高效液相色谱方法通则
通则0512高效液相色谱法
高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
《中国药典》2020版—单抗 N 糖谱测定法
单抗N 糖谱测定法
第一法亲水相互作用色谱法
本法系通过N糖苷酶F（PNGase F）对单抗N糖进行酶切、对酶切的N 糖进行标记衍生，然后用超高液相色谱法对单抗N糖谱进行测定。
照高效液相色谱法（通则0512）测定。
试剂
(1)N 糖苷酶F（PNGase F）
(2)2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记溶液: 取 350μl 二甲基亚砜（DMSO）和 150 μl 乙酸，混均。
精密称取 25 mg 2-AB 加入上述溶液中，充分溶解。
精密称取 30 mg 氰基硼氢化钠加入上述溶液中，充分溶解（可适当加热）。
(3)系统适用性对照品。
色谱条件
用酰胺基键合硅胶填充色谱柱，柱长 150mm，内径 2.1mm，粒度 1.7 μm，或等效色谱柱；柱温为 60℃，供试品保存温度为 2～8℃；以
50 mmol/L 的甲酸铵溶液（pH4.5）为流动相 A 液，以乙腈为流动相
B 液，梯度洗脱 60.0 分钟（梯度表）；荧光检测器检测，检测波长为：激发波长 330nm，发射波长 420nm，增益 10。
系统适用性对照品溶液的制备
( 1 )N糖的酶切。
2015年版《中国药典》通则0721 维生素A测定法通则
0721维生素A测定法本法是用紫外-可见分光光度法（通则0401）或高效液相色谱法（通则0512）测定维生素A 及其制剂中维生素A的含量，以单位表示,每单位相当于全反式维生素A醋酸酯0.344μg或全反式维生素A醇0.300μgo测定应在半暗室中尽快进行。
第一法（紫外-可见分光光度法）由于维生素A制剂中含有稀释用油和维生素A原料药中混有其他杂质，采用紫外-可见分光光度法测得的吸光度不是维生素A独有的吸收。
在以下规定的条件下，非维生素A物质的无关吸收所引人的误差可以用校正公式校正，以便得到正确结果。
校正公式采用三点法，除其中一点是在吸收峰波长处测得外，其他两点分别在吸收峰两侧的波长处测定，因此仪器波长应准确，在测定前，应对仪器波长进行校正。
测定法取供试品适量，精密称定，加环己烷溶解并定量稀释制成每ImI中含9〜15单位的溶液，照紫外-可见分光光度法（通则0401）,测定其吸收峰的波长，并在下表所列各波长处测定吸光度，计算各吸光度与波长328nm处吸光度的比值和波长328nm处的（E陵）值。
如果吸收峰波长在326〜329nm之间，且所测得各波长吸光度比值不超过表中规定的±0.02,可用下式计算含量：每Ig供试品中含有的维生素A的单位=（E怂）（328nm）×1900如果吸收波长在326〜329nm之间，但所测得的各波长吸光度比值超过表中规定值的±0.02,应按下式求出校正后的吸光度，然后再计算含量：4328（校正）=3.52（2A321-A3K-A340）如果在328nm处的校正吸光度与未校正吸光度相差不超过±3.0%,则不用校正，仍以未经校正的吸光度计算含量。
如果校正吸光度与未校正吸光度相差在一15%至一3%之间，则以校正吸光度计算含量。
如果校正吸光度超出未校正吸光度的一15%至一3%的范围，或者吸收峰波长不在326〜329nm 之间，则供试品须按下述方法测定。
高效液相色谱测定法标准操作规程
标准操作规程1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。
2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。
3责任：QC人员对本SOP实施负责。
4容高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
4.1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
4.1.1.色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2〜8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。
通则0512高效液相色谱法
高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
《中国药典》2020年版四部通则修订内容培训课件
且极性差异较小时，可采用等温
小时，可采用等温法。
法。
有机溶剂数量较多，且极性差异较大时，可采
有机溶剂数量较多，且极性差异
用系统程序升温法。
较大时，可采用系统程序升温法。
1、测定法第一法：流速为1.0-
2.0ml/min（一般适用于内径
为0.32mm或0.25mm类的色谱
柱。
2.【附注】有机溶剂数量不多，
调整后, 系统适用性应符合要求, 且色谱峰出峰顺序不变。若减小 进样体积, 应保证检测限和峰面 积的重复性；若增加进样体积, 应使分离度和线性关系仍满足要 求。
