴 露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层， 操作事项： 有可能引起变性，常采用乙醇或丙酮，用量为酶 体积的两倍左右，终浓度约70%，但不同溶剂最适 浓度不同，丙酮60%-62% a 温度（低温0℃左右） b 浓度 c pH（等电点附 近） d 蛋白浓度 e 蛋白分子量 f 中性盐 具体操作根据试验确定 尽快进入下一步分离纯化
盐析注意事项
2、盐的饱和度 不同蛋白质盐析时要求盐的饱和度 不同。分离几个混合组成的蛋白质时，盐的饱和度 常由稀到浓渐次增加。每出现一种蛋白质沉淀进行 离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第 2种蛋白质沉淀。例如用硫酸铵盐析分离血浆中的 蛋白质饱和度达20%时，纤维蛋白原首先析出；饱 和增至28～33%时，优球蛋白析出；饱和度再增至 33～50%时，拟球蛋白析出；饱和度大于50%以上 时清蛋白析出。用硫酸铵不同饱和度分段盐析法， 可从牛胰酸性提取液中分离得到9种以上蛋白质及 酶。
pH值和温度的影响
β随pH
变化 （1）对数关系 （2） 等电点附近有极小值 β随温度变化 随温度升高减小 盐析注意事项：
盐析注意事项
1、确定沉淀蛋白质所需硫酸铵浓度的方法 将少量样品冷却到0～5℃，然后搅拌加入固体硫酸 铵粉末，见蛋白质产生沉淀时，离心除去沉淀，分 析上清液确定所要蛋白质的浓度，如它仍在溶液中 则弃去沉淀，再加更多的硫酸铵于上清液中，直到 产生蛋白质沉淀时止。以所要提取的蛋白质在溶液 中的浓度对硫酸铵浓度作图，得沉淀曲线，找出蛋 白质开始沉淀的浓度。如不考虑收率，饱和度区间
用盐析分离蛋白质方法
（1） Ks分段盐析：固定pH, 温度， 改变盐浓度（离子强度） （2） β 分段盐析：固定离子强度， 改变pH或温度。
硫酸铵盐析的计算公式
饱和度：溶液中饱和硫酸铵的体积与溶液 总体积之比。 例：80ml酶液加入20ml饱和硫酸铵溶液， 则混合液中的硫酸铵饱和度为20÷ （80+20）=0.2 饱和硫酸铵溶液的配制：水中加入过量固 体硫酸铵→加热50-60℃，保温数分钟→ 趁热滤去未溶硫酸铵→滤液在0 ℃或25 ℃平衡1-2天，有固体析出时，即达 100%饱和度。
5 等电点沉淀法
原理:利用两性电解质在等电点溶解度最低的原理（净 电荷为零，分子间静电斥力消除）但在等电点时，分子 表面水膜仍存在，酶等大分子物质仍有一定溶解度，需 与其它方法联合使用，单独使用主要除去等电点相距较 大的杂蛋白。
（1）适用于疏水性强的蛋白 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动， 溶解度增大 （4）价廉价，无毒 （5）蛋白对低pH敏感，易失活