应评价色谱参数调整对分离和检测的 影响, 必要时对调整色谱参数后的方 法进行确认。若调整超出表 1 中规定 的范围或品种项下规定的范围, 被认 为是对方法的修改, 需要进行充分的 方法学验证 。
2.系统适用性
（1）色谱柱理论塔板数（n）
用于评价色谱柱的分离效能。由于不 同物质在同一色谱柱上的色谱行为不 同, 采用理论板数作为衡量色谱柱效 能的指标时, 应指明测定物质, 一般 为待测物质或内标物质的理论板数。
（2）分离度（R）
用于评价待测物质与被分离物质之间 的分离程度, 是衡量色谱系统分离效 能的关键指标。除另有规定外, 待测 物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离 度应大于不小于 1.5。
调整梯度洗脱色谱参数时应比调整等度洗脱色谱参数时更加谨 慎, 因为此调整可能会使某些峰位置变化, 造成峰识别错误, 或者 与其他峰合并。
当对调整色谱条件后的其测定结果产生异议时, 应以品种项下 规定的色谱条件的测定结果为准。
在品种项下一般不宜指定或推荐色谱柱的品牌, 但可规定色谱 柱的填充剂（固定相）种类（如键合相, 是否改性、封端等）、粒 径、孔径, 色谱柱的柱长或柱内径；当耐用性试验证明必须使用特 定牌号的色谱柱方能满足分离要求时, 可在该品种正文项下注明。
维生素B2片分析方法验证方案
一．概述1.维生素B2片含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)为流动相；检测波长为444nm。
理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。
1.2测定法避光操作。
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于维生素B2 10mg)，置500ml量瓶中，加盐酸溶液(1→2)10ml，振摇使维生素B2 溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素B2对照品约10mg，同法测定。
按外标法以峰面积计算，即得。
1.3本品含维生素B2计算，应为标示量的90.0% ～110.0%。
2. 维生素B2片溶出度测定：照溶出度与释放度测定法（通则0931第二法）测定法避光操作。
取本品，以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经20分钟时，取溶液10ml，滤过，取续滤液，照紫外-可分光光度法（通则0401)，在444nm的波长处测定吸光度，按C17H20N4O6的吸收系数()为323计算每片的溶出量。
限度为标示量的75%，应符合规定。
3. 维生素B2片有关物质测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
色谱条件照含量测定。
避光操作。
取本品的细粉适量（约相当于维生素B2 10mg)，置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（1→2)5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.75倍(1.5% ) ，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0% )。
2015版药典黄曲霉毒素测定法
2351 黄曲霉毒素测定法第一法1 本法系用高效液相色谱法(通则 0512)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉 毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素 G2 总量计)，除另有规定外，按下 列方法测定。
当测定结果不符合规定时，以第二法测定结果为准。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 - 乙腈 - 水(40∶18∶42)为流动相；采用柱后衍生法检测， （1）碘衍生法：衍生溶液为 0.05％的碘溶液 (取碘 0.5g， 加入甲醇 100ml 使溶解， 用水稀释至 1000ml 制成)， 衍生化泵流速每分钟 0.3ml， 衍生化温度 70℃； （2）光化学衍生法：光化学衍生器（254nm） ；以荧光检测器检测，激发 波长 λex=360nm(或 365nm)，发射波长 λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。
混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素 B1、 黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 标示浓度分别为 1.0μg／ml、0.3μg／ml、1.0μg／ml、 0.3μg／m1)0.5ml，置 10ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液 1ml， 置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备 取供试品粉末约 15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠 3g，置于均质瓶中，精密加入 70％甲醇溶液 75ml，高速搅拌 2 分钟(搅拌速度大于 11000 转／分钟)， 离心 5 分钟(离心速度 2500 转／分钟)，精密量取上清液 15ml，置 50ml 量瓶中，用水稀释至 刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，量取续滤液 20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟 3ml，用水 20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱， 收集洗脱液，置 2ml 量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
高效液相色谱仪校验规程完整
标准文件1、目的Objective：建立高效液相色谱仪内部校验规程，确保校验工作规范、顺利进行。
2、范围Scope ：本规程适用于本公司使用的高效液相色谱仪（紫外-可见光检测器/二极管阵列检测器）的校验。
3、职责Responsibilities：3.1 培训职责：本文件起草人或审核人或批准人负责对质量管理部全体人员培训。
3.2 QC：负责制定本规程，并对本规程的实施负责。
3.3 QA：负责监督和检查本规程的实施。
4、定义Definition：无。
5、程序Procedures：5.1 依据国家计量校验规程JJG 705-2002液相色谱仪，安捷伦液相说明书，岛津液相说明书。
5.2 备件及材料5.2.1水：HPLC级水。
5.2.2化学试剂：乙腈（HPLC）、丙酮（分析纯）。
5.2.3咖啡因标准品。
5.2.4咖啡因标样。
0.005 mg/ml, 0.010 mg/ml, 0.025 mg/ml,0.050 mg/ml,0.125 mg/ml和0.250 mg/ml 咖啡因水溶液。
5.2.5色谱柱：4.6mm×250mm，C18，5µm。
5.2.6 容量瓶：10ml。
5.2.7玻璃注射器。
5.2.8 限流阻尼管。
5.2.9 分析天平。
5.2.10 秒表。
5.2.11 热电偶5.3 校验项目及技术指标5.3.1泵性能的测试5.3.2柱温箱温度稳定性测试*备注：如药典专论规定的特定柱温，不在以上温度范围之内，则对分析该品种的仪器增加该温度点校验，校验项目和可接受指标相同。
5.3.3 检测器性能测试5.3.4进样器性能测试5.3.5梯度组成的测试*注：*表示该项目的内部校验取决于仪器的配置，有该配置则为必检项目。
5.4 校验方法5.4.1校验通则5.4.1.1 HPLC的内部校验由仪器所属部门经培训的使用者按本规程进行校验，其校验项目依仪器配置和使用范围而定。
5.4.1.2 政府部门每一年对HPLC进行校验，每六个月内部对HPLC进行一次校验；仪器配置的关键部件大修或更换后，可参考本规程对该部件相关的项目进行校验，以对仪器的性能进行确认。
高效液相色谱法 药典
高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注人的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1. 对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9〜4.6 mm，填充剂粒径为3〜10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm) 填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
(1) 色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提髙色谱柱的温度，但一般不宜超过60°C。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2〜8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
(2) 检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
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6.1 仪器组成 仪器主要组成见图1。
输液系统
进样系统
色谱柱系统
检测器
储液器
打印绘图机
图1 仪器组成框图
色谱工作站 (或记录仪)
6.1.1 储液器：储存流动相的容器应耐流动相的化学腐蚀、方便脱除溶解于液体的气体。 6.1.2 输液系统：输液泵及其控制系统应包括流动相组成及流量梯度的程序控制部分。接触 液体的泵体材料应耐化学腐蚀、泵流量稳定无脉冲，且有足够的精度和重复性。 6.1.3 进样系统：样品引入到色谱柱系统的装置，样品管应为可更换的定体积管。 6.1.4 色谱柱系统：包括保护(预)柱、色谱柱和柱恒温箱，并有足够的恒温精度。 6.1.5 检测器：通用的有紫外-可见光、荧光及折射率检测器。 6.1.6 色谱工作站(或记录仪)：控制色谱仪的整机操作、采集和处理色谱数据的微型计算机 系统，或为积分仪或简单的记录仪。 6.1.7 打印绘图机：打印分析数据和绘制色谱图的打印机和绘图机。 6.2 仪器性能
对同一组分，在相同的色谱条件下和线性范围内，可用外标法、内标法或叠加法进行定 量测定。 8.4.1 外标法：在相同的色谱条件下，分别测定和比较标准物质和样品待测组分的峰值。计 算试料中待测组分的含量。采用外标法，必须满足下列条件：
a)用称量法(准确至0.01mg)配制外标溶液，其组分浓度应接近试料中待测组分的含量； b)进样量应相同，且在检测器的线性范围内重复测定。 8.4.2 内标法：在已知量的样品中加入定量的标准物质，测定和比较试料中待测组分和内标 物的峰值。用相对校正因子求出样品中待测组分的百分数，采用内标法定量，必须满足下列 条件： a)内标物在样品的全处理过程中应能保持化学稳定性。其浓度应接近待测组分的含量。 b)内标物和样品中的所有组分应能完全分离。 c)进样量应在检测器的线性范围内。 8.4.3 叠加法：在相同的色谱条件下，测定试料中待测组分及其相邻组分的峰值，然后加入 一定量的待测组分于该试料中，再次测定上述两组分的峰值，用外标法计算试料中待测组分 的百分数。采用叠加法，必须满足下列条件： a)不适宜用外标法或内标法测定微量的组分。 b)进样量应在检测器的线性范围内重复测定。 8.5 测定后的检查 样品测定后，应再次测定溶剂空白，以确证色谱柱在每次进样前均已达到平衡。否则， 应再次测定标准样品的峰值，其偏差应在分析误差的允许范围内。
1 科学技术文献出版社
相关技术文件 备注
2. 高效液相色谱方法通则的摘要
本通则规定了用高效液相色谱仪测定有机化合物的一般方法，适用于具有紫外—可见 光、荧光和示差折光率检测器的高效液相色谱仪器。
3 定义
本通则等同采用GB 9008—1988 中有关液相色谱法术语部分的定义。
4 方法原理
高效液相色谱是一种以液体作流动相和固体微粒作固定相，待测组分在柱内的两相之间 进行高速分配和高效分离的柱液体色谱方法。样品溶液中的各组分，因其物理化学性质的微 小差异，当其随流动相进入色谱柱后，便在柱的两相之间产生不同的相互作用力，从而导致 柱上迁移速率的微小差异。随着流动相的连续推移，这种微小的差异被不断扩大，直至出现 明显不同的迁移速率，使最终达到组分完全分离。分离后的组分在柱的出口处依次通过色谱 检测器、检测其洗脱浓度随时间变化的输出电信号。这种电信号经放大后，可由记录仪直接 记录为组分的色谱峰，或再经模拟数字转换器将色谱峰数据变换成计算机语言，为色谱工作 站所采集和存储，然后按色谱分析的要求对各组分的色谱峰进行任选处理。
9 分析结果的表述
9.1 数据处理 利用色谱工作站或数据处理机处理色谱数据时，应根据其峰处理功能设定处理方法，对
同一样品的测定，处理方法应相同。 9.2 定量值的表示方法
根据测定方法的要求，可以用百分数(质量、体积克分子数)或体积质量数表示。 9.3 计算公式 9.3.1 外标法
Xi＝Ei×
Ai AE
≤±5×10－4AU ≤±5×10－3AU/h ≤±5×10－10g/ml
≥103
折射率检测器
≤±5×10－7RIU ≤±5×10－6RIU/h ≤±5×10－6g/ml
≥103
8.2 测定前准备 8.2.1 试料的制备：用流动相将试样稀释到适合色谱进样的浓度，试料溶液应不含有任何不 溶解的物质，必要时，可进行适当的过滤或超高速离心法除去其不溶物。 8.2.2 整机检查
仪器的主要性能及技术指标应符合JJG(教委)024—1996高效液相色谱仪计量检定规程 的技术要求。见表1。
7 样品
样品应能溶解于适当的溶剂中，试料溶液应能保持待测组分的稳定性。
8 分析步骤
8.1 开机 按仪器操作规程开机。根据样品的测定方法或特性选定色谱条件，逐步使仪器系统达到
平衡。
编号
1 2 3 4 5 6 7
项目
基线噪声 基线漂移 最小检测浓度 线性范围 泵流量稳定性 定性重复性 定量重复性
表1 主要性能及技术指标
技术指标
紫外-可见光检测器 ≤±5×10－4AU ≤±5×10－3AU/h ≤±5×10－8g/ml ≥103 RSD≤±2ω×102 RSD≤1.5ω×102 RSD≤3ω×102
荧光检测器
Wi——组分i加入量
注: 需要查阅全文, 请与出版发行单位联系.
(1)
式中 Xi——试料中待测组分i的含量
Ei——试料中标准组分i的含量
Ai——试料中待测组分i的峰值
AE——试料中标准组分i的峰值
9.3.2 内标法
Xi＝
Ms样品中待测组分i的百分数 Ms——样品中内标物的加入质量 Ai——样品中待测组分i的峰值 Fsi——样品中待测组分i与内标物的相对校正因子 M——样品的质量
仪器稳定后，检查仪器的基线噪声和基线漂移，以及色谱柱的主要性能，即柱的理论板 数(n)、两相邻谱峰的分离度(R)和色谱峰拖尾因子(T)即谱峰的不对称性(见附录A)，均应达 到分析方法规定的要求。 8.2.3 溶剂空白
在样品测定的相同色谱条件下，测定溶剂色谱峰，溶剂峰对待测组分的分离不应产生干 扰，并应在样品的测定过程中将其剔除。
×100%
(4)
式中 Xi——第i次测得的保留时间或峰值
X－——n次测得的保留时间或峰值的算术平均值
i——测量序列号 n——测量次数 9.4.2 准确度 准确度以回收率表示，回收率应在90～110(ω×102)范围内。 计算公式：
回收率＝ WR－W ×100%
(5)
Wi
式中 WR——组分i检出量
W——组分i原含量
国家教育委员会 国家教育委员会 马卿云 陈培榕 1997 年 1 月 22 日 1997 年 4 月 1 日 无
本通则规定了用高效液相色谱仪测定有机化合物的一般方法，适 用于具有紫外—可见光、荧光和示差折光率检测器的高效液相色谱仪 器。 1. 定义 2. 方法原理 3. 试剂和材料 4. 仪器 5. 样品 6. 分析步骤 7. 分析结果的表述 无
As——内标物的峰值
9.3.3 叠加法
Xi＝
Mi×Ai×A′j M(A′i Aj－AiA′j )
×100
(3)
式中 Xi——试料中待测组分i的百分数 Mi——试料中加入(或第二次加入)待测组分i的质量 Ai——试料中未加(或第一次加入)待测组分i的峰值
A′j ——试料中加入(或第二次加入)待测组分i的Mi质量后，其相邻组分j的峰值 M——试料的质量
A′i——试样中加入(或第二次加入)待测组分i的Mi质量后，组分i的峰值 Aj——试样中未加(或第一次加入)待测组分i前，相邻组分j的峰值
9.4 方法误差
9.4.1 重复性(定性或定量)
同一样品应连续测定8次，计算其相对标准偏差(RSD)。
计算公式：
n
RAS＝∑ i =1
(Xi－X－
)2/
(n－1)×―-X1
MV_RR_CNJ_0024 高效液相色谱方法通则
1. 高效液相色谱方法通则的说明
编号 名称
归口单位 起草单位 主要起草人 批准日期 实施日期 替代规程号 适用范围
主要技术要求
是否分级 检定周期(年) 附录数目 出版单位 检定用标准物质
JY/T 024—1996
(中文) 高效液相色谱方法通则
(英文) General rules for high performance liquid chromatography
在一定的色谱条件下，组分最大浓度点的洗脱时间(柱保留时间)是一定的，可作为色谱 法组分定性的依据，而组分的洗脱浓度即正比于色谱峰的峰高或峰面积，这是色谱法定量分 析的依据。
5 试剂和材料
5.1 色谱柱(固定相) 待测组分与相邻组分之间的色谱分离度(R)应不小于1.0。
5.2 流动相(洗脱液) 5.2.1 有机溶剂： 高效液相色谱(HPLC)纯试剂，或在满足样品测定的条件下，用其它等 级的试剂。使用前应通过0.5μm的滤膜过滤和脱除溶解的气体。 5.2.2 水：高效液相色谱(HPLC)纯水，或实验室自制并预先经过吸附法除去痕量有机杂质 的脱离子高纯水，使用前应经过0.45μm的滤膜过滤和脱除溶解的气体。 5.2.3 无机试剂：无机酸、碱、盐为分析纯试剂；离子对试剂为HPLC纯专用试剂。 5.3 标准样品 5.3.1 标准物质：经国家或部门许可生产的标准物质或标准溶液。 5.3.2 标准溶液：可以直接使用标准物质部门提供的标准浓度的溶液，或按需要稀释成适用 于校正浓度的标准储备液。
8.2.4 进样 进样量应适宜检测器的线性范围，并能满足待测组分两相邻谱峰的分离度及其定性定量
重复性的要求。 8.3 定性分析
在相同的色谱条件下，分别测定标准物质(或对照物)和样品中待测组分谱峰的保留时 间，若样品中的全部组分已经确定且达到了完全的分离，组分的保留时间可作为定性的依据。 8.4 定量分